专利名称：水稻对白背飞虱抗性的检测方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化学、分子生物学和水稻育种学领域，具体涉及水稻对白背飞虱抗性的检测方法及其应用。
背景技术：
水稻是我国的主要粮食作物之一，水稻种植过程中面临白背飞虱的严重威胁。白背飞虱是一种危害性大的水稻害虫，目前我国每年水稻稻飞虱(白背飞虱是其中一种)发生面积为2000万公顷以上，每年因稻飞虱危害造成的直接产量损失达280万吨以上。一直以来，白背飞虱的防治主要是依靠施用化学杀虫剂。杀虫剂的大量施用，往往导致生态环境的破坏、大量的白背飞虱天敌被消灭和害虫的抗药性提高，从而导致白背飞虱的“再猖獗”，给 防治带来更大的困难。实践证明培育抗性水稻品种是白背飞虱综合防治中最为经济、有效、安全、生态的方法。抗性资源在水稻育种上的利用主要是通过杂交和抗性鉴定进行将抗源的抗性转育到育种材料中，最终培育出抗性水稻品种，这种抗性鉴定需要饲养虫源和掌握鉴定的关键技术才能获得准确的鉴定结果。随着白背飞虱抗性鉴定的发展和分子标记定位，利用分子标记辅助选择鉴定抗性育种后代材料的方法也逐步被育种利用，但白背飞虱抗性遗传和机制复杂，目前在许多情况下分子标记辅助选择的效果还不很理想。植物中次生物质与抗虫性的关系早已有所了解。近年来，不少研究者研究了白背飞虱抗性与水稻植株次生物质的关系，表明水稻对白背飞虱的抗性与水稻植株上的次生物质的分泌存在一定的相关性。但这些相关性的认识还不够深入，利用单一种类的次生物质预测水稻对稻白背飞虱的抗性准确度往往较差，没有实用价值；因为次生物质的发生容易受环境的影响，单一一种次生物在不同地环境下变异辐度大，测量值在抗感材料之间出现交差，难以准确预测植株对稻白背飞虱的抗性。而综合利用多种次生物质进行抗性预测也还没建立起成熟可行的方法，主要表现在还没能确定那些次生物质组合在一起可以成为简单易行的准确预测方法。已有报道曾研究了水稻对白背飞虱的抗性与挥发性次生物质总量的关系，但需要考虑的次生物质种类多，把很多没相关的次生物也包含进去了，因而结果不准确，通过利用挥发性次生物质总量的方法预测植株对稻白背飞虱的抗性没有实用价值，而且过程复杂。到目前为止，已有的报道仍不能确定那几种次生物组合能准确预测植株对水稻白背飞虱的抗性。因此，通过技术优化，用尽量少种类、稳定性好的次生物质组合获得准确的预测结果成为本发明建立利用次生物质预测水稻对稻白背飞虱抗性的关键技术所在。
发明内容
本发明的目的是提供一种水稻对白背飞虱抗性的的检测方法及其应用，通过建立水稻对白背飞虱的抗性与水稻植株的挥发性次生物质含量的关系，利用6种关键的挥发性次生物质的平均含量差异预测水稻植株对白背飞虱的抗性，准确选择水稻育种材料中的抗性植株，提高水稻抗白背飞虱的育种效率。
本发明的技术方案水稻对白背飞虱抗性的的检测方法，其包括如下步骤(I)水稻植株挥发性次生物质的提取采用蒸馏的方法分别对白背飞虱感性亲本水稻和待测水稻进行挥发性次生物质的提取获得蒸馏液；然后萃取，取上层清液，除掉清液中的水分，得到白背飞虱感性亲本水稻清液和待测水稻清液；(2)对水稻6种挥发性次生物质的鉴定及定量分析将步骤(I)萃取得到的白背飞虱感性亲本水稻清液和待测水稻清液均采用气相色谱-质谱联用系统(GC-MS)分析鉴定，分析测定2-乙基呋喃、位于保留时间7. 5处的未知物、苯乙醛、间乙基苯甲醛、β -环柠檬醛和4-乙烯基-2-甲氧基-苯酚这6种特定挥发性次生物质的含量；(3)计算感性亲本水稻与待测水稻6种挥发性次生物质的比值分别测定出白背飞虱感性亲本水稻与待检水稻6种特定挥发性次生物质中每一种的含量比值；(即每一种挥发性次生物质的含量比值=感性亲本的含量/待检水稻的含量，单位为倍数)·(4)计算感性亲本水稻植株与待测水稻植株的6种挥发性次生物质含量比值的平均数；(即含量比值的平均数=6种挥发性次生物质含量比值之和/6)(5)确定水稻是否具有对白背飞虱的抗性，当感性亲本水稻植株与待测水稻植株6种特定挥发性次生物质含量比值的平均数> I. 7时，可确定待测水稻对白背飞虱具有抗性。所述步骤(I)的蒸馏方法是取少量水稻叶片加水，在10(ni0°C进行蒸馏，收集蒸馏液，加入有机溶剂进行萃取，取上层清液，并除掉清液中的水分，过滤备用；所述萃取采用的有机溶剂为正己烷等，所述除掉清液中的水分中采用的除水剂为无水硫酸钠等。所述GC-MS分析的条件为气相色谱条件SupelCOCV1701柱；进样口温度25(T270°C;柱温初始60°C，保持2 3min ;然后以2V /min速率升至120°C;保持2 3min ;再以4°C /min速率升至190°C，保持2(T25min ;质谱条件为载气采用高纯He气，流量为I 2mL/min ;离子源为EI ;电子能量70eV ;扫描质量范围为45-350 ;采用分流进样，分流比10 1 ；进样量为I μ L ;传输温度27(T290°C，离子源温度21(T220°C。上述的挥发性次生物质的鉴定及定量分析也就是通过气相色谱-质谱联用系统(GC-MS)分析获得GC-MS总离子流色谱图(TIC)，图中各峰所代表的化学信息经计算机检索NIST谱图库兼顾色谱保留时间(min)确认，鉴定出6种特定挥发性次生物质，以其峰面积作为该物质的相对含量，即得出6种特定挥发性次生物质的含量。本发明在抗白背飞虱水稻育种中的应用。将本发明利用白背飞虱感性亲本水稻与待测水稻的6种挥发性次生物质含量比值的平均数作为抗白背飞虱植株的检测指标的水稻对白背飞虱抗性的的检测方法定义为“特定平均参数评判法”。本发明的检测方法中采用的这6种挥发性次生物质在植株中呈现稳定差异。这种在抗感植株间表现稳定差异的次生物质组合可有效地预测植株对稻白背飞虱的抗性，且准确率高。但采用最大差异的次生物质组合预测植株对稻白背飞虱的抗性不能获得稳定的准确结果。当用不同世代的育种材料在不同的时期取样进行次生物质含量分析，分别取8种和10种抗感材料间的次生物质含量进行相关性分析，相关性不显著，且不同取样的最大差异的8种和10种次生物质都不相同，因而用最大差异的次生物质组合的方法也无法建立有效的植株对稻白背飞虱的抗性的预测方法。本发明的“特定平均参数评判法”的应用范围广，适用性广，是一种不受抗性基因和遗传背景限制的准确有效的鉴定方法，特别适用于对抗性基因来源不清楚、遗传背景复杂、各种低中高世代的遗传材料对白背飞虱的抗性鉴别，其不仅限于利用抗性资源RathuHeenati (参考品种)育成的育种材料、品系或品种，也不仅限于高世代遗传稳定的育种材料、品系或品种，用含有各种不同抗白背飞虱基因的抗性资源如W2183和W2168 (均来源于本研究组收集的广西野生稻资源)、Rathu Heenati和IR64(均来源于IRRI的栽培稻资源)、WBPHR196和WBPHR198 (均来源于本研究组培育的栽培稻资源)与感虫品种杂交培育的从F2开始至遗传性稳定的高世代育种材料，用本发明预测水稻植株对白背飞虱的抗性都得到稳定的结果，所检测得到的抗性材料与采用白背飞虱虫源进行接虫鉴定的结果相一致。本发明的有益效果I、本发明的“特定平均参数评判法”适用性广，是一种不受抗性基因和遗传背景限 制的准确有效的鉴定方法，特别适用于抗性基因来源不清楚、抗性性状没有适用的分子标记或因遗传背景复杂用标记辅助选择难以准确鉴定抗性的各种低中高世代的遗传育种材料对白背飞虱的抗性鉴定。通过对育种材料进行检测，即可判断受检材料是否具有白背飞虱抗性，进而快速筛选抗虫品种或品系用于水稻育种，有助于缩短水稻品种的育种周期，有效地提高育种工作效率。2、本发明的方法为鉴别水稻植株对白背飞虱的抗性提供了新方法。3、在水稻抗白背飞虱育种过程中，当用常规的接虫鉴定的方法受到各种条件限制时，本发明的方法提供了一种有效的替代方法。4、本发明仅以6种特定挥发性次生物质为基准进行检测，其预测准确度高，相对简单易行。
图I是以Rathu Heenati为抗性亲本，TNl为感性亲本，杂交后代F5重组自交系、并以杂交亲本为对照进行的水稻对稻白背飞虱的接虫鉴定图；图I中间两个分别是抗性亲本RathuHeenati和感性亲本TNl (死亡)，其他成活的是抗性株系、死亡的是感性株系；图2是以W2183为抗性亲本，TNl为感性亲本的抗性候选植株接虫鉴定结果图；图2中间的RCK是抗性对照RH，2183是抗源W2183，SCK是感性对照TNl ；图3是以W2183为抗性亲本，TNl为感性亲本的感性候选植株接虫鉴定结果图；图3中间的两个分别是抗性对照RH和感性对照TNl。
具体实施例以下实例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件或遗传资源所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例I一、试验水稻的选择
建立水稻对白背飞虱的抗性鉴定和挥发性次生物质检测的群体将来源于菲律宾国际国际水稻研究所(IRRI)的感虫品种TNl与抗虫品种Rathu Heenati杂交，后代种植并连续自交4代，建立F5重组自交系群体。亲本和重组自交系群体用于抗白背飞虱鉴定和挥发性次生物质检测。二、水稻抗白背飞虱的接虫对照鉴定水稻抗白背飞虱鉴定将催芽后亲本TNl、Rathu Heenati和它们的重组自交系种子播在塑料盆(60cmX 40cmX IOcm)内，每盆播13行，每行30粒，每株系播一行，其中两行为抗虫对照Rathu Heenati和感虫对照TNl。当苗生长到3叶期时,进行接虫鉴定,平均每株苗接I 2龄若虫10头。当感虫鉴定品种TNl完全死亡时，开始对株系进行抗性定级，定级标准为I级不受害或第一叶稍变黄；3级第一、二叶变黄；5级第一至三叶变黄或植株呈现矮化；7级植株开始凋萎；9级植株死亡。平均抗性级别f 5. O为抗，5. Γ9. O为感虫，其中，I. O高抗(HR)，I. O 3. O为抗(R)，3. I 5. O为中抗(MR)，5. I 7. O为中感(MS)，7. I 9. O 为感(S)。 试验结果如图I所示，13株中有8株呈现抗性，5株呈现感性。抗性植株中，一株为抗性亲本，其中7株为杂交系。三、本发明水稻对白背飞虱抗性的检测方法I、水稻植株挥发性次生物质的提取待检测的亲本TNl、Rathu Heenati和它们的重组自交系材料种植在大田，在苗期(分蘖前期)每个植株取新鲜叶片约2. 0g。剪碎，置于蒸馏烧瓶中，加蒸馏水40ml，在10(Tll(rC下进行水蒸气蒸馏，收集蒸馏液至25ml。在蒸馏液中加入8ml正己烷，对收集液进行萃取，取上清液。用无水硫酸钠除去上清液的水分，过滤，转移至样品瓶中，用于GC-MS分析。2、对水稻6种挥发性次生物质的鉴定及定量分析( I)气质联用系统分析条件气相色谱条件SupelcoCV1701柱；进样口温度250°C ;柱温初始60°C、保持2 3min，然后以2°C /min速率升至120°C，保持2 3min ;再以4°C /min速率升至190°C，保持 20 25min。质谱条件为载气高纯He气，流量I 2mL/min ;离子源EI ;电子能量70eV ;扫描质量范围为45-350 ;分流进样，分流比10 1 ;进样量lyL ;传输温度27(T290°C，离子源温度 210^220 0C ο(2)水稻挥发性物质的鉴定与定量通过气相色谱-质谱联用系统(GC-MS)分析获得GC-MS总离子流色谱图(TIC)，图中各峰所代表的化学信息经计算机检索NIST谱图库兼顾色谱保留时间(min)确认及筛选，以此对水稻植株挥发物成分进行鉴定。以各物质的峰面积作为该物质的相对含量。分析测定2-乙基呋喃、位于保留时间7. 5处的未知物、苯乙醛、间乙基苯甲醛、β -环柠檬醛和4-乙烯基-2-甲氧基-苯酚这6种特定挥发性次生物质的含量。3、计算感虫品种TNl与重组自交系群体上述6种挥发性次生物质中每一种的含量比值；(即每一种特定挥发性次生物质的含量比值=感性亲本的含量/待检水稻的含量，单位为倍数)4、计算当感性亲本(TNl)植株与待测植株6种挥发性次生物质含量比值的平均数；即含量比值的平均数=6种挥发性次生物质含量比值之和/6。5、确定水稻是否具有对白背飞虱抗性，当感性亲本(TNl)植株与待测植株6种特定挥发性次生物质含量比值的平均数> I. 7时，可确定待测水稻对白背飞虱具有抗性。采用本发明的检测方法与抗虫对照鉴定结果一致，也是种植的13株中也是相对应的8株(其中一株为抗性亲本)的6种特定挥发性次生物质含量比值的平均数> I. 7，其余的小于I. 7。说明本发明的检测方法稳定、可靠、准确度高。实施例2一、试验水稻的选择I、试验材料选取抗白背飞虱资源W2183和W2168 (均来源于本研究组收集的广西野生稻资源)、 RathuHeenati和IR64 (均来源于IRRI的栽培稻资源)、WBPHR196和WBPHR198 (均来源于本研究组培育的栽培稻资源)感虫品种资源TN1 (来源于IRRI的栽培稻资源)、特青2号(来源于广东农科院)、9311 (来源于江苏农科院)、187R (来源于本研究组培育的栽培稻资源)。二、采用本发明的方法对水稻对白背飞虱抗性的进行检测抗白背飞虱资源分别与感虫品种资源杂交，杂交后代分别自交和与感性亲本回交，建立各世代的自交系和回交系，各杂交组合从F2、F5JC1F2代群体中，各选50个植株(或株系)，进行抗性次生物质含量分析。具体检测的五步骤同实施例I中的“三、本发明的水稻对白背飞虱抗性的检测方法”。检测出来的6种特定挥发性次生物质含量比值的平均数> I. 7的为抗性候选植株，剩余的为感性候选植株。三、水稻抗白背飞虱的抗虫鉴定将通过本发明的检测方法检测出来的抗性候选植株及感性候选植株进行水稻抗白背飞風的接虫鉴定，将抗性植株和感性植株的种子分别播在塑料盆(60cmX40cmX 10cm)内，每盆播13行，每行30粒，每株系播一行，其中两行为抗虫对照和感虫对照。当苗生长到3叶期时，进行接虫鉴定，平均每株苗接I 2龄若虫10头。当感虫对照品种完全死亡时，开始对株系进行抗性定级，定级标准为I级不受害或第一叶稍变黄；3级第一、二叶变黄；5级第一至三叶变黄或植株呈现矮化；7级植株开始凋萎；9级植株死亡。平均抗性级别f 5. O为抗，5.广9. O为感虫，其中，I. O高抗(HR)，I. O 3. O为抗(R)，3. I 5. O为中抗(MR)，5. I 7. O为中感(MS)，7. I 9. O为感(S)。以W2183为抗性亲本，TNl为感性亲本的抗性候选植株及感性候选植株的抗虫鉴定结果如图2和图3所示。从图2可见，抗性候选株系表现全部抗白背飞虱；图2中间的RCK是抗性对照RH，2183是抗源W2183，SCK是感性对照TNl。从图3可见，感性候选株系表现全部不抗白背飞虱(图3)，图3中间的两个分别是抗性对照RH和感性对照TN1。用上述的方法在每个杂交组合的F2、F5和BC1F2各世代鉴定出2-10个候选抗性植株(或株系)，对这些植株(株系)进行白背飞虱抗性鉴定，结果显示，所有候选植株(株系)都抗白背飞虱。也就是说应用本发明的“特定平均参数评判法”预测的水稻对白背飞虱的抗性与实际鉴定结果完全一致(如表2所示)。表2应用“特定平均参数评判法”筛选出的抗白背飞虱候选植株(株系)对白背飞虱的抗性鉴定结果
权利要求
1.水稻对白背飞虱抗性的检测方法，其特征在于其包括如下步骤 (1)水稻植株挥发性次生物质的提取采用蒸馏的方法分别对白背飞虱感性亲本水稻和待测水稻进行挥发性次生物质的提取获得蒸馏液；然后萃取，取上层清液，除掉清液中的水分，得到白背飞虱感性亲本水稻清液和待测水稻清液； (2)对水稻6种挥发性次生物质的鉴定及定量分析将步骤(I)萃取得到的白背飞虱感性亲本水稻清液和待测水稻清液均采用气相色谱-质谱联用系统(GC-MS)分析鉴定，分析测定2-乙基呋喃、位于保留时间7. 5处的未知物、苯乙醛、间乙基苯甲醛、β -环柠檬醛和4-乙烯基-2-甲氧基-苯酚这6种挥发性次生物质的含量； (3)计算感性亲本水稻与待测水稻6种挥发性次生物质的比值分别测定出白背飞虱感性亲本水稻与待检水稻6种挥发性次生物质中每一种的含量比值； (4)计算感性亲本水稻与待测水稻6种挥发性次生物质含量比值的平均数； (5)确定水稻是否具有对白背飞虱的抗性，当感性亲本水稻与待测水稻6种特定挥发性次生物质含量比值的平均数> I. 7时，可确定待测水稻对白背飞虱具有抗性。
2.根据权利要求I所述的水稻对白背飞虱抗性的的检测方法，其特征在于所述步骤(I)的蒸馏方法是取少量水稻叶片加水，在10(Tl 10°C进行蒸馏，收集蒸馏液，加入有机溶剂进行萃取，取上层清液，并除掉清液中的水分，过滤备用。
3.根据权利要求2所述的水稻对白背飞虱抗性的的检测方法，其特征在于所述萃取采用的有机溶剂为正己烷，所述除掉清液中的水分中采用的除水剂为无水硫酸钠。
4.根据权利要求I所述的水稻对白背飞虱抗性的的检测方法，其特征在于所述GC-MS分析的条件为气相色谱条件SupelCOCV1701柱；进样口温度25(T270°C;柱温初始60°C，保持2 3 min ;然后以2V /min速率升至120°C;保持2 3min ;再以4°C /min速率升至190°C，保持2(T25 min ;质谱条件为载气采用高纯He气，流量为f 2mL/min ;离子源为EI ;电子能量70 eV ;扫描质量范围为45-350 ;采用分流进样，分流比10 :1 ;进样量为I μ L ;传输温度270^2900C，离子源温度 21(T220°C。
5.根据权利要求I所述的水稻对白背飞虱抗性的的检测方法，其特征在于它在抗白背飞虱水稻育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了水稻对白背飞虱抗性的检测方法及其应用，该检测方法通过水稻植株挥发性次生物质的提取；对水稻6种挥发性次生物质的鉴定及定量分析；计算感性亲本水稻与待测水稻6种特定挥发性次生物质的比值；计算感性亲本水稻与待测水稻6种挥发性次生物质含量比值的平均数；确定水稻是否具有对白背飞虱抗性，当感性亲本水稻与待测水稻6种特定挥发性次生物质含量比值的平均数≥1.7时，可确定待测水稻对白背飞虱具有抗性。采用本发明的方法选择出来的结果稳定可靠，能够准确选择水稻育种材料中的抗性植株，提高水稻抗白背飞虱的育种效率。同时其适用性广，是一种不受抗性基因和遗传背景限制的准确有效的鉴定方法。
文档编号G01N30/02GK102901781SQ201210418568
公开日2013年1月30日 申请日期2012年10月26日 优先权日2012年10月26日
发明者韦民航, 李容柏, 方勇, 黄保亮, 王家堂, 周小河, 邓荣烈, 梁坤, 李斌, 李远新, 隆兴祥, 石耀嘉, 朱东福, 孙姣燕 申请人:广西亚航农业科技有限公司