一种快速检测灰飞虱体内水稻条纹病毒和水稻黑条矮缩病毒的方法
【专利摘要】本发明提供了一种快速同步检测昆虫介体灰飞虱体内水稻条纹病毒(RSV)和水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)的方法，属植物保护领域。根据水稻条纹病毒RNA4和水稻黑条矮缩病毒S2核苷酸序列设计三条引物：[A]RS-F，[B]RB-F，[C]RSRB-R，其中A/C组合检测水稻条纹病毒，B/C组合检测水稻黑条矮缩病毒。单头灰飞虱提取总RNA后，只需一个反应的RT-PCR，即可检测水稻条纹病毒和水稻黑条矮缩病毒两种病毒，实现了灰飞虱体内两种病毒的快速同步检测。相对于传统的一次RT-PCR反应检测一种病毒的方法，大大节约了成本，节省了时间，是一种快速、简便、灵敏、特异的检测方法。本方法可应用于田间灰飞虱群体带毒率的监测工作，也可应用于病毒与介体互作机制的相关研究工作。
【专利说明】一种快速检测灰飞虱体内水稻条纹病毒和水稻黑条矮缩病 毒的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种对介体昆虫灰飞虱体内水稻条纹病毒和水稻黑条矮缩病毒快速 同步检测的方法，属植物保护领域。
【背景技术】
[0002] 水稻条纹病毒（Rice stripe virus, RSV)是纤细病毒属（Tenuivirus)的典型成 员，其引起的水稻条纹叶枯病是水稻重要病害之一，在过去的数十年间，该病在我国以华东 稻区为主的广大稻区暴发流行，对水稻生产构成极大威胁。例如，2004年江苏省发病面积达 2355万亩，占江苏水稻种植面积的79%，成片水稻绝收，2005年达到2800万亩，并开始向 浙江、安徽、河南、山东、上海等周边省市蔓延，因其严重的危害性一度被称为水稻上的"癌 症"，引起了很大的社会反响。
[0003] 水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)，是水稻上一种 危害严重的病毒病，隶属于植物呼肠孤病毒科斐济病毒属（Fijivirus)，病毒粒体球状，田 间症状前期主要表现为植株矮缩，叶片浓绿，后期在叶片、叶鞘及茎杆上出现蜡滴状突起， 而后形成黑条，对水稻的产量影响很大，重病田甚至可导致无产量。除水稻外，该病毒还 可侵染玉米引起玉米粗缩病、侵染小麦引起小麦绿矮病，此外，还可侵染多种禾本科杂草。 1963和1966年水稻黑条矮缩病在中国江苏、上海、浙江一带流行，90年代在我国许多玉米 和水稻产区暴发流行，造成了严重损失。近年来该病在江浙地区蔓延发生，且呈日渐严重的 趋势，2008年仅江苏省发病面积就达400万亩，致使当地的水稻生产损失严重。
[0004] RSV和RBSDV主要由它们的共同介体昆虫灰飞風Laodelphax striatellus Fall6n传播，区别在于RSV可由灰飞虱经卵传播，而RBSDV不经卵传播。水稻条纹叶枯病的 典型症状为出现褪绿的条纹斑点或斑块，株高一般正常，而黑条矮缩病的症状为植株矮缩， 叶片浓绿，后期可见白色蜡滴状突起，而后形成黑条。两种病害在田间极易区分诊断，但介 体灰飞虱的带毒情况则无法直接鉴别，需借助生物学技术才能实现。田间灰飞虱群体带毒 率的预测预报和持续监测在水稻病毒病害的无害化综合防控中具有重要作用，对后续的防 控技术的采用能起到积极的指导作用。
[0005] 目前，昆虫介体内的植物病毒的鉴定方法主要有：生物学接种实验、血清学检测、 电镜观察及分子生物学检测。生物学接种实验是收集灰飞虱刺吸感病水稻品种，然后观察 水稻症状，不但工作量大，而且耗时长，例如黑条矮缩病的显症时间往往需要1个月。血清 学检测对抗体的依赖性高，需要高特异性抗体，目前RSV的单抗检测已比较成熟，而高效的 RBSDV抗血清还不成熟。电镜观察需要高值仪器设备，且不适合大量样品检测，一般应用于 病原特性的研究工作。当前应用较多的还是以RT-PCR技术为主的分子生物学检测法，之前 也有报道使用RT-PCR的方法检测RSV和RBSDV，但尚未报道能同步检测RSV和RBSDV的技 术方法，本方法只需一次RT-PCR即可实现两种的病毒鉴别，在保证可靠性和灵敏性的前提 下，简化了操作，节省了成本和时间。
【发明内容】
[0006] 本发明填补了在介体灰飞虱体内水稻条纹病毒和水稻黑条矮缩病毒快速同步鉴 别技术上的空白，提供了一种快速、简便、灵敏、特异的鉴别方法，可应用于田间灰飞虱群体 带毒率的监测工作以及病毒与介体互作机制的研究工作。
[0007] 1、引物设计：
[0008] 1)在 NCBI(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/sites/entrez ? db = nucleotide) 上下载已报道的水稻条纹病毒RNA4核苷酸序列（D10979, AF513505, EU931525, AJ871748， FJ602692, EU931521，EU931517, AF221834, AF221835, FJ602700)和水稻黑条矮缩病毒 S2 核苷酸序列（AJ409145，KC134290)，使用DNAstar-MegAlign软件的Clustal V方法进行序 列比对，发现RSV-RNA4与RBSDV-S2有一小段序列极为相似，利用该段相似区设计RSV和 RBSDV的共用引物，引物序列如下：
[0009] RSRB-R :5' -CCYATCACAAASAAATMAAAAT-3'
[0010] RS-F :5, -AGATCCAGAGAGAGTCACGGAAG-3，
[0011] RB-F : 5 ' -GTTCAAAGACAATACACTCAAAA-3 '
[0012] 2)引物配对及扩增目的核酸条带的大小如下：
[0013] 引物组合 检测病毒名称 目的片段大小
[0014] RS-F/RSRB-R 水稻条纹病毒 1114bp
[0015] RB-F/RSRB-R水稻黑条矮缩病毒414bp
[0016] 2、总 RNA 提取：
[0017] 1)取单头灰飞風置于1. 5mL离心管，加入250μ L Trizol reagent充分研磨，室温 放置5min ;
[0018] 2)加入50 μ L氯仿，混匀后静置3min ;
[0019] 3)4°C, 12000g，离心 lOmin ;
[0020] 4)取上层水相移入新的1. 5mL离心管，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min ;
[0021] 5) 4°C，12000g，离心 lOmin，弃去上清；
[0022] 6)加入1IHL701%乙醇洗漆沉淀，12000g，离心5min，弃上清；
[0023] 7)干燥RNA沉淀，加40 μ L DEPC处理水溶解沉淀，用NanoDrop2000C分光光度计 测定RNA的浓度和质量，-70°C保存。
[0024] 3、RT_PCR 扩增：
[0025] 1)反转录（RT)反应：
[0026] 取PCR管,加入样品：提取的总RNA3 μ L，随机引物（random hexamers) 1 μ L，DEPC 处理水5μ L，置于70°C下变性5min，立即取出冰浴lmin。再依次加入下列试剂：
[0027] 5xM-MuLV反转录酶缓冲液 3 μ? dNTP (lOmMeach) 1.5 μ?
[0028] RNase inhibitor (20 υ/μΙ>) 0.5 pL M-MuLV 反转录酶（200UVL) 1 μι
[0029] 42°C水浴 lh，70°C处理 5min，-20°C保存备用。
[0030] 2)聚合酶链式反应（PCR):
[0031] 以RT合成的第一链cDNA为模板，进行PCR扩增，反应体系如下：
[0032]
【权利要求】
1. 一种快速检测灰飞虱体内水稻条纹病毒和水稻黑条矮缩病毒的方法，其特征在 于：利用RSV-RNA4片段与RBSDV-S2片段之间的一段相似序列合理设计引物，RSRB-R : 5' -CCYATCACAAASAAATMAAAAT-3'，RS-F :5' -AGATCCAGAGAGAGTCACGGAAG-3'，RB-F : 5' -GTTCAAAGACAATACACTCAAAA-3'，其中 RS-F/RSRB-R 配对检测水稻条纹病毒（1114bp)， RB-F/RSRB-R配对检测水稻黑条矮缩病毒（414bp)，以实现灰飞風体内水稻条纹病毒和水 稻黑条矮缩病毒的快速同步检测。
2. 根据权利要求1所述的快速灰飞虱体内水稻条纹病毒和水稻黑条矮缩病毒的方法， 其特征在于反转录（RT)反应中使用随机引物（random hexamers), PCR扩增中的退火温度 为 46-48 °C。
【文档编号】C12Q1/68GK104141015SQ201410330961
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年7月9日 优先权日:2014年7月9日
【发明者】李硕, 季英华, 王喜, 周益军 申请人:江苏省农业科学院