专利名称：：一种分析水稻抗稻瘟病基因的方法
技术领域：
：本发明涉及用稻瘟病菌近等菌株进行抗稻瘟病基因分析的一种方法，属植物保护领域。
背景技术：
：水稻稻瘟病是一种世界性的病害，多年的实践证明培育和种植抗病品种是控制这一病害最安全、经济、有效的防治措施。但水稻稻瘟病菌是一个较易于发生变异的病原群体，常使一个新推广的品种在种植35年后便丧失抗性。为了稳产高产，育种家不得不利用新的抗病基因或采用基因组合来选育新的抗病品种，因此，准确可靠的抗稻瘟病基因分析对水稻抗病育种具有重要意义。到目前为止，人们大约鉴定了40多个抗稻瘟病基因。然而，这些抗病基因是由不同的实验室，不同年份、不同地点，采用不同菌株鉴定出来的。由于稻瘟病抗性鉴定对发病条件要求严格，只有当接种的苗龄、生长势、所用菌辟的壞传背景，接种时的温度、湿度，所用的孢子尊等等都一致的条件下，所获得的接种结果才可靠。目前，各个实验室采用的菌株不同，各菌株的遗传背景不一致，且在不同的接种条件下接种，所获得的结果可比性较差。即各实验室依据水稻分离世代抗性表现而推导出的抗病基因没有可比性，可能将不同抗病基因定名为相同的基因，将相同的基因定名为不同基因。为了证明各个基因实体间的真正关系，进行抗病基因克隆和功能分析，则需要做大量的测交和等位性分析。这是一件非常繁重的工作，且将不同的抗病基因间的关系都分析清楚是难以实现的。
发明内容本发明的主要目的是克服现有方法的不足，提供了一种准确、高效、简便、快速的抗稻瘟病基因分析的方法，为稻瘟病抗病育种及抗病基因克隆和功能分析奠定基础。本方法的技术方案1利用一个对含有30多个抗病基因的水稻近等基因系，包括普遍认为没有抗病基因的丽江新团黑谷在内的所有品系，均不能致病的菌株CY2，采用农杆菌介导的方法，获得大量转化子；2将获得的转化子接种到己知抗病基因的水稻近等基因系上，从感病型病斑上获得单孢菌株，回接到近等基因系上，确认致病性，得到了35个致病性发生了变异的菌株；3在育苗盘中分穴播种待测的水稻品种，并用丽江新团黑谷作为感病对照，用常规方法进行管理，待秧苗长到3叶1心时备用；4分别将35个菌株在燕麦培养基上培养，产孢后制备孢子悬浮液；5将制备好的孢子悬浮液分别接种到待测的秧苗上，接种浓度，接种方法同常规;6在25-28'C下保湿7天后，按常规方法观察记载病情，确定抗感反应型，推导待测品种的基因型。水稻稻瘟病菌与水稻是一个基因对基因关系的病害系统。水稻抗病基因与稻瘟病菌无毒基因的鉴定与推导是一种相互依存的关系。即利用稻瘟病菌株的致病类型推导水稻品种的抗病基因组成，利用水稻的抗病基因推导菌株的无毒基因或致病基因组成。基于这一理论基础，就可人为的构建一套稻瘟病菌近等菌株进行抗性基因推导工作。如果利用一个遗传背景完全一致的菌株，筛选不同致病性的突变体，构建近等菌株，则可以实现不用做水稻杂交和接种杂交后代抗病性，也不用通过等位性测验，便可以通过直接利用突变体接种稳定的品种，依据抗病类型，了解品种的抗性基因组成。我们得到的35个致病性发生变芽的菌株有的在一个位点上发生了变异，有的在多个位点上发生了变异，各菌株致病类型构成了一个致病型矩阵。因此，利用这套致病基因近等菌株不仅可用于含单个抗病基因水种品种的抗病基因推导，也可用于含多个抗病基因水稻品种的推导。特别是这套菌株的应用，可改变过去通过水稻杂交、测交分析抗病基因的传统方法，使鉴定抗病基因的结果更加准确、可靠，所得到的结果具有广适性，避免不同实验室接种的结果不一致的情况出现；利用这套菌株还可以发现新的抗病基因。具体实施例方式下面用实施例子来进一歩详述本发明。品种抗性采用苗瘟鉴定法按常规方式进行。实施例一l采用农杆菌介导的方法，转化广泛无致病力的菌株获CY2，得到大量转化子；2将获得的转化子接种到已知抗病基因的水稻近等基因系上，从感病型病斑上获得单孢菌株，回接到近等基因系上，确认致病性，得到了3个致病性发生了变异的菌株Tl(Vir/^'-ta)，T2(Vir尸/-和T3(Vir/^'-a);3在育苗盘中分穴播种待测的水稻品种和3个相应的已知抗病基因的近等基因系(A，B，C)，并用丽江新团黑谷作为感病对照，用常规方法进行管理，待秧苗长到3叶1心时备用；4分别将3个菌株和野生型菌株CY2在燕麦培养基上培养，产孢后制备孢子悬浮液；5将制备好的孢子悬浮液分别接种到待测的秧苗上，接种浓度，接种方法同常规;6在25-28'C下保湿7天后，按常规方法观察记载病情，确定抗感反应型，推导待测品种的基因型。表l接种结果表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>-从上表的接种结果可以看出，待测品种的基因型为-尸/-"。实施例二l采用农杆菌介导的方法，转化广泛无致病力的菌株获CY2，得到大量转化子；2将获得的转化子接种到已知抗病基因的水稻近等基因系上，从感病型病斑上获得单孢菌株，回接到近等基因系上，确认致病性，得到了4个致病性发生了变异的菌株Tl(Vir/^'-5，尸卜乃，T2(Vir尸y—乃，T3(Vir,卜5,尸卜幼，T4(VirA'—7,户y-7i)。3在育苗盘中分穴播种待测的水稻品种和4个相应的已知抗病基因的近等基因系，并用丽江新团黑谷作为感病对照，用常规方法进行管理，待秧苗长到3叶1心时备用；4分别将4个菌株和野生型菌株CY2在燕麦培养基上培养，产孢后制备孢子悬浮液；5将制备好的孢子悬浮液分别接种到待测的秧苗上，接种浓度，接种方法同常规;6在25-28"C下保湿7天后，按常规方法观察记载病情，确定抗感反应型，推导待测品种的基因型。表2接种结果表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>从上表的接种结果可以看出，待测品种的基因型和B相同，为Pi-7(r)。实施例三l采用农杆菌介导的方法，转化广泛无致病力的菌株获CY2，得到大量转化子；2将获得的转化子接种到已知抗病基因的水稻近等基因系上，从感病型病斑上获得单孢菌株，回接到相应的品系上，确认致病性，得到了8个致病性发生了变异的菌株<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>3在育苗盘中分穴播种待测的水稻品种和8个相应的已知抗病基因的近等基因系，并用丽江新团黑谷作为感病对照，用常规方法进行管理，待秧苗长到3叶1心时备用；4分别将8个菌辨和野生型菌株CYS在燕麦培养基上培养，产孢后制备孢子悬浮液；5将制备好的孢子悬浮液分别接种到待测的秧苗上，接种浓度，接种方法同常规；6保温保湿7天后，按常规方法观察记载病情，确定抗感反应型，推导待测品种的基因型。表3接种结果表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>从上表的接种结果可以看出，待测品种的基因型和B相同，为A-厶实施例四l采用农杆菌介导的方法，转化广泛无致病力的菌株获CY2，得到大量转化子；2将获得的转化子接种到己知抗病基因的水稻近等基因系上，从感病型病斑上获得单孢菌株，回接到相应的品系上，确认致病性，得到了5个致病性发生了变异的菌株Tl(Vir尸i-￡)，T2(VirA-A力，A.-》，T3(Vir尸i-》，T4(Vir/7/-/)，T5(Vir尸/-A'，Vir,i-/)。3在育苗盘中分穴播种待测的水稻品种和5个相应的已知抗病基因的近等基因系，并用丽江新团黑谷作为感病对照，用常规方法进行管理，待秧苗长到3叶1心时备用；4分别将5个菌株和野生型菌株CY2在燕麦培养基上培养，产孢后制备孢子悬浮液；5将制备好的孢子悬浮液分别接种到待测的秧苗上，接种浓度，接种方法同常规；6保温保湿7天后，按常规方法观察记载病情，确定抗感反应型，推导待测品种的基因型。..表4接种结果表品种和抗病基因菌株和致病基因a(/^.-/)bcz)d/)e(尸j'-a')x(待测)原始菌CY2RRRRRRTl(Vir,H')SRRRRRT2(Vir尸y-/,尸i-2)RSSRRST3(Vir尸卜》RRSRRST4(VW-/)RRRSRRT5(Vir/V-尸W)RRRSSR从上表的接种结果可以看出，待测品种的基因型为尸i-Z。权利要求1、一种分析水稻抗稻瘟病基因的方法，其步骤为1)利用一个对含有30个抗病基因的水稻近等基因系，包括普遍认为没有抗病基因的丽江新团黑谷在内的所有品系，均不能致病的菌株CY2，采用农杆菌介导的方法，获得大量转化子；2)将获得的转化子接种到已知抗病基因的水稻近等基因系上，从感病型病斑上获得单孢菌株，回接到相应的品系上，确认致病性，得到了35个致病性发生了变异的菌株；3)在育苗盘中分穴播种待测的水稻品种，并用丽江新团黑谷作为感病对照，用常规方法进行管理，待秧苗长到3叶1心时备用；4)分别将35个菌株在燕麦培养基上培养，产孢后制备孢子悬浮液；5)将制备好的孢子悬浮液分别接种到待测的秧苗上，接种浓度，接种方法同常规；6)保温保湿7天后，按常规方法观察记载病情，确定抗感反应型，推导待测品种的基因型。全文摘要本发明涉及一种分析水稻抗稻瘟病基因的方法。本发明的技术方案是1)寻找一个性状稳定，广泛无致病力的菌株；2)利用农杆菌介导的方法转化该菌株，将获得的转化子接种到水稻近等基因系上，从感病型病斑上获得致病性发生变异的单孢菌株；3)回复接种，鉴定并确认该套单孢菌株的致病性，获得一套近等菌系，用于品种的抗病基因鉴定。本发明的效果用途能构建一套稻瘟病菌近等基因菌株进行抗性基因推导，可以实现不用做水稻杂交和接种杂交后代抗病性，也不用通过等位性测验，便可以通过直接利用突变体接种稳定的品种，依据抗病类型，了解品种的抗性基因组成；可用于含单个或多个抗病基因水稻品种的抗病基因推导。文档编号C12Q1/02GK101240346SQ200810058178公开日2008年8月13日申请日期2008年3月13日优先权日2008年3月13日发明者何月秋,吴毅馨,周惠萍申请人:云南农业大学