专利名称：水稻品种抗褐飞虱主基因Bph3的分子标记的制作方法
技术领域：
本发明提供了水稻品种抗褐飞虱主基因Bph3的分子标记方法，属于分子遗传学 领域，专用于水稻抗褐飞虱品种的选育与种质资源的利用。
背景技术：
水稻是我国的重要粮食作物。褐飞虱是一种水稻单食性害虫，属同翅目飞虱科。 通过口针吸食水稻茎秆韧皮部汁液，为典型的刺吸式害虫。严重时引起稻株下部变黑、腐烂 发臭、倒瘫，称之为“虱烧”，导致水稻减产或失收。目前，对褐飞虱的防治主要依赖于化学农 药，但此措施不但增加了生产成本，且污染环境，因此，最为经济有效而不造成污染的防治 措施是抗虫品种的应用。迄今，已发现和鉴定了 13个抗褐飞虱主基因。其中，显性基因6个， 艮口 Bph-I(Athwal et al. ,1971)、Bph_3(Lakshiminarayana and Khush,1977)、 Bph-6 (Kabirand Khush，1988)、Bph_9 (Ikeda et al. ,1985 ；Nemoto et al.，1989a)、 Bph-IO (t) (Multani et al. , 1994 ；Ishii et al.，1994)和Bph-13 (t)(刘国庆等，2001)。隐 性基因 7 个，即 bph-2 (Athwal et al.，1971)、bph_4 (Lakshiminarayana and Khush, 1977) > bph-5 (Khush et al.，1985)禾口 bph_7 (Kabir and Khush, 1988) >bph-8 (Ikeda, 1985 ；Nemoto et al.，1989a)、bph-11 (t)和 bph-12 (t) (Hirabayashi and Ogawa, 1999)。其他研究还进 行了抗褐飞虱的QTUquantitive trait locus，数量性状位点)定位研究，已鉴定了 26个 抗褐飞虱QTL。但真正用于水稻抗虫育种的抗褐飞虱基因并不多。国际水稻研究所自1973年先后选育了一系列分别携带Bph-I、bph-2和Bph_3等 抗褐飞虱主基因的水稻品种，在种植这些品种的地区有效地控制了褐飞虱的暴发。然而， 由于褐飞虱新生物型的产生，抗褐飞虱品种逐渐丧失抗性或面临抗性丧失的危险(Pathak and Khush,1979 ；Pathak and Saxena,1980 ；Heinrichs,1986 ；Saxena and Khan,1989 ； Heinrichs,1994 ；Gallagher et al.，1994)。我国也先后育成一系列含有抗褐飞虱基因 Bph-I的品种(组合)，对褐飞虱的防治起了积极的作用。吕仲贤等(2002)对1986 2000 年国家和浙江省育种攻关协作组提供的3328份水稻新品种(系)进行了抗褐飞虱鉴定和 筛选，结果发现从“七五”、“八五”到“九五”抗虫品种鉴出率呈下降趋势，水稻抗褐飞虱育 种未受到足够重视。目前，国内褐飞虱以生物型2为主，致害力强的孟加拉型生物型比例上 升，原来带有Bph-I的抗虫品种，已逐渐失去抗性，因而迫切需要培育新的携带多个抗性基 因的抗虫品种。由于抗虫性鉴定的复杂性，利用常规育种手段往往难以有效地聚合不同的抗虫基 因。而在找到与抗虫基因紧密连锁或共分离的分子标记的基础上，借助分子标记辅助选择 (Marker-assisted selection, MAS)技术则可以有目的地进行抗虫基因或QTL的聚合，选
3育持久抗性品种，延缓抗虫品种的退化年限和防止褐飞虱新生物型的发生。
发明内容
技术问题本发明的目的是提供了水稻品种Rathu Heenati抗褐飞虱主基因Bph3的分子标 记方法，通过检测与这些抗褐飞虱主基因连锁的分子标记，可以预测水稻植株的褐飞虱抗 性，加快抗褐飞虱水稻的选择进度。技术方案水稻品种抗褐飞虱主基因Bph3的分子标记方法，水稻品种Rathu Heenati对褐飞 虱的抗性由一个主基因Bph3控制，其特征在于用标记引物A4，
左端序列 AAGCAGCATAAACTGATTGA
右端序列 TCATCTTCTGAAAAAGCAAT
或者用标记引物RM16533，
左端序列 TTTGCTTAGTCGGCAGATGTCC
右端序列 CATAAGAACGTACCTCCACTGATTCC
或者用标记引物RH7841，
左端序列 TGCCAAGTATGTATGCCTAT
右端序列 TTTTAGAGACCGTGTCCTTG
或者用标记引物RH786，
左端序列 TTTGAAGTTCTTTCCATCTGA
右端序列 AAATGTGCTATCTGGGGTAAA
或者用标记引物RH007，
左端序列 CTTGCGTTCCGTAGGAGAAG
右端序列 TGAGTGTAACCCGAAGTGGC
扩增水稻抗褐飞虱品种或育种材料DNA，如果用引物A4能够扩增出193bp的扩增
片段，或用引物RM16533能够扩增出285bp的扩增片段，或用引物RH7841能够扩增出213bp 的扩增片段，或用引物RH786能够扩增出176bp的扩增片段，或用引物RH007能够扩增出 182bp的扩增片段，均标志着该水稻品种抗褐飞虱主基因Bph3的存在，该主基因位于水稻 第4染色体短臂上。有益效果本发明所提供的水稻品种抗褐飞虱主基因Bph3的分子标记方法，具 有以下优点(1)通过本发明在国际上首次用SSR标记精细定位了水稻品种Rathu Heenati中 的抗褐飞虱的主基因Bph3。(2)通过本发明分子标记定位的主基因位置明确，鉴定方便。通过检测这些与抗褐 飞虱基因连锁的分子标记，即可以预测水稻植株的褐飞虱抗性，用于水稻品种或品系的基 因型检测，以判断该品种或品系是否具有褐飞虱抗性，进而快速筛选抗病品种或品系用于 水稻育种。主基因位点的检测方便快速，不受环境影响；(3)辅助育种选择目标明确，节约成本。在传统育种方法中，首先要收集具有抗虫基因的亲本与栽培品种进行一系列杂交，而且要对褐飞虱抗性进行单株选择。对水稻抗褐 飞虱进行表型鉴定复杂，同时受环境影响，首先要获得虫源、饲养褐飞虱，此外要获得接种 虫源和水稻秧苗同步，非常困难，表型鉴定的结果可靠性低。因此抗虫育种不仅费时，而且 难度大，成本高。通过检测抗褐飞虱主基因位点，可以在苗期就鉴定出高抗褐飞虱的单株， 淘汰其它植株，不仅节约生产成本而且大大提高抗褐飞虱水稻的选择效率。
(4)同时可用于抗虫杂交品种的纯度鉴定和苗期快速鉴定。
四
图1水稻品种Rathu Heenati抗褐飞虱基因在染色体上的分布。
五具体实施例方式研究表明，抗褐飞虱基因资源主要存在于斯里兰卡和印度籼稻和野生稻种中 (Ikeda and Vaughau，1991)。Athwal et al. (1971)报道 Mudgo、C022 和 MTU15 携带同一 抗褐飞虱基因Bph-1，ASD7携带一个隐性抗虫基因bph-2。Athwal andPathak (1972)报道 MGL2 含有抗虫基因 Bph-1，Ptbl8 含有 bph_2。Martinez andKhush (1974)报道 IR747B2-6 含有 Bph-1，Rl 154-243 和 IR4-93 含有 bph-2。Lakshiminarayana and Khush (1977)报道斯 里兰卡抗虫品种Rathu Heenati由一个与Bph-I独立分离的显性基因Bph_3控制；而品种 Babawee则由一个与bph-2独立分离的隐性基因bph-4控制。Sidhu and Khush (1978)报道 携带Bph-3或bph-4的水稻品种对所有的褐飞虱生物型都表现抗性。泰国水稻品种Col. 5 Thailand和Col. 11 Thailand，缅甸水稻品种Chin Saba由同一个与bph_2和bph_4都不 等位的隐性抗虫基因bph-8控制(Ikeda，1985)。这些抗虫基因的鉴定和遗传研究为抗虫品 种的培育提供了基础，其中Bph-l、bph-2和Bph-3已被应用到抗虫育种中。但是，由于抗虫 性鉴定的复杂性，利用常规育种手段往往难以有效地聚合不同的抗虫基因。而在找到与抗 虫基因紧密连锁或共分离的分子标记的基础上，借助分子标记辅助选择(Marker-assisted selection, MAS)技术则可以有目的地进行抗虫基因和QTL的聚合，选育持久抗性品种，延 缓抗虫品种的退化年限和防止褐飞虱新生物型的发生。通过本发明抗虫水稻品种Rathu Heenati抗褐飞虱主基因和微效基因位点的鉴定 和分子标记的发现，特别抗褐飞虱主基因位点可用来指导抗褐飞虱水稻品种的选育工作， 用与之连锁的分子标记对抗虫品种进行筛选，使不同抗虫主基因位点快速聚合在同一个植 株中，从而大大提高育种效率。( 一 ) Rathu Heenati/02428F2 群体构建及表型鉴定(1)以抗褐飞虱品种 Rathu Heenati (Ikeda 和 Kaneda 1981，Jpn J Breed, 31 (3) 279-285)为母本，感褐飞虱粳稻品种02428 (邹江石等，中国农业科学，1989，22(1) :6_14) 为父本，配制杂种，构建了包含156个单株的Rathu Heenati/02428F2分离群体，每个F2单 株通过自交获得相应的Rathu Heenati/02428F2:3家系，进行抗虫鉴定。(2)采用苗期接种对亲本、Fl、F23进行抗虫性鉴定，褐飞虱为生物型1和生物型2 混合种群(Sim，LH等2005)。为确保亲本、F1和F2:3群体中的每个家系生长一致，所有供试 材料在播种前分别浸种催芽。每个家系(品种)分别取25粒种子播种于一个直径8. 5cm、 高9. Ocm,盛满营养土的圆形塑料钵中(钵底部有一小孔，便于渗透吸水)，株距为2. 5cm。各品种随机种植3钵。每28个塑料钵置于一个65CmX44CmX14Cm的塑料箱内(箱内保持 水层2cm左右)。播种7天后间苗，淘汰病弱苗，保留到每钵20株，待苗长到两叶一心期时 按10头/苗的比例接种2-3龄褐飞虱若虫，最后罩上尼龙纱网罩，当感虫品种Tm (Sun, LH 等2005)全部死亡时，参照Athwal等(1971)、IRRI (1988)和Huang等(2001)的方法对每 个单株进行0，1，3，5，7或9级的抗性评价(表1)，对亲本材料和群体的每个家系通过加权 平均计算该家系的抗性级别，并根据抗性级别推测此单株基因型。表1本研究所用的抗感褐飞虱评价标准
权利要求
水稻品种抗褐飞虱主基因Bph3的分子标记方法，水稻品种Rathu Heenati对褐飞虱的抗性由一个主基因Bph3控制，其特征在于用标记引物RM16533左端序列 TTTGCTTAGTCGGCAGATGTCC右端序列 CATAAGAACGTACCTCCACTGATTCC扩增水稻抗褐飞虱品种或育种材料DNA，如果用引物RM16533能够扩增出285bp的扩增片段，或用引物RH7841能够扩增出213bp的扩增片段, 则标志着水稻品种抗褐飞虱主基因Bph3的存在，该主基因位于水稻第4染色体短臂上。
全文摘要
本发明涉及水稻品种抗褐飞虱主基因Bph3的分子标记，属于遗传育种技术领域。对水稻抗虫品种RathuHeenati(♀)与感虫品种02428(♂)杂交获得的F2各单株的基因型和F2:3各家系的抗褐飞虱的抗性级别进行遗传连锁分析，获得抗虫品种RathuHeenati抗褐飞虱主基因Bph3。将该基因定位在分子标记A4和RM16533之间，且该区间的3个Indel标记RH784、RH786和RH007的选择效率均在97%左右。通过抗褐飞虱主基因的分子标记来检测抗虫品种RathuHeenati及其衍生品种(系)中是否含有该主基因，可预测其对褐飞虱的抗性水平，大大提高抗褐飞虱水稻的选择效率。
文档编号C12Q1/68GK101956019SQ20101053662
公开日2011年1月26日 申请日期2008年12月12日 优先权日2008年12月12日
发明者万建民, 何俊, 刘世家, 刘喜, 刘裕强, 吴寒, 江玲, 陈亮明 申请人:南京农业大学