专利名称：水稻品种抗褐飞虱主基因bph2的分子标记方法
技术领域：
本发明提供了水稻品种ASD7抗褐飞虱主基因bph2的分子标记方法，属于分子遗传学领域，专用于水稻抗褐飞虱品种的选育与种质资源的利用。
二、技术背景水稻是我国的重要粮食作物。褐飞虱是一种水稻单食性害虫，属同翅目飞虱科。通过口针吸食水稻茎秆韧皮部汁液，为典型的刺吸式害虫。严重时引起稻株下部变黑、腐烂发臭、倒瘫，称之为“虱烧”，导致水稻减产或失收。目前，对褐飞虱的防治主要依赖于化学农药，但此措施不但增加了生产成本，且污染环境，因此，最为经济有效而不造成污染的防治措施是抗虫品种的应用。
迄今，已发现和鉴定了13个抗褐飞虱主基因。其中，显性基因6个，即Bph-1(Athwal et al.，1971)、Bph-3(Lakshiminarayana and Khush，1977)、Bph-6(Kabir andKhush，1988)、Bph-9(Ikeda et al.，1985；Nemoto et al.，1989a)、Bph-10(t)(Multani etal.，1994；Ishii et al.，1994)和Bph-13(t)(刘国庆等，2001)。隐性基因7个，即bph-2(Athwal et al.，1971)、bph-4(Lakshiminarayana and Khush，1977)、bph-5(Khush etal.，1985)和bph-7(Kabir and Khush，1988)、bph-8(Ikeda，1985；Nemoto et al.，1989a)、bph-11(t)和bph-12(t)(Hirabayashi and Ogawa，1999)。其他研究还进行了抗褐飞虱的分子定位研究，已鉴定了26个抗褐飞虱QTL，但真正用于育种的抗褐飞虱基因并不多。
国际水稻研究所自1973年先后选育了一系列分别携带Bph-1、bph-2和Bph-3等抗褐飞虱主基因的水稻品种，在种植这些品种的地区有效地控制了褐飞虱的暴发。然而，由于褐飞虱新生物型的产生，抗褐飞虱品种逐渐丧失抗性或面临抗性丧失的危险(Pathak and Khush，1979；Pathak and Saxena，1980；Heinrichs，1986；Saxena and Khan，1989；Heinrichs，1994；Gallagher et al.，1994)。我国也先后育成一系列含有抗褐飞虱基因Bph-1的品种(组合)，对褐飞虱的防治起了积极的作用。吕仲贤等(2002)对1986～2000年国家和浙江省育种攻关协作组提供的3328份水稻新品种(系)进行了抗褐飞虱鉴定和筛选，结果发现从“七五”、“八五”到“九五”抗虫品种鉴出率呈下降趋势，水稻抗褐飞虱育种未受到足够重视。目前，国内褐飞虱以生物型2为主，致害力强的孟加拉型生物型比例上升，原来带有Bph-1的抗虫品种，已逐渐失去抗性，因而迫切需要培育新的携带多个抗性基因的抗虫品种。
由于抗虫性鉴定的复杂性，利用常规育种手段往往难以有效地聚合不同的抗虫基因。而在找到与抗虫基因紧密连锁或共分离的分子标记的基础上，借助分子标记辅助选择(Marker-assisted selection，MAS)技术则可以有目的地进行抗虫基因和QTL的聚合，选育持久抗性品种，延缓抗虫品种的退化年限和防止褐飞虱新生物型的发生。
发明内容
技术问题本发明的目的是提供了水稻品种ASD7抗褐飞虱主基因bph2的分子标记方法，通过检测与该抗褐飞虱主效基因位点连锁的分子标记，可以检测水稻植株的褐飞虱抗性，加快抗褐飞虱水稻的选择进度。
技术方案水稻品种ASD7抗褐飞虱主基因bph2的分子标记方法，其特征在于用标记引物RM7102，左端引物序列 CGGCTTGAGAGCGTTTTTAG右端引物序列 TACTTGGTTACTCGGGTCGG或者用标记引物RM463，左端引物序列 TTCCCCTCCTTTTATGGTGC右端引物序列 TGTTCTCCTCAGTCACTGCG扩增水稻抗褐飞虱品种或育种材料DNA，如果用引物RM7102能够扩增出168bp的扩增片段，或者用引物RM463能够扩增出195bp的扩增片段，均标志着水稻ASD7抗褐飞虱主基因位点bph2的存在，其中该基因位点位于水稻基因组第12染色体标记RM463和RM7102之间的区域内，与两标记分别相距7.2cM和7.6cM，水稻品种ASD7对褐飞虱的抗性受bph2单基因的控制，标记RM463和RM7102在以抗褐飞虱品种ASD7(Athwal D S，M D Pathak，E H Bacalangco，and C D Pura，Crop Sci.1971，11747-750)为母本，感褐飞虱粳稻品种C418(杨振玉，张宗旭，魏耀林，赵迎春，高勇.杂交水稻，1998，13(3)31-32)为父本，配制C418/ASD7//C418的BC1F1群体，对该群体褐飞虱抗性的辅助选择正确率均为95.1％；在C418/ASD7//C418///C418 BC2F1群体中辅助对褐飞虱抗性选择的正确率分别为91.2％和89.9％。
筛选上述标记引物的过程如下1.以抗褐飞虱品种ASD7为母本，感褐飞虱粳稻品种C418为父本，配制杂种构建了包含134个单株的F2分离群体，ASD7/C418 F2群体用于分子标记分析；每个F2单株通过自交获得相应的F2∶3家系，用于抗虫性鉴定。
2.用SDS法提取亲本、F1及F2群体各株系的DNA。采用简单重复序列标记SSR对两亲本进行多态性筛选，PCR在PTC-200(MJ Research Inc.)扩增仪上进行，扩增产物在8％(g/ml)聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析，亲本间有多态的引物在F2群体中进行分析，PCR扩增程序同上，获取F2群体各单株基因型资料；3.根据连锁交换规律，利用群体基因型资料构建水稻的遗传图谱，所用软件为MAPMARKER/EXP3.0，用Kosambi函数将重组值转换为遗传距离；4.采用苗期接种进行抗虫性鉴定。褐飞虱为生物型1和生物型2混合种群(方法参照“程遐年，吴进才，马飞编著.褐飞虱研究与防治，中国农业出版社，2003年第一版，p53-62”)。两叶一心期时按10头/苗的比例接种2-3龄褐飞虱若虫，最后罩上尼龙纱网罩，当感虫品种TN1全部死亡时，参照Athwal等(1971)IRRI(1988)和Huang等(2001)的方法对每个单株进行0，1，3，5，7或9级的抗性评价。对亲本材料和三个群体中的每个家系通过加权平均计算该家系的抗性级别，并根据抗性级别推测此单株基因型。
5.利用MAPMARKER/EXP3.0软件对各个分子标记的群体基因型资料和与其对应每个家系的褐飞虱抗性鉴定的抗虫级别进行连锁分析，单向方差分析测得与褐飞虱抗性不相关的概率P值，P＜0.05的分子标记即与一个主基因位点连锁，抗褐飞虱主基因的位置由分子标记的染色体位置确定在ASD7中发现在概率P＜0.05时，标记RM7102、RM463与第12染色体的抗褐飞虱主效基因位点bph2不连锁，表明RM7102标记和RM463标记即是获得的水稻ASD7抗褐飞虱主效基因位点bph2的分子标记。
有益效果 本发明所提供的水稻品种ASD7抗褐飞虱主基因bph2的分子标记方法，具有以下优点
(1)通过本发明在国际上首次用SSR标记定位了水稻品种ASD7中的抗褐飞虱主基因bph2。
(2)通过本发明分子标记定位的主基因位点位置明确，鉴定方便。通过检测与该基因位点连锁的分子标记，即可以预测水稻植株的褐飞虱抗性，用于水稻品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系是否具有褐飞虱抗性，进而快速筛选抗病品种或品系用于水稻育种。其检测方便快速，不受环境影响；(3)辅助育种选择目标明确，节约成本。在传统育种方法中，首先要收集具有抗虫基因的亲本与栽培品种进行一系列杂交，而且要对褐飞虱抗性进行单株选择。对水稻褐飞虱进行表型鉴定复杂，首先要获得虫源、饲养褐飞虱，此外要获得接种虫源和水稻秧苗同步，非常困难，而且受环境影响，表型鉴定的结果可靠性低。因此抗虫育种不仅费时，而且难度大，成本高。通过检测抗褐飞虱主效基因位点，可以在苗期就鉴定出高抗褐飞虱的单株，淘汰其它植株，不仅节约生产成本而且大大提高抗褐飞虱水稻的选择效率。
四
图1水稻品种ASD7抗褐飞虱主基因bph2在第12染色体长臂上的位置。
图2标记RM7102对C418/ASD7//C418 BC1F1代分子标记辅助选择电泳图谱。M，分子量标记；P1，C418；P2，ASD7；F1，F1；1-21，BC1F1个体。
图3标记RM463对C418/ASD7//C418///C418 BC2F1代分子标记辅助选择电泳图谱；M，分子量标记；P1，C418；P2，ASD7；F1，F1；1-21，BC2F1个体。
五具体实施例方式
本发明的详细说明如下研究表明，抗褐飞虱基因资源主要存在于斯里兰卡和印度籼稻和野生稻种中(Ikedaand Vaughau，1991)。Athwal et al.(1971)(Athwal D S，M D Pathak，E H Bacalangco，andC D Pura，Crop Sci.1971，11747-750)报道Mudgo、CO22和MTU15携带同一抗褐飞虱基因Bph-1，ASD7携带一个隐性抗虫基因bph-2。Athwal and Pathak(1972)报道MGL2含有抗虫基因Bph-1，Ptb18含有bph-2。Martinez and Khush(1974)报道IR747B2-6含有Bph-1，R1154-243和IR4-93含有bph-2。Lakshiminarayana and Khush(1977)报道斯里兰卡抗虫品种Rathu Heenati由一个与Bph-1独立分离的显性基因Bph-3控制；而品种Babawee则由一个与bph-2独立分离的隐性基因bph-4控制。Sidhu and Khush(1978)报道携带Bph-3或bph-4的水稻品种对所有的褐飞虱生物型都表现抗性。泰国水稻品种Col.5 Thailand和Col.11 Thailand，缅甸水稻品种Chin Saba由同一个与bph-2和bph-4都不等位的隐性抗虫基因bph-8控制(Ikeda，1985)。这些抗虫基因的鉴定和遗传研究为抗虫品种的培育提供了基础，其中Bph-1、bph-2和Bph-3已被应用到抗虫育种中。但是，由于抗虫性鉴定的复杂性，利用常规育种手段往往难以有效地聚合不同的抗虫基因。而在找到与抗虫基因紧密连锁或共分离的分子标记的基础上，借助分子标记辅助选择(Marker-assisted selection，MAS)技术则可以有目的地进行抗虫基因和QTL的聚合，选育持久抗性品种，延缓抗虫品种的退化年限和防止褐飞虱新生物型的发生。
通过本发明抗虫水稻品种ASD7抗褐飞虱主基因位点的鉴定和分子标记的发现，可用来指导抗褐飞虱水稻品种的选育工作，用与之连锁的分子标记对抗虫品种进行筛选，大大提高育种效率。
材料与方法(一)ASD7/C418(F2、F2∶3)群体、C418/ASD7//C418(BC1F1、BC1F2)、C418/ASD7//C418///C418(BC2F1、BC2F2)群体的构建与表型鉴定(1)对抗虫品种ASD7(♀)(Athwal D S，M D Pathak，E H Bacalangco，and C D Pura，CropSci.1971，11747-750)与我国粳稻品种C418(♂)(杨振玉，张宗旭，魏耀林，赵迎春，高勇.杂交水稻，1998，13(3)31-32)进行杂交获得F1(ASD7/C418)，F1自交产生ASD7/C418 F2，获得包含134个单株的F2分离群体，ASD7/C418 F2群体用于分子标记分析。每个F2单株通过自交获得相应的ASD7/C418F2∶3家系，用于抗虫性鉴定。
(2)同时，以感褐飞虱粳稻品种C418为母本(♀)，抗褐飞虱品种ASD7为父本(♂)，配制杂种F1(C418/ASD7)，再以F1(C418/ASD7)为母本与父本C418回交，获得包含89个单株的BC1F1(C418/ASD7//C418)群体，利用ASD7/C418F2群体分子标记分析所获得的与抗性基因连锁的分子标记RM7102、RM463进行筛选，选择两个标记的带型均与抗性亲本ASD7相同的BC1F1植株为母本与父本C418继续回交，构建了包含154个单株的BC2F1(C418/ASD7//C418///C418)群体。分别自交获得BC1F2(C418/ASD7//C418)、BC2F2(C418/ASD7//C418///C418)群体。
(3)采用苗期接虫鉴定法(苏昌潮，程遐年，翟虎渠，万建民.遗传学报，2002，29(4)332-338)，对上述亲本ASD7和C418、ASD7/C418的F1、ASD7/C418的F2∶3、C418/ASD7//C418的BC1F2、C418/ASD7//C418///C418的BC2F2进行抗虫性鉴定。为确保亲本、F1和三个群体中的每个家系生长一致，所有供试材料在播种前分别浸种催芽。每个家系(品种)分别取25粒种子播种于一个直径8.5cm、高9.0cm，盛满营养土的圆形塑料钵中(钵底部有一小孔，便于渗透吸水)，株距为2.5cm。各品种随机种植3钵。每28个塑料钵置于一个65cm×44cm×14cm的塑料箱内(箱内保持水层2cm左右)。播种7天后间苗，淘汰病弱苗，保留到每钵20株，待苗长到两叶一心期时按10头/苗的比例接种2-3龄褐飞虱若虫，最后罩上尼龙纱网罩，当对照感虫品种TN1全部死亡时，参照Athwal等(1971)、IRRI(1988)和Huang等(2001)的方法对每个单株进行0，1，3，5，7或9级的抗性评价(表1)，对亲本材料和三个群体中的每个家系通过加权平均计算该家系的抗性级别，并根据抗性级别推测此家系基因型。
表1 本研究所用的抗感褐飞虱评价标准
(二)ASD7/C418 F2群体的分子标记分析(1)用SDS法提取ASD7/C418 F2各单株DNA；
(2)SSR分析参照Chen et al.(1997)的程序。10μl反应体系包括10mM Tris-HCl pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，50μM dNTPs，0.2μM引物，0.5U Taq聚合酶(TaKaRa，大连)和20ng DNA模板。扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行94℃ 4min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1.5min，35个循环；72℃ 7min。扩增产物用8％的非变性PAGE胶分离，通过银染显色，银染程序根据Sanguinetti et al.(1994)的方法。扩增的DNA条带利用装有荧光灯的灯箱进行观察。记录结果，用亲本间有多态的标记分析F2群体各单株的标记基因型，获取F2群体各单株的基因型资料；(3)根据连锁交换规律，利用亲本间多态性检测筛选出的SSR标记对134个F2单株进行分析，按Mapmaker软件的要求将与ASD7相同带型的个体赋值为1，与C418相同带型的个体赋值为2，具有双亲带型(杂合带)的个体赋值为3，数据缺失的记为0，利用MAPMAKER(EXP3.0)软件进行连锁分析(Lincoln SE et al.，1993)，构建SSR标记连锁图；(4)利用QTL Cartographer 2.0软件对F2群体各单株的各个分子标记基因型资料和相应家系的抗褐飞虱抗性级别进行连锁分析，用Kosambi函数将重组值转换为遗传距离。单向方差分析测得与褐飞虱抗性不相关的概率P值，P＜0.05的分子标记即与一个主基因位点连锁，抗褐飞虱主基因的位置由分子标记的染色体位置确定在ASD7中发现在概率P＜0.05时，标记RM7102、RM463与第12染色体的抗褐飞虱主效基因位点bph2不连锁，表明RM7102标记和RM463标记即是获得的水稻ASD7抗褐飞虱主效基因位点bph2的分子标记。
(5)对C418/ASD7//C418的BC1F1世代89个单株和C418/ASD7//C418///C418 BC2F1世代的154个单株计算标记辅助选择的效率，结合表型和分子数据，计算两群体中标记与基因的遗传交换率，用Kosambi函数将交换值转换为图距。并计算2个标记的选择效率。
(三)结果与分析苗期集团接种鉴定显示ASD7和C418的抗虫级别分别为1.1和8.7，这表明ASD7抗褐飞虱而C418感褐飞虱。F1植株的抗虫级别为1.8，对褐飞虱表现抗性，表明ASD7的抗虫性由显性基因控制。134个F2∶3家系对褐飞虱的抗虫级别频率分布呈连续分布，最小为0.1，最大为9.00，并在抗虫级别1、5和8三个位置出现3个明显的家系数峰值。根据其对褐飞虱的抗虫级别将F2∶3家系分为抗虫、抗感分离和感虫三种表现型，而相应的F2单株的基因型则分别为记为RR(纯合抗虫)、Rr(杂合抗虫)和rr(纯合感虫)三种。F2群体对褐飞虱的抗感分离符合1∶2∶1的比例(x2＝2.95，x20.05，2＝5.99)(表2)。
Murata et al.，1998年报道品种PL4的bph2基因位于第12染色体，为此，本研究首先对第12染色体上的43个SSR标记进行亲本ASD7和C418的多态性分析，结果有12个标记(占28％)在亲本间呈现多态性。其中，位于第12染色体长臂上的标记RM463的分离与对褐飞虱抗性的分离表现出显著正相关。进一步选用位于RM463周围且在亲本间具有多态的其他SSR标记进行连锁分析，并构建了第12染色体的SSR标记连锁图谱。单向方差分析测得与褐飞虱抗性不相关的概率P值，P＜0.05的分子标记即与一个主基因位点连锁，抗褐飞虱主基因的位置由分子标记的染色体位置确定在ASD7中发现在概率P＜0.05时，标记RM7102、RM463与第12染色体的抗褐飞虱主效基因位点bph2不连锁，与褐飞虱抗性不相关的概率P值分别均为0.05，表明RM7102标记和RM463标记即是获得的水稻ASD7抗褐飞虱主效基因位点bph2的分子标记。这两个标记与抗褐飞虱基因位点bph2分别相距7.2cM和7.6cM(图1)。
利用RM463和RM7102对C418/ASD7//C418 BC1F1和C418/ASD7//C418///C418BC2F1世代进行分子标记分析，结合抗虫鉴定的抗性级别表现，计算两个标记辅助选择的效率，图2、图3分别显示了RM7102在C418/ASD7//C418 BC1F1世代和RM463在C418/ASD7//C418///C418 BC2F1世代部分单株中扩增多态性。用A(a)表示植株的表型，“A-”表示抗虫植株，“aa”表示感虫植株；B(b)表示SSR位点基因型组成，“BB”表示2个等位基因位点均来自抗性品种ASD7，“Bb”表示一个等位基因位点来自抗性品种ASD7，另一位点来自C418，“bb”表示2个等位基因位点均来自C418。由表3可见RM463和RM7102在C418/ASD7//C418 BC1F1群体中，两者选择正确率均为95.1％，在C418/ASD7//C418///C418 BC2F1群体中，RM463的选择正确率为91.2％，RM7102的选择正确率为89.9％，充分表明用SSR标记RM463和RM7102对抗褐飞虱基因bph2进行标记辅助选择方法的可靠性。
通过上述分子标记鉴定主基因位点来预测或检测水稻植株抗性，预计可迅速提高我国水稻抗褐飞虱品种的育种进程。
表2 ASD7/C418 F2分离群体134个单株对褐飞虱抗性抗感分离比例
a)RR，纯合抗虫；Rr，杂合抗虫；rr，纯合感虫b)1RR∶2Rr∶1rr适合性测验值x2为2.95(x20.05，2＝5.99)；4)本栏为抗虫级别值域；RS，Resistance Score(抗虫级别)表3 标记RM463和RM7102的辅助选择效率
A(a)示植株的表型，“A-”表示抗虫植株，“aa”表示感虫植株；B(b)表示SSR位点基因型组成，“BB”表示2个等位基因位点均来自抗性品种ASD7，“Bb”表示一个等位基因位点来自抗性品种ASD7，另一位点来自C418，“bb”表示2个等位基因位点均来自C418。
权利要求
1.水稻品种ASD7抗褐飞虱主基因bph2的分子标记方法，其特征在于用标记引物RM7102，左端引物序列 CGGCTTGAGAGCGTTTTTAG右端引物序列 TACTTGGTTACTCGGGTCGG或者用标记引物RM463，左端引物序列 TTCCCCTCCTTTTATGGTGC右端引物序列 TGTTCTCCTCAGTCACTGCG扩增水稻抗褐飞虱品种或育种材料DNA，如果用引物RM7102能够扩增出168bp的扩增片段，或者用引物RM463能够扩增出195bp的扩增片段，均标志着水稻ASD7抗褐飞虱主基因位点bph2的存在，该基因位于水稻基因组的第12染色体标记RM463和RM7102之间的区域内，与两标记分别相距7.2cM和7.6cM，标记RM463和RM7102在C418/ASD7//C418的BC1F1群体中，辅助选择正确率均为95.1％；在C418/ASD7//C418///C418 BC2F1群体中辅助选择的正确率分别为91.2％和89.9％。
2.根据权利要求1所述的水稻品种ASD7抗褐飞虱主基因bph2的分子标记方法，其特征在于，筛选上述标记引物的过程如下(1)以抗褐飞虱品种ASD7为母本，感褐飞虱粳稻品种C418为父本，配制杂种，构建ASD7/C418 F2分离群体，用于分子标记分析；每个F2单株通过自交获得相应的F2:3家系，用于抗虫性鉴定；(2)用SDS法提取亲本ASD7和C418、ASD7/C418F1及ASD7/C418F2群体各株系的DNA采用简单重复序列标记SSR对两亲本进行多态性筛选，PCR在PTC-200扩增仪上进行，扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析，亲本间有多态的引物在F2群体中进行分析，PCR扩增程序同上，获取群体基因型资料；(3)根据连锁交换规律，利用群体基因型资料构建水稻的遗传图谱，所用软件为MAPMARKER/EXP3.0，用Kosambi函数将重组值转换为遗传距离；(4)采用苗期接种进行抗虫性鉴定褐飞虱为生物型1和生物型2混合种群；(5)利用MAPMARKER/EXP3.0软件对群体各家系的各个分子标记基因型资料和相应家系的褐飞虱抗性鉴定的抗虫级别进行连锁分析，单向方差分析测得与褐飞虱抗性不相关的概率P值，P＜0.05的分子标记即与一个主基因位点连锁，抗褐飞虱主基因的位置由分子标记的染色体位置确定在ASD7中发现第12染色体RM7102标记和RM463标记与抗褐飞虱主效基因位点紧密连锁，与褐飞虱抗性不相关的概率P值均为0.05，RM7102标记和RM463标记即为标记水稻ASD7抗褐飞虱主效基因位点bph2的标记引物。
全文摘要
本发明涉及水稻品种ASD7抗褐飞虱主基因bph2的分子标记方法，属于分子遗传学领域。对水稻抗虫品种ASD7(♀)与感虫品种C418(♂)杂交获得的F
文档编号C12N15/11GK1896282SQ200610085400
公开日2007年1月17日 申请日期2006年6月13日 优先权日2006年6月13日
发明者万建民, 江玲, 孙立宏, 刘裕强, 刘喜, 陈亮明, 刘世家, 王春明, 程遐年, 翟虎渠 申请人:南京农业大学