水稻抗褐飞虱基因Bph9及其分子标记和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了水稻抗褐飞虱基因Bph9及其分子标记和应用。其具有SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列，其cDNA序列如SEQ?ID?No.2所示。Bph9基因定位于分子标记InD2和RM28466之间。与该基因紧密连锁的分子标记还有RM28438、InD28450、InD28453、InD14、InD28432、RM28481和RM28486之一，可用于筛选含有抗褐飞虱基因Bph9的水稻。Bph9基因属于NBS-LRR基因家族，编码的蛋白质与植物抗病性相关，通过遗传转化和杂交，将Bph9基因转入普通水稻品种，能够提高水稻对褐飞虱的抗性，从而减轻褐飞虱产生的危害，达到增产和稳产的目的。
【专利说明】水稻抗褐飞虱基因Bph9及其分子标记和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种水稻抗褐飞虱基因Bph9，同时还涉及该基因的分子标记以及该基因及其分子标记在选育抗褐飞虱水稻及水稻种子中的应用。
【背景技术】
[0002]水稻是一种重要的粮食作物，世界上有超过一半的人以其为主食。同时，由于水稻基因组精细遗传图和物理图谱已完成，其转基因技术相对容易，并且与其它禾本科作物基因组具有共线性，因而被视做模式植物。随着包括水稻在内的多种生物基因组测序的完成，人类开始进入后基因组时代。全面开展功能基因组研究已成为生命科学的前沿领域。因此水稻功能基因的研究对社会经济发展和生物学研究具有重大意义。
[0003]粮食安全问题，是全世界人民面临的挑战。50、60年代的矮化育种和70年代的杂交水稻培育两次科技革命使水稻产量大幅度提高。褐飞虱是一种爆发力强、危害性大的水稻虫害。褐飞虱的成虫、若虫刺吸水稻汁液，引起黄叶或枯死，褐飞虱还传播或诱发多种水稻病害，导致减产或绝收。上世纪60年代以前，褐飞虱仅在我国局部稻区时有发生。其后，随着气候、环境、种植结构、耕作制度、栽培方式的变化，褐飞虱为害地域由南向北扩展，发生频次增加，危害程度加重。据中国农业年鉴记载，1966、1969、1973、1977、1983和2003年全国性大发生，1987、1991、2005、2006和2007年全国性特大发生，褐飞虱危害面积达到水稻总面积的50%以上，给我国水稻生产造成了严重的损失。目前我国每年水稻褐飞虱发生面积为2000万公顷以上，每年因褐飞虱危害造成的直接产量损失达280万吨以上。褐飞虱已对我国水稻生产安全形成严重威胁。
[0004]目前，褐飞虱已经成为我国水稻生产中的第一大虫害，对我国当前粮食安全已形成严重威胁。长期以来，褐飞虱的防治主要是依靠施用化学杀虫剂。由于褐飞虱爆发多发生在水稻成熟灌浆期，此时稻株`长势旺盛，将杀虫剂施到稻株基部的操作非常困难。事实上由于化学杀虫剂的连年大量施用，褐飞虱抗药性成倍增加，使药剂防治的效果有限。同时使用化学杀虫剂防治褐飞虱，一方面增加了农民的生产成本，另一方面化学杀虫剂还造成对非目标生物的毒杀、对环境和粮食污染等环境和生态问题。
[0005]褐飞虱连年持续爆发猖獗的内在原因是我国水稻品种大面积种植的主要水稻品种抗褐飞虱性能普遍差，加上杂交稻品种株型高大，中后期田间群体大，茎叶茂密，田间郁蔽度高，营养适宜，有利于褐飞虱快速繁殖，对褐飞虱等虫害表现为“超感虫性”，在虫源基数大、气候条件适宜时，极易形成爆发流行之势，造成严重危害(寒川，刘光杰等2003)。国际水稻研究所和东南亚的水稻生产实践证明，栽种的水稻品种即使只带有中等水平的抗性基因，也足以将褐飞虱的群体控制在造成危害的水平以下，不至于对水稻造成严重的危害和产量损失。因此，防控褐飞虱最为经济有效安全生态的措施是种植含抗褐飞虱基因的水稻品种。
[0006]水稻抗褐飞虱基因的研究始于上世纪70年代初。至今已经在普通栽培稻和野生稻资源中鉴定和定位了二十多个水稻抗褐飞虱的主效抗虫基因(具体综述见Jena等，2010.Current status of Brown Planthopper(BPH)resistance and genetics.Rice2010 (3)，161-171)。 如 Bphl (Athwal et al.，1971;Hirabayashi and Ogawaj 1995 ；Sharma et al.，2003;Cha et al.，2008)，bph2 (Athwal et al.，1971;Murata etal.,1998;Murai et al.,2001), Bph3 (Lakshminarayana and Khush，1977;Jairin etal.，2007)，bph4(Kawaguchi et al.，2001)，bph5 (Khush et al.，1991), Bph6 (Kabirand Khush, 1988;Qiu et al.,2010), bph7 (Kabir and Khush，1988)，bph8(Nemoto etal.，1989)，Bph9((Nemoto et al., 1989;Muruta and Fujiwaraj 2001), BphlO(Ishii etal.，1994)，Bphll(Takita，1996)，bphl2(Hirabayashi et al.，1998，1999)，Bph13 (t)(Liu et al.,2001), Bph14(Wang et al., 2001;Du et al.，2009)，Bphl5(Huang etal.，2001;Yang et al 2004)，Bphl7(Renganayaki et al.，2002)，Bphl8 (t) (Jenaet al.，2006)，bphl9 (t) (Chen et al.，2006)，bph20 (t)、bph21 (t)、bph22 (t)、bph23 (t)、Bph24 (t) (Li et al., 2006;李容桕等，2008)，Bph20、Bph21 (Rahman et al2009)，Bph22 (t)、Bph23 (t) (Ram et al 2010)，bph24 (t) (Deen et al 2010)，bph22 (t)、bph23 (t) (Hou et al 2011),Bph25 (t)Λ Bph26 (t) (Myint et al.2005;Yara etal.2010;Myint et al.2012)。其中，Bphl4基因已经成功克隆，这是国际上首次利用图位克隆法分离得到的第一例水稻抗虫基因(Du et al 2009)。
[0007]图位克隆(map-based cloning)又称为定位克隆(positional cloning)，是随着分子标记遗传连锁图谱的发展而发展起来的一种基因克隆技术。图位克隆法步骤包括对目标基因进行遗传定位、物理定位、序列分析及遗传转化验证功能。从理论上讲，任何一个能定位的基因都可用图位克隆法分离。图位克隆法一般适合于基因组比较小的物种，如单子叶模式植物水稻，具有基因组小、基因组物理距离与遗传距离之比小而且标记丰富的特点。水稻作为禾本科模式植物，其基因组是麦、高梁等七种禾本科植物基因组组成的同心圆的圆心，是最适合应用图位克隆法分离目的基因的作物之一。水稻中已经克隆的多个基因都是通过图位克隆法克隆的，如抗白叶枯病基因Xa-21 (Song WY等1995，A Receptor Kinase-Like Protein Encoded by the Rice Disease ResistanceGene，Xa21.Science，270:1804-1806)、Xa_l (Yoshimura 等 1998，Expression of Xa-1j abacterial blight-resistance gene in rice,is induced by bacterial inoculation.PNAS，95:1663-1668)和 Xa_26 (Sun 等 2004，Xa26 a gene conferring resistance toXanthomonas oryzae pv.0ryzae in rice, encodes an LRR receptor kinase-likeprotein.Plant Journal，37:517-527)，抗稻痕病基因 Pi_b (Wang 等 1999，The Pi_b genefor rice blast resistance belongs to the nucleotide binding and leucine-richrepeat class of plant disease resistance genes.Plant Journal, 1999，19:55-64)和 Pi_ta (Bryan 等 2000，A single amino acid difference distinguishes resistantand susceptible alleles of the rice blast resistance gene P1-ta.PlantCell，12:2033~2046)，我国科学家克隆的分蘖基因(Li 等 2003，Control of tilleringin rice.Nature 422:618-621 )、耐盐基因(Ren 等 2005，A rice quantitative traitlocus for salt tolerance encodes a sodium transporter.Nature Genetics37 (10): 1141-1146)和高产基因(Weiya Xue 等 2008，Natural variation in Ghd7isan important regulator of heading date and yield potential in rice.NatureGenetics 40，761-767)，以及应用图位克隆法分离得到的第一例水稻抗虫基因(Du等2009，Identification and characterization of Bphl4，a gene conferring resistanceto brown planthopper in rice.PNAS，106:22163-22168)。
【发明内容】
[0008]本发明目的在于提供一种水稻抗褐飞虱的基因Bph9及其应用。
[0009]本发明另一目的是提供一种抗褐飞虱基因Bph9的分子标记及其应用。
[0010]本发明采用遗传学的方法，构建水稻抗褐飞虱的分离群体，利用图位克隆的方法，分离到水稻抗褐飞虱基因Bph9。通过共分离标记检测表明该基因与抗褐飞虱性能是共分离的，通过遗传转化Bph9基因，使感性水稻出现抗褐飞虱的表型，证实了该基因的功能。
[0011]本发明提供一种分离的多核苷酸，其具有水稻抗褐飞虱基因Bph9序列，所述序列是SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，或该序列经替换、缺失或增加一个或多个核苷酸，且编码相同或相似，且具有相同功能的氨基酸序列的核苷酸序列。
[0012]本发明提供一种分离的多核苷酸，其具有水稻抗褐飞虱基因Bph9的cDNA序列，所述序列是SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，或该序列经替换、缺失或增加一个或多个核苷酸，且编码相同或相似，且具有相同功能的氨基酸序列的核苷酸序列。
[0013]本发明提供的分离的多核苷酸，其cDNA序列如SEQ ID N0.2所示。
[0014]本发明提供的Bph9基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，该基因全长15628bp，具有2个内含子和3个外显子，其⑶S分别为区段分别为2963-4073、6373-6996和12663-14960，cDNA全长4042bp，编码1206个氨基酸，其蛋白序列如序列表SEQ ID N0.3所示。该蛋白属于NBS-LRR家族，活性中心175-322区段为保守的NB-ARC区、392-672区段为保守的 NB-ARC 区(包括 P-1oop NTPase、AAA ATPase domain)、822_873 区段为 Leucinerich repeat (LRR,富亮氨酸重复)。
[0015]应当理解，在不影响Bph9蛋白活性的前提下(即不在蛋白的活性中心)，本领域技术人员可对SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。
[0016]此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响蛋白表达的条件下，对编码上述蛋白的多核苷酸序列进行修改。因此，本发明还包含对编码上述蛋白的多核苷酸序列进行的替换、添加和/或缺失一个或多个核苷酸，具有与上述编码具有相同功能蛋白的核苷酸序列。
[0017]本发明提供的上述多核苷酸片段其与一个同源或异源启动子序列可操纵地连接。
[0018]本发明还包括基于所述多核苷酸的正义序列或反义序列，包括含有所述多核苷酸序列或其片段的克隆载体或表达载体、含有所述载体的宿主细胞、含有所述核苷酸序列或其片段的转化的植物细胞和转基因植物。
[0019]其中所述植物是单子叶植物。
[0020]其中所述单子叶植物是水稻。
[0021 ] 本发明提供了上述多核苷酸在水稻选育中的应用。
[0022]本发明提供了上述多核苷酸在提高水稻抗褐飞虱抗性中的应用
[0023]本发明提供了上述多核苷酸在制备转基因抗褐飞虱水稻中的应用。[0024]本发明提供一种培育具有褐飞虱抗性的植物的方法，包括:
[0025]I)用多核苷酸转化植物细胞；所述多核苷酸含有水稻抗褐飞虱Bph9基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示；
[0026]2)将被转化的植物细胞再生为植株；
[0027]3)培养再生的植株并使上述多核苷酸得到表达。
[0028]本发明还提供一种产生具有褐飞虱抗性的植物的方法，所述方法包括将具有褐飞虱抗性基因Bph9的植物与其他植物杂交产生具有褐飞虱抗性的子代植株。
[0029]其中所述植物是单子叶植物。
[0030]优选地，所述植物是水稻。
[0031]本领域技术人员应能理解，根据本发明公开的序列来设计或产生分子标记可用于抗褐飞虱水稻的选育工作。
[0032]本发明同时还提供与抗褐飞虱主效基因Bph9连锁的分子标记，其为
[0033]RM28438 标记引物:
[0034]正向引物序列GTTCGTGAGCCACAACAAATCC
[0035]反向引物序列GTTAAATGCTCCACCAAACACACC
[0036]或InD28450标记引`物:
[0037]正向引物序列GGTTGGAAAAGAAGCGATCA
[0038]反向引物序列GCATCRTAAGGTTGCCATCA
[0039]或InD28453标记引物:
[0040]正向引物序列GGCAAAGACAAGCCATAAGC[0041 ]反向引物序列 ATCCATCAGCAATGACACGA
[0042]或InD28432标记引物:
[0043]正向引物序列TGCAGACACCACATGCATAA
[0044]反向引物序列ACGCATACACACAGGGACAA
[0045]或InD2标记引物:
[0046]正向引物序列AACAGACACGTTGCGTCTTG
[0047]反向引物序列CTTGCCGCTTAGAGGAGATG
[0048]或InD14标记引物:
[0049]正向引物序列CCACTCTGAAAATCCCAAGC
[0050]反向引物序列ACCAGTTAAGTCACGCTCAAA
[0051]或RM28466标记引物:
[0052]正向引物序列CCGACGAAGAAGACGAGGAGTAGCC
[0053]反向引物序列AGGCCGGAGAGCAATCATGTCG
[0054]或RM28481标记引物:
[0055]正向引物序列GTCAATTAACCATTGCCCATGC
[0056]反向引物序列TTCACGTGGGAACTACTCATGC
[0057]或RM28486标记引物:
[0058]正向引物序列TTCTCTGAATGCCCTGTCTCTCC
[0059]反向引物序列GGCAAATCAGAACAAGTCTCACC,[0060]用上述标记引物扩增水稻基因组DNA，如果用引物RM28438能够扩增出213bp的扩增片段，或者用引物InD28450能够扩增出221bp的扩增片段，或者用引物InD28453能够扩增出323bp的扩增片段，或者用引物InD28432能够扩增出320bp的扩增片段，或者用引物InD2能够扩增出241bp的扩增片段，或者用引物InD14能够扩增出397bp的扩增片段，或者用引物RM28466能够扩增出85bp的扩增片段，或者用引物RM28481能够扩增出237bp的扩增片段，或者用引物RM28486能够扩增出161bp的扩增片段，均标志着水稻品种抗褐飞虱主效基因位点 Bph9 的存在。因此，分子标记 RM28438、InD28450、InD28453、InD28432、InD2、InD14, RM28466, RM2848U RM28486能用于筛选含有抗褐飞虱基因Bph9的抗褐飞虱水稻。
[0061]本发明还提供了另一个水稻抗褐飞虱基因Bph9的分子标记，其由InDel分子标记IR2引物经PCR扩增获得，该引物为:
[0062]正向引物序列AGGATGGGGAGAAGAAGACG，
[0063]反向引物序列GTGTTCCTTGTCGGGTGTA。
[0064]本发明还提供与水稻抗褐飞虱抗性相关的分子标记，其为
[0065]RM28438 标记引物:
[0066]正向引物序列GTTCGTGAGCCACAACAAATCC
[0067]反向引物序列GTTAAATGCTCCACCAAACACACC
[0068] 或InD28450标记引物:
[0069]正向引物序列GGTTGGAAAAGAAGCGATCA
[0070]反向引物序列GCATCRTAAGGTTGCCATCA
[0071]或InD28453标记引物:
[0072]正向引物序列GGCAAAGACAAGCCATAAGC
[0073]反向引物序列ATCCATCAGCAATGACACGA
[0074]或InD28432标记引物:
[0075]正向引物序列TGCAGACACCACATGCATAA
[0076]反向引物序列ACGCATACACACAGGGACAA
[0077]或InD2标记引物:
[0078]正向引物序列AACAGACACGTTGCGTCTTG
[0079]反向引物序列CTTGCCGCTTAGAGGAGATG
[0080]或InD14标记引物:
[0081 ]正向引物序列 CCACTCTGAAAATCCCAAGC
[0082]反向引物序列ACCAGTTAAGTCACGCTCAAA
[0083]或RM28466标记引物:
[0084]正向引物序列CCGACGAAGAAGACGAGGAGTAGCC
[0085]反向引物序列AGGCCGGAGAGCAATCATGTCG
[0086]或RM28481标记引物:
[0087]正向引物序列GTCAATTAACCATTGCCCATGC
[0088]反向引物序列TTCACGTGGGAACTACTCATGC
[0089]或RM28486标记引物:
[0090]正向引物序列TTCTCTGAATGCCCTGTCTCTCC[0091 ]反向引物序列 GGCAAATCAGAACAAGTCTCACC,
[0092]或IR2标记引物:
[0093]正向引物序列AGGATGGGGAGAAGAAGACG，
[0094]反向引物序列GTGTTCCTTGTCGGGTGTA。
[0095]本发明还提供了上述分子标记在选育抗褐飞虱水稻中的应用。
[0096]本发明提供了水稻抗褐飞虱基因bph9的分子标记方法，其通过下述之一的引物对扩增待检水稻基因组DNA，并检测扩增产物:
[0097]I)标记引物，RM28438标记引物:
[0098]正向引物序列GTTCGTGAGCCACAACAAATCC
[0099]反向引物序列GTTAAATGCTCCACCAAACACACC
[0100]2)标记引物，InD28450标记引物:
[0101]正向引物序列GGTTGGAAAAGAAGCGATCA
[0102]反向引物序列GCATCRTAAGGTTGCCATCA
[0103]3)标记引物，InD28453标记引物:
[0104]正向引物序列GGCAAA`GACAAGCCATAAGC
[0105]反向引物序列ATCCATCAGCAATGACACGA
[0106]4)标记引物，InD28432标记引物:
[0107]正向引物序列TGCAGACACCACATGCATAA
[0108]反向引物序列ACGCATACACACAGGGACAA
[0109]5)标记引物，InD2标记引物:
[0110]正向引物序列AACAGACACGTTGCGTCTTG
[0111]反向引物序列CTTGCCGCTTAGAGGAGATG
[0112]6)标记引物，InD14标记引物:
[0113]正向引物序列CCACTCTGAAAATCCCAAGC
[0114]反向引物序列ACCAGTTAAGTCACGCTCAAA
[0115]7)标记引物，RM28466标记引物:
[0116]正向引物序列CCGACGAAGAAGACGAGGAGTAGCC
[0117]反向引物序列AGGCCGGAGAGCAATCATGTCG
[0118]8)标记引物，RM28481标记引物:
[0119]正向引物序列GTCAATTAACCATTGCCCATGC
[0120]反向引物序列TTCACGTGGGAACTACTCATGC
[0121]9)标记引物，RM28486标记引物:
[0122]正向引物序列TTCTCTGAATGCCCTGTCTCTCC
[0123]反向引物序列GGCAAATCAGAACAAGTCTCACC,
[0124]10)标记引物，IR2标记引物:
[0125]正向引物序列AGGATGGGGAGAAGAAGACG，
[0126]反向引物序列GTGTTCCTTGTCGGGTGTA，
[0127]如果用引物RM28438能够扩增出213bp的扩增片段，或者用引物InD28450能够扩增出221bp的扩增片段，或者用引物InD28453能够扩增出323bp的扩增片段，或者用引物InD28432能够扩增出320bp的扩增片段，或者用引物InD2能够扩增出241bp的扩增片段，或者用引物InD14能够扩增出397bp的扩增片段，或者用引物RM28466能够扩增出85bp的扩增片段，或者用引物RM28481能够扩增出237bp的扩增片段，或者用引物RM28486能够扩增出161bp的扩增片段，或者用引物IR2能够扩增出228bp的扩增片段，则标志着水稻品种抗褐飞虱基因位点Bph9的存在。
[0128]本发明还提供了一种筛选抗褐飞虱水稻的方法，其用上述的引物对之一进行PCR方法扩增待检水稻基因组DNA，如果用引物RM28438能够扩增出213bp的扩增片段，或者用引物InD28450能够扩增出22Ibp的扩增片段，或者用引物InD28453能够扩增出323bp的扩增片段，或者用引物InD28432能够扩增出320bp的扩增片段，或者用引物InD2能够扩增出241bp的扩增片段，或者用引物InD14能够扩增出397bp的扩增片段，或者用引物RM28466能够扩增出85bp的扩增片段，或者用引物RM28481能够扩增出237bp的扩增片段，或者用引物RM28486能够扩增出161bp的扩增片段，或者用引物IR2能够扩增出228bp的扩增片段，则标志着水稻品种对褐飞虱 抗性的存在。
[0129]本发明通过如下步骤克隆得到Bph9基因:
[0130]1.创建定位群体。利用抗褐飞虱水稻与普通水稻品种杂交，F1代自交获得&群体，作为抗褐飞虱基因定位群体。
[0131]2.抗褐飞虱鉴定。苗期集团法鉴定定位群体的抗褐飞虱性能。从F2代植株上收获种子，每份F2代植株收获的种子于秧盘中播种20棵苗(称为I个家系)。2叶I心期，放入2-4龄的褐飞虱若虫(10头/株)，记录各家系的受害情况，每份材料重复3次实验。根据抗虫鉴定结果，对定位群体株系的进行了抗虫级别的划分。
[0132]3.抗褐飞風基因定位。用PCR (polymerase chain reaction)和聚丙烯酰胺凝胶电泳，以及RFLP标记和Southern杂交的方法，检测F2各个单株的SSR和RFLP分子标记的分离情况，结合相应各家系的抗虫级别，应用JoinMap3.0和MapQTL5.0软件，构建水稻第12染色体的分子标记遗传连锁图，将Bph9定位在分子标记RM28438和RM28486之间。
[0133]4.加密目标区段分子标记与精细定位。根据国际水稻基因组计划公布的水稻基因组序列，设计第12染色体Bph9所在目标区段的SSR标记和InDel标记的引物，用PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳方法检测标记在BC2F2大群体中的分离，通过筛选得到的重组单株的表型与基因型的关系，将抗褐飞虱基因Bph9定位在分子标记InD2和InD18之间，与标记InD14紧密连锁。
[0134]5.候选基因确定。构建了含抗褐飞虱基因Bph9的抗性亲本水稻材料(Pokkali，IRGC 108921)基因组Fosmid文库，通过定位区间分子标记进行PCR筛选，得到了覆盖Bph9定位区间的阳性克隆，以双脱氧终止法(Sanger法)进行大片段测序，得到Bph9所在区段的基因组序列，应用RiceGAAS软件预测基因，并通过与日本晴和9311序列作对比分析，确定Bph9的候选基因。
[0135]6.根据序列设计引物进一步做共分离检测。根据Bph9候选基因序列设计引物，用PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法对BC3F2大群体进行检测，这些引物对应的标记与抗褐飞虱的表现型共分离，筛选得到了抗褐飞虱的水稻株系。
[0136]7.全长cDNA克隆。根据预测的cDNA序列，以3’末端的序列设计引物，从抗褐飞虱水稻的cDNA中扩得1692bp片段，以该段序列设计引物，通过RACE (cDNA末端快速扩增技术)得到了 cDNA的3’端和5’端序列，最终获得Bph9的全长cDNA。
[0137]然而，本领域技术人员应当理解，根据本发明公开的Bph9的核苷酸序列，通过设计恰当的PCR引物，即可从抗褐飞虱水稻基因组中扩增得到Bph9基因。
[0138]8.遗传转化Bph9基因验证其功能。根据Fosmid基因组文库筛选及测序结果，采用SalI和NcoI双酶切Bph9基因所在Fosmid克隆所得3026bp片段作为Bph9基因启动子区域(NcoI位点处为Bph9基因翻译起始密码子)。
[0139]利用NcoI和XhoI双酶切Bph9基因全长cDNA克隆获得3346bp片段，包括了 Bph9基因大部分ORF区域，也包括了其第3个外显子的大部分(XhoI位点位于第3外显子末端)。Bph9基因组序列长15628bp，具有2个内含子和3个外显子。其ORF长为3621bp，在3344bp处有一 XhoI位点，同时该XhoI位点位于第3外显子末端。利用XhoI和EcoRI双酶切Bph9基因所在Fosmid克隆获得了 1291bp的片段，该片段包括了第3个外显子XhoI位点后的部分、及Bph9基因转录终止子区域。将以上片段通过3段连接方式连入pGEM T easy载体的NcoI和EcoRI位点。用NcoI和EcoRI双酶切切出的4637bp片段即包括了 Bph9基因的完整ORF及其转录终止子区域。
[0140]将以上SalI和NcoI双酶切所得Bph9基因启动子区域(3026bp片段)、NcoI和EcoRI双酶切所得Bph9基因完整ORF及转录终止子区域(4637bp片段)，通过3段连接方式连入pCAMBIA1301的SalI和EcoRI位点。测序验证无误后，所得载体即为Bph9基因遗传转化载体(利用其启动子区域、完整0RF、及其转录终止子区域)，将其电转入农杆菌EHA105中。
[0141]采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将Bph9基因载体(利用其启动子区域、完整0RF、及其转录终止子区域)导入正常籼稻品种Kasalath中，最后获得Bph9阳性植株15株。用T1代Bph9转基因植株采用苗期集团法进行了抗虫鉴定，结果表明对照水稻Kasalath全部死亡，转基因阳性植株存活，抗虫级别为2_3级，证实Bph9基因具有抗褐飞虱的功能。因此，抗褐飞虱基因Bph9可以在水稻中应用也可以在水稻种子中应用，培育具有抗褐飞虱性能的水稻品种。
[0142]本发明的优点和效果:
[0143]1.本基因的成功克隆进一步证实了图位克隆法克隆水稻重要基因的可靠性，该方法克隆的基因其功能明确、效果好。
[0144]2.水稻中多个编码具有NBS结构蛋白的基因虽已被克隆，但大多与抗病性有关，本发明克隆的Bph9基因具有明显的抗褐飞虱性能，这对全面理解该类基因的生物学功能
有重要意义。
[0145]3.除Bphl4基因在2009年得到克隆外，国际上尚未克隆出其它的水稻抗褐飞虱基因，对水稻抗褐飞虱的分子机理仍不清楚。而本`发明克隆的Bph9基因能够显著提高水稻对褐飞虱的抗性，这对水稻抗褐飞虱的分子机理研究将有极大的推动作用。
[0146]4.Bph9使水稻抗褐飞風性能大大提高,通过遗传转化或杂交将Bph9应用于水稻育种中，可以改善水稻品种的抗褐飞虱性，从而减轻褐飞虱的为害，达到增产和稳产的目的。
[0147]5.刺吸式昆虫是农业生产中的一大类虫害，Bph9基因克隆和抗褐飞虱功能证实，对于其他植物的抗刺吸式昆虫研究具有重要参考作用。【专利附图】
【附图说明】
[0148]图1为苗期集团法鉴定F2:3家系中的抗虫植株和感虫植株结果图。图中所示P09-1至P09-16为抗褐飞虱亲本Pokkali (IRGC 108921，含抗褐飞虱基因Bph9)与褐飞虱感性水稻品种扬稻6号(93-11)杂交构建了含Bph9的F2群体中每个F2单株通过自交收种获得相应的F2:3家系。褐飞虱危害7天后，对照感性品种台中本地I号(TNl)明显死亡，图中显示P09-1、P09-2、P09-8、P09-11、P09-12、P09-13 F2:3家系在褐飞虱危害后存活，植株生长健康，为抗虫植株，图中所示P09-7、P09-9、P09-10 F2:3家系在褐飞虱危害后死亡，为感虫植株。
[0149]图2为SSR标记RM28486检测单株的电泳图。前两个泳道分别为抗虫亲本Pokkali(IRGC 108921)和感虫亲本扬稻6号(93-11)，后面为Pokkali与扬稻6号杂交构建的F23家系。如图显示，用与抗褐飞虱基因Bph9连锁的SSR标记RM28486能特异扩增出161bp片段的第2、3、5、6、8、10、12、14、15、18、19、20、21、23号F23家系对褐飞虱均表现出抗虫性，而不能扩出161bp特异性片段的第1、4、7、9、11、13、16、17、22、24号F23家系对褐飞虱均表现出感虫性。 [0150]图3为Bph9在水稻染色体的定位图。A:Bph9初步定位结果。染色体上边为标记名称，数值是标记间的遗传距离(cM)，QTL扫描结果表明在分子标记RM28486和RM28438之间有一个最大的LOD值44.1，RM28486和RM28438相距1.7cM。η代表F2定位群体单株数。
[0151]B:分子标记RM28486和RM28438间重组单株筛选结果。整合分子标记分析及抗褐飞虱表型结果Bph9精细定位在分子标记InD2和RM28466之间，与标记InD14共分离。分子标记下的数字代表相邻两个分子标记之间重组单株数。η代表用于重组单株筛选的BC2F2群体单株数。
[0152]C:InD2和RM28466之间的物理图谱，Bph9位于InD2和RM28466间约68kb的区域。19和544-22为相互重叠覆盖标记InD2和RM28466区间的Fosmid克隆。
[0153]图4为Bph9基因自身启动子、自身完整0RF、及其自身转录终止子区域转化载体转基因植株抗褐飞虱鉴定结果图。1、9代表感虫对照品种TN1，2代表抗性亲本Pokkali(IRGC108921)，3、5、7代表感虫对照品种Kasalath，4、6、8分别代表Bph9基因自身启动子、自身完整0RF、及其自身转录终止子区域转化载体转基因株系P0K1、P0K2和P0K3。苗期集团法放虫前(上图)和放虫后7天(下图)的比较，对照感性品种Kasalath与TNl明显死亡，而抗性亲本Pokkali (IRGC 108921)与转基因株系POKl、P0K2和P0K3仍然存活，植株生长健康。
[0154]图5为Bph9基因基因组互补载体转基因植株抗褐飞虱鉴定结果图。TO代转基因植株与感虫对照品种TNl按对角线移栽，移栽后4株组成一个类正方形形状，其中1、4代表感虫对照品种TN1，2代表Bph9基因基因组互补载体阳性TO代转基因植株PGK1，3代表Bph9基因基因组互补载体阳性转基因植株TO代PGK2。进入分蘖期后，接入100头2_3龄褐飞虱若虫,接入褐飞虱28天后，感虫对照品种TNl整株死亡，Bph9基因基因组互补载体阳性转基因植株PGK1、PGK2仍然存活，生长健康，无叶片受害。
[0155]图6为根据Bph9基因组序列开发的功能性分子标记IR2 (属于InDel标记)示例，其扩增片段长度为228bp。图中I代表携带抗褐飞虱基因Bph9的抗虫亲本Pokkali (IRGC108921)，2代表感虫材料扬稻6号(93-11)，3代表利用功能性分子标记IR2从Pokkali与扬稻6号回交后代中筛选出的携带抗褐飞虱基因Bph9的材料(该材料抗褐飞虱)。
[0156]图7为分子标记辅助选择培育带有Bph9基因的抗褐飞虱水稻图。苗期抗褐飞虱鉴定，虫源为武汉田间褐飞虱群体。图中1、5、9代表感虫对照品种TN1，2、6代表抗性亲本PokkaliCIRGC 108921 )，3、7代表感虫材料扬稻6号(93_11)，4、8代表珞扬9号(扬稻6号遗传背景携带抗褐飞虱基因Bph9)。苗期集团法放虫前和放虫后7天的比较，其中，上图为放虫前，下图为防虫7天后，对照感性品种TNl与受体亲本扬稻6号明显死亡，而抗性亲本Pokkali (IRGC 108921)与珞扬9号(扬稻6号遗传背景携带抗褐飞虱基因Bph9)仍然存活，植株生长健康。
[0157]图8为分子标记辅助选择培育带有Bph9基因的抗褐飞虱水稻图。苗期抗褐飞虱鉴定，虫源为褐飞虱生物型1、生物型II及生物型III。上图为虫源为褐飞虱生物型1、中图为生物型II及下图为生物型III。图中1、6代表感虫对照品种TNl，2、4代表珞扬9号(扬稻6号遗传背景携带抗褐飞虱基因Bph9)，3、5代表感虫材料扬稻6号(93-11)。放虫后感性受体亲本扬稻6号和台中本地I号明显死亡，而珞扬9号(扬稻6号遗传背景携带抗褐飞虱基因Bph9)仍然存活，植株生长健康。
[0158]图9为分子标记辅助选择培育带有Bph9基因的抗褐飞虱水稻图。近分蘖期抗褐飞虱鉴定，虫源为武汉田间褐飞虱群体。放虫后感性受体亲本扬稻6号和台中本地I号明显死亡，而珞扬9号(扬稻6号遗传背景携带抗褐飞虱基因Bph9)仍然存活，植株生长健康。
[0159]图10为分子标记辅助选择培育带有Bph9基因的抗褐飞虱水稻图。成熟期抗褐飞虱鉴定，虫源为武汉田间褐飞虱群体，放虫后感性受体亲本扬稻6号明显死亡，茎杆枯萎。而珞扬9号(扬稻6号遗传背景携带抗褐飞虱基因Bph9)仍然存活，茎杆挺拔，植株生长健康。
【具体实施方式】
[0160]以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0161]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0162]实施例1 Bph9基因的定位克隆及连锁分子标记开发
[0163]1.Bph9初步定位结果
[0164]抗褐飞虱亲本Pokkali (IRGC 108921，含抗褐飞虱基因Bph9)与褐飞虱感性水稻品种扬稻6号(93-11)杂交构建了含Bph9的F2群体，93-11和Pokkali (IRGC 108921)均来自中国农业科学院作物科学研究所国家农作物种质保存中心，并用CTAB法(MurrayMG&Thompson,1980 Rapid isolation of high-molecular-weight plant DNA.NucleicAcids Res 8:4321-4325)提取亲本及F2群体各单株的基因组DNA。每个F2单株通过自交收种获得相应的F2:3家系。为了鉴定F2定位群体中每个单株的抗褐飞虱表型，采用了苗期集团法考察F2:3家系各个单株的抗性表现(见图1)，以F2:3家系抗性级别代表F2单株的抗褐飞虱表型。为确保亲本和F2:3群体中的每个家系生长一致，所有供试材料在播种前分别浸种催芽。每个家系(品种)各60粒种子播种于一个长58cm、宽38cm、高9cm,且盛有7cm厚营养土的面包盒中。每盒每个材料播种3个重复，其中随机播种亲本和TNl (感性对照)各3个重复。播种7天后间苗，淘汰病弱苗。待苗长到两叶一心期时，按8头/苗的比例接种2-3龄褐飞虱若虫，最后罩上尼龙纱网。当感虫品种TNl (台中本地I号)全部死亡时，参照Huang等(Huang Z et al,2001 Identification and mapping of two brown planthopperresistance genes in rice.Theor.Appl.Genet.102，929 - 934)的方法对每个单株进行 0、
1、3、5、7或9级的抗性评价(表1)，对亲本材料和群体的每个家系通过加权平均计算该家系的抗性级别，并根据抗性级别推测此单株基因型。
[0165]表1抗感褐飞虱鉴定分级标准
[0166]
【权利要求】
1.一种分离的多核苷酸,其具有水稻抗褐飞風基因Bph9序列，所述序列是SEQ IDN0.1所示的核苷酸序列，或该序列经替换、缺失或增加一个或多个核苷酸，且编码相同或相似，且具有相同功能的氨基酸序列的核苷酸序列。
2.一种分离的多核苷酸，其具有水稻抗褐飞虱基因Bph9的cDNA序列，所述序列是SEQID N0.2所示的核苷酸序列，或该序列经替换、缺失或增加一个或多个核苷酸，且编码相同或相似，且具有相同功能的氨基酸序列的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的多核苷酸，其cDNA序列如SEQID N0.2所示。
4.权利要求1-3任一所述的多核苷酸编码的蛋白。
5.如权利要求4所述的蛋白，其具有SEQID N0.3所示的氨基酸序列。
6.含有权利要求1~3所述多核苷酸的载体。
7.含有权利要求6所述载体的宿主。
8.权利要求1~3任一所述多核苷酸在水稻选育中的应用。
9.权利要求1-3任一所述多核苷酸在提高水稻抗褐飞虱抗性中的应用。
10.权利要求1-3任一所述多核苷酸在制备转基因抗褐飞虱水稻中的应用。
11.水稻抗褐飞虱基因Bph9的分子标记，其可由下述之一的引物对经PCR扩增获得: 1)标记引物，RM28438标记引物: 正向引物序列 GTTCGTGAGCCACAACAAATCC 反向引物序列 GTTAAATGCTCCACCAAACACACC 2)标记引物，InD28450标记引物: 正向引物序列 GGTTGGAAAAGAAGCGATCA 反向引物序列 GCATCRTAAGGTTGCCATCA 3)标记引物，InD28453标记引物: 正向引物序列 GGCAAAGACAAGCCATAAGC 反向引物序列 ATCCATCAGCAATGACACGA 4)标记引物，InD28432标记引物: 正向引物序列 TGCAGACACCACATGCATAA 反向引物序列 ACGCATACACACAGGGACAA 5)标记引物，InD2标记引物: 正向引物序列 AACAGACACGTTGCGTCTTG 反向引物序列 CTTGCCGCTTAGAGGAGATG 6)标记引物，InD14标记引物: 正向引物序列 CCACTCTGAAAATCCCAAGC 反向引物序列 ACCAGTTAAGTCACGCTCAAA 7)标记引物，RM28466标记引物: 正向引物序列 CCGACGAAGAAGACGAGGAGTAGCC 反向引物序列 AGGCCGGAGAGCAATCATGTCG 8)标记引物，RM28481标记引物: 正向引物序列 GTCAATTAACCATTGCCCATGC 反向引物序列 TTCACGTGGGAACTACTCATGC9)标记引物，RM28486标记引物: 正向引物序列 TTCTCTGAATGCCCTGTCTCTCC 反向引物序列 GGCAAATCAGAACAAGTCTCACC。
12.如权利要求11所述的分子标记，还包括由InDel分子标记IR2的引物经PCR扩增获得，IR2标记引物为: 正向引物序列 AGGATGGGGAGAAGAAGACG， 反向引物序列 GTGTTCCTTGTCGGGTGTA。
13.权利要求12所述分子标记在选育抗褐飞虱水稻中的应用。
14.水稻抗褐飞虱基因bph9的分子标记方法，其通过下述之一的引物对扩增待检水稻基因组DNA，并检测扩增产物: 1)标记引物，RM28438标记引物: 正向引物序列 GTTCGTGAGCCACAACAAATCC 反向引物序列 GTTAAATGCTCCACCAAACACACC 2)标记引物，InD28450标记引物: 正向引物序列 GGTTGGAAAAGAAGCGATCA 反向引物序列 GCATCRTAAGGTTGCCATCA 3)标记引物，InD28453标记引物: 正向引物序列 GGCAAAGACAAGCCATAAGC 反向引物序列 ATCCATCAGCAATGACACGA 4)标记引物，InD28432标记引物: 正向引物序列 TGCAGACACCACATGCATAA 反向引物序列 ACGCATACACACAGGGACAA 5)标记引物，InD2标记引物: 正向引物序列 AACAGACACGTTGCGTCTTG 反向引物序列 CTTGCCGCTTAGAGGAGATG 6)标记引物，InD14标记引物: 正向引物序列 CCACTCTGAAAATCCCAAGC 反向引物序列 ACCAGTTAAGTCACGCTCAAA 7)标记引物，RM28466标记引物: 正向引物序列 CCGACGAAGAAGACGAGGAGTAGCC 反向引物序列 AGGCCGGAGAGCAATCATGTCG 8)标记引物，RM28481标记引物: 正向引物序列 GTCAATTAACCATTGCCCATGC 反向引物序列 TTCACGTGGGAACTACTCATGC 9)标记引物，RM28486标记引物: 正向引物序列 TTCTCTGAATGCCCTGTCTCTCC 反向引物序列 GGCAAATCAGAACAAGTCTCACC, 10)标记引物，IR2标记引物: 正向引物序列 AGGATGGGGAGAAGAAGACG,反向引物序列 GTGTTCCTTGTCGGGTGTA， 如果用引物RM28438能够扩增出213bp的扩增片段，或者用引物InD28450能够扩增出221bp的扩增片段，或者用引物InD28453能够扩增出323bp的扩增片段，或者用引物InD28432能够扩增出320bp的扩增片段，或者用引物InD2能够扩增出241bp的扩增片段，或者用引物InD14能够扩增出397bp的扩增片段，或者用引物RM28466能够扩增出85bp的扩增片段，或者用引物RM28481能够扩增出237bp的扩增片段，或者用引物RM28486能够扩增出161bp的扩增片段，或者用引物IR2能够扩增出228bp的扩增片段，则标志着水稻品种抗褐飞虱基因位点Bph9的存在。
15.—种筛选抗褐飞虱水稻的方法，其用权利要求11中所述的引物对之一 PCR方法扩增待检水稻基因组DNA，如果用引物RM28438能够扩增出213bp的扩增片段，或者用引物InD28450能够扩增出221bp的扩增片段，或者用引物InD28453能够扩增出323bp的扩增片段，或者用引物InD28432能够扩增出320bp的扩增片段，或者用引物InD2能够扩增出241bp的扩增片段，或者用引物InD14能够扩增出397bp的扩增片段，或者用引物RM28466能够扩增出85bp的扩增片段，或者用引物RM28481能够扩增出237bp的扩增片段，或者用引物RM28486能够扩增出161bp的扩增片段，或者用权利要求12所述的引物IR2进行PCR方法扩增待检水稻基因组DNA若扩增出228bp的扩增片段，则标志着水稻品种对褐飞虱抗性的存在。`
【文档编号】C07K14/415GK103667309SQ201210326386
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月5日 优先权日:2012年9月5日
【发明者】何光存, 陈荣智, 王洋, 荆胜利, 祝莉莉, 杜波 申请人:武汉大学