利用dot-ELISA检测单头灰飞虱体内水稻条纹病毒的方法
【专利摘要】本发明提供一种利用dot-ELISA检测单头灰飞虱体内水稻条纹病毒的方法，属于植物保护领域。该发明通过对灰飞虱的采集和研磨后，利用水稻条纹病毒单克隆抗体，建立检测单头介体灰飞虱携带水稻条纹病毒的dot-ELISA体系。该检测方法灵敏度高、特异性强，适用于大批量的单头灰飞虱样品检测，且不需要特殊仪器设备，具有结果判定简单易行、检测结果便于长期保存等特点，可对田间灰飞虱携带水稻条纹病毒的带毒率进行大规模调查和检测，为田间水稻条纹叶枯病的爆发流行进行预测预报并采取相应的防控措施提供技术支撑。
【专利说明】利用dot-ELISA检测单头灰飞虱体内水稻条纹病毒的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用dot-ELISA检测单头灰飞虱体内水稻条纹病毒的方法，属于植物保护领域。
【背景技术】
[0002]水稻条纹病毒(/Pice stripeRSV)是引起水稻条纹叶枯病的病原物，自然界中可以由灰飞風(LaoofeTz)Aar str i at el lus、脊飞HUnkanodes白带飞風(K albifascia)和白条飞風(Terthron alboviiiaiw?)传播,但主要依靠灰飞風以持久方式经卵传给后代。水稻条纹叶枯病最早于1897年在日本关东发生，随后在俄罗斯、朝鲜、韩国、前苏联和乌克兰相继发生。我国自1963年首次在江苏南部地区发生后，迅速扩及到18个省(市、自治区)广大稻区,其中于江苏、安徽、河南、山东、云南、北京、上海、台湾等地爆发流行，全国年发生面积在133万hm2以上，严重的甚至颗粒无收。近年来该病在全国范围呈上升趋势，2004年，该病在江苏、安徽、河南、山东、云南大流行，发病面积达333万hm2以上，仅江苏发病面积就达160万hm2，占江苏水稻种植总面积的79%，发病率50%以上的重病田近5000 hm2，1333.3 hm2绝收，给当地的水稻生产造成毁灭性打击。因此对该病的早期预测预报及有效防控就显得尤为重要。
[0003]介体灰飞虱的带毒率与水稻条纹叶枯病的发生关系密切，快速且准确地检测灰飞虱体内的RSV对水稻条纹叶枯病的预测预报和病害防治等具有重要的意义。要准确探明田间灰飞虱的带毒率，需要对大批量单头灰飞虱进行带毒情况检测。通常对灰飞虱体内RSV的检测主要采用RT-PCR方法，但该方法所使用的仪器和试剂成本较高，需要专业人员进行操作，不利于大批量的样品检测，而dot-ELISA具有灵敏度高、特异性强、成本低等优点，适用于大批量的样品检测，且不需要特殊仪器设备，操作简便，结果判定简单易行。另外，通常的病毒检测中，样品检测前往往用重复使用的研钵进行研磨，由于一次只能对一个样品进行研磨，不但费时费力，而且每次样品研磨完毕后，必须对研钵、研棒等进行清洗消毒，否则容易造成样品间的交叉污染，导致结果的假阳性增加。当在对田间成百上千的灰飞虱样品进行检测时，清洗研钵研棒不但费时费力，而且很难保证清洗消毒的效果，无法保证检测结果的准确性。本发明所利用的高通量组织研磨仪可以在4分钟内最多对2 X 96个样本同时进行快速、有效的研磨，由于采用的是封闭式一次性离心管，有效的避免了样品交叉污染，而且由于采用研磨球进行研磨，使得样品的研磨相较于传统研磨方式更为均匀、充分，便于病毒从病组织中有效分离，极大地提高了检测的准确性和灵敏度，极大地节约了检测时间。
[0004]申请号为CN201210423231的专利公开了一种快速检测烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒的dot-ELISA的方法，该专利涉及到的番茄黄花曲叶病毒属于双生病毒科菜豆金色花叶病毒属)，其传毒介体烟粉虱是粉虱科小粉虱属昆虫，而本专利涉及的水稻条纹病毒是布尼亚科纤细病毒属病毒,其传毒介体灰飞風是飞風科灰飞風属，它们分属于不同的科、属，寄主不同，自身的生理特征不一样，没有同源性，没有共同点。所以本专利的发明不存在技术启示问题。
【发明内容】
[0005]为了克服现有技术中的不足之处，本发明提供了一种高效、灵敏、特异且低成本的利用dot-ELISA检测单头灰飞虱体内RSV的方法。
[0006]为了解决技术问题，本发明采用的具体步骤是:利用dot-ELISA检测单头灰飞虱体内RSV的方法包括以下步骤:
(1)灰飞虱的采集及保存:在田间采集灰飞虱，放入提前准备好水稻苗的培养瓶中备用；或直接将灰飞虱放入75%的酒精瓶中保存；将暂不进行检测的灰飞虱放入-20°C或_80°C冰箱中保存；
(2)灰飞風研磨:用灭菌牙签挑取单头灰飞風,置于干净并已装有3-5颗l-3mm小钢珠的1.5mL离心管中，每个离心管中加0.01 mo I/L PBS缓冲液后，放于高通量组织研磨仪中振荡研磨至明显组织消失；或者将单头灰飞虱放入1.5mL离心管中，每个离心管中加0.01mol/L PBS缓冲液后，用组织研磨棒捣碎至明显组织消失；研磨后把1.5mL离心管放到离心机中离心，使沉淀沉于底部取出上清待用；
(3)硝酸纤维素(NC)膜准备:用铅笔在NC膜外层纸上划线，使NC膜印上方格线痕迹，每格规格0.7X0.7cm，平整放入培养皿中央；
(4)取2μ L灰飞虱研磨液的上清液点到NC膜的方格中央；室温干燥20min ;重复点一次样，室温干燥；
(5)将NC膜浸入到能覆盖NC膜的含5%脱脂奶粉封闭液中，室温封闭；
(6)加入用含5%脱脂奶粉的PBST缓冲液稀释的RSV单克隆抗体至覆盖NC膜，37°C孵育；
(7)弃液体，加PBST缓冲液至覆盖NC膜，洗膜5-6次，每次3min，最后一次用PBS缓冲液洗；
(8)弃洗脱液，加入用含5%脱脂奶粉的PBST缓冲液稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG 二抗至覆盖NC膜，室温孵育；
(9)弃液体，加PBST缓冲液至覆盖NC膜，洗膜5-6次，每次3min，最后一次用PBS缓冲液洗；
(10)弃洗脱液，将NC膜用滤纸吸干或静置晾干后，放入能覆盖NC膜的底物显色液TMB中反应，避光静置3-10min ；
(11)待NC膜上的阳性对照呈现明显蓝色而阴性对照未显色时弃显色液终止反应；
(12)将已显色的NC膜放入能覆盖NC膜的ddH20中，漂洗Imin后晾干，记录结果并照相保存；
(13)检测结果判断:NC膜上的样品呈现蓝色，说明灰飞虱携带RSV;NC膜上的样品未显色时，说明灰飞虱未携带RSV ;根据阳性样品数/总样品数计算灰飞虱带毒率。
[0007]所述步骤(2)中，用PBS缓冲液研磨灰飞虱时，PBS缓冲液的用量为150-250 μ L ；高通量组织研磨仪的振荡频率为60Hz，振荡研磨时间为60-90s ;离心机离心条件为4°C，12000rpm,离心 3-lOmin。
[0008]所述步骤(5 )中NC膜封闭时间为30_90min。
[0009]所述步骤(6)中RSV单克隆抗体使用前，经过含5%脱脂奶粉的PBST缓冲液按1:5000-1:10000的比例稀释处理后，37 °C孵育30_90min。
[0010]所述步骤(8)中辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG 二抗使用前，经过含5%脱脂奶粉的PBST缓冲液按1:5000-1:20000的比例稀释处理后，37°C孵育30_90min。
[0011]本技术中所述的0.01 mo I/L PBS缓冲液为由3g十二水磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，8g氯化钠和0.2g氯化钾组成的混合液，定容至100mL,调pH至7.2 ；PBST缓冲液为含 0.05% Tween-20 的 0.01 mol/L PBS 缓冲液。
[0012]本发明的有益效果:提供了一种针对检测单头灰飞虱携带RSV的血清学方法，由于使用高度特异性的RSV单克隆抗体，该检测方法灵敏度高、特异性强，适用于大批量的样品检测，不需要特殊的仪器设备和昂贵的试剂，极大地节约了检测成本和检测时间，不需要特殊的专业人员即可操作。而且结果判定中显示蓝色的即为阳性结果，未显色即为阴性结果，非常简单可靠。利用本发明对田间灰飞虱的带毒情况进行调查，可实现对单头灰飞虱携带的RSV进行检测，能够准确计算出不同时期灰飞虱携带RSV的带毒率，为水稻条纹叶枯病在田间的流行爆发趋势进行早期预测预报并及时采取相应的防控措施提供技术支撑。而高通量组织研磨仪的使用，不但省时省力，有利于大批量样品的同步检测，而且能有效避免样品交叉污染，极大地提高了检测结果的准确性和灵敏度。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1是部分田间单头灰飞風RSV 毒率检测结果
图中:A1-F5是所检测的田间灰飞虱样品，A6、B6是阳性对照，C6是阴性对照【具体实施方式】:
下面结合附图1和实施例对本发明作进一步详细说明，以方便技术人员理解。
[0014]实施例一:以田间采集的灰飞虱样品进行单头灰飞虱携带RSV的检测，计算灰飞風的带毒率。
[0015]具体步骤如下:在田间用吸虫器采集灰飞虱30头并放入提前准备好水稻苗的瓶子中，以利于灰飞虱存活；把采集的灰飞虱放入_80°C超低温冰箱中保存。检测时用灭菌牙签挑取单头灰飞虱，置于干净并已装有3颗2_小钢珠的1.5mL离心管中，每个离心管中加150 μ L 0.01 mol/L PBS缓冲液后，放于振荡频率为60Hz的高通量组织研磨仪中振荡研磨60s至明显组织消失。将离心管放入离心机中4°C, 12000rpm下离心3min,上清待用。用铅笔在NC膜外层纸上划线，使NC膜印上方格线痕迹，每格规格0.7 X 0.7 cm，剪6 X 6格大小的膜平整放入直径为6cm的培养皿中央。取2 μ L样品上清液点到NC膜方格中央，并设置阳性、阴性对照，室温干燥20min。重复点一次样，室温干燥，同时吸取50 μ L样品上清提取RNA作为模板进行RT-PCR验证。等膜晾干后，加1mL 5%脱脂奶粉室温封闭30min。弃液体，加1mL含5%脱脂奶粉的PBST缓冲液和2 μ L的RSV单克隆抗体(即RSV单克隆抗体稀释了 5000倍)，37°C孵育30min。弃液体，加PBST缓冲液至覆盖NC膜，洗膜5次，每次3min，最后一次用PBS缓冲液洗；弃洗脱液，加1mL含5%脱脂奶粉的PBST缓冲液和2 μ L的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG 二抗(即辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG 二抗稀释了 5000倍)，室温孵育30min。弃液体，加PBST缓冲液至覆盖NC膜，洗膜5次，每次3min，最后一次用PBS缓冲液洗。弃洗脱液，将NC膜用滤纸吸干或静置晾干后，放入能覆盖NC膜的底物显色液TMB中反应，避光静置5min。待NC膜上的阳性样品呈现明显蓝色而阴性对照未显色时弃显色液终止反应。将已显色的NC膜放入能覆盖NC膜的ddH20中，放置Imin后晾干，记录结果并照相保存。检测结果显示，30头灰飞虱中共有11头灰飞虱显蓝色成阳性反应(如图1)，计算出灰飞虱的带毒率为36.67%，表明云南田间灰飞虱RSV的带毒率非常高，水稻条纹叶枯病发生流行的可能性非常大，需尽快采取防范措施。该dot-ELISA检测结果得到了RT-PCR的验证，证明本发明的检测结果真实可信。
[0016]实施例二:以温室饲养的灰飞虱样品进行单头灰飞虱携带RSV的检测，计算灰飞風的带毒率。
[0017]具体步骤如下:用吸虫器采集温室饲养的灰飞虱60头后，把灰飞虱放入-20°C冰箱中冷冻5min。用灭菌牙签挑取单头灰飞虱，放入1.5mL离心管中，每个离心管中加200 μ L0.01 mo I/L PBS缓冲液后，用组织研磨棒捣碎至明显组织消失。将离心管放入离心机中4°C,12000rpm下离心5min，上清待用。用铅笔在NC膜外层纸上划线，使NC膜印上方格线痕迹，每格规格0.7X0.7 cm，剪7X9格大小的膜平整放入直径为9cm的培养皿中央。取2 μ L样品上清液点到NC膜方格中央，并设置阳性、阴性对照，室温干燥20min。重复点一次样，室温干燥，同时吸取50 μ L样品上清提取RNA作为模板进行RT-PCR验证。等膜晾干后，加20mL 5%脱脂奶粉室温封闭60min。弃液体，加20mL含5%脱脂奶粉的PBST缓冲液和2.5μ L的RSV单克隆抗体(即RSV单克隆抗体稀释了 8000倍)，37°C孵育60min。弃液体，加PBST缓冲液至覆盖NC膜，洗膜6次，每次3min，最后一次用PBS缓冲液洗；弃洗脱液，加20mL含5%脱脂奶粉的PBST缓冲液和2 μ L的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG 二抗(即辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG 二抗稀释了 10000倍)，室温孵育60min。弃液体，加PBST缓冲液至覆盖NC膜，洗膜6次，每次3min，最后一次用PBS缓冲液洗。弃洗脱液，将NC膜用滤纸吸干或静置晾干后，放入能覆盖NC膜的底物显色液TMB中反应，避光静置5min。待NC膜上的阳性样品呈现明显蓝色而阴性对照未显色时弃显色液终止反应。将已显色的NC膜放入?泛復盖NC I吴的ddH20中，放直Imin后晚干，记录结果并照相保存。检测结果显不，60头灰飞虱中共有6头灰飞虱显蓝色成阳性反应，计算出灰飞虱的带毒率为10.00%。表明温室饲养的灰飞虱RSV带毒率较高，适合用来做进一步的传毒实验。该dot-ELISA检测结果得到了 RT-PCR的验证，证明本发明的检测结果真实可信。
[0018]实施例三:以温室采集的灰飞虱样品进行单头灰飞虱携带RSV的检测，计算灰飞風的带毒率。
[0019]具体步骤如下:用吸虫器采集温室饲养的灰飞虱79头后，把灰飞虱放入-20°C冰箱中冷冻5min。用灭菌牙签挑取单头灰飞風,置于干净并已装有5颗Imm小钢珠的1.5mL离心管中，每个离心管中加250 μ L 0.01 mol/L PBS缓冲液后，放于振荡频率为60Hz的高通量组织研磨仪中振荡研磨90s至明显组织消失。将离心管放入离心机中4°C，12000rpm下离心lOmin，上清待用。用铅笔在NC膜外层纸上划线，使NC膜印上方格线痕迹，每格规格0.7X0.7 cm，剪9X9格大小的膜平整放入直径为9cm的培养皿中央。取2 μ L样品上清液点到NC膜方格中央，并设置阳性、阴性对照，室温干燥20min。重复点一次样，室温干燥，同时吸取50 μ L样品上清提取RNA作为模板进行RT-PCR验证。等膜晾干后，加20mL 5%脱脂奶粉室温封闭90min。弃液体，加20mL含5%脱脂奶粉的PBST缓冲液和2 μ L的RSV单克隆抗体(即RSV单克隆抗体稀释了 10000倍)，37°C孵育90min。弃液体，加PBST缓冲液至覆盖NC膜，洗膜6次，每次3min，最后一次用PBS缓冲液洗；弃洗脱液，加20mL含5%脱脂奶粉的PBST缓冲液和I μ L的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG 二抗(即辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG 二抗稀释了 20000倍)，室温孵育90min。弃液体，加PBST缓冲液至覆盖NC膜，洗膜6次，每次3min，最后一次用PBS缓冲液洗。弃洗脱液，将NC膜用滤纸吸干或静置晾干后，放入能覆盖NC膜的底物显色液TMB中反应，避光静置lOmin。待NC膜上的阳性样品呈现明显蓝色而阴性对照未显色时弃显色液终止反应。将已显色的NC膜放入能覆盖NC膜的ddH20中，放置Imin后晾干，记录结果并照相保存。检测结果显示，79头灰飞虱中共有8头灰飞虱显蓝色成阳性反应，计算出灰飞虱的带毒率为10.13%。表明温室饲养的灰飞虱RSV带毒率较高，适合用来做进一步的传毒实验。该dot-ELISA检测结果得到了 RT-PCR的验证，证明本发明的检测结果真实可信。
[0020]结果表明:无论是用低倍数还是高倍数稀释的RSV单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG 二抗，本发明的方法均能在相同实验条件下从温室和田间单头灰飞虱样品中检测到RSV，而阴性对照均无假阳性结果发生，检测结果特异性强、真实可靠。由于采用高通量组织研磨仪及封闭式一次性离心管对样品进行研磨，既省时省力，又避免了样品间的交叉污染，还极大地节约了检测成本。因此本发明具有检测效率高、准确性高、特异性强、灵敏度高和成本低等优点，可应用于水稻或其他相关植物上发生的单头灰飞虱中RSV的高通量特异性检测，具有广阔的应用前景。
[0021]本发明通过实施例进行说明的内容，在不脱离本发明范围的情况下，还可以对本发明专利进行各种变换及等同代替，因此，本发明专利不局限于所公开的具体实施过程，而应当包括落入本发明专利权利要求范围内的全部实施方案。
【权利要求】
1.利用dot-ELISA检测单头灰飞虱体内水稻条纹病毒的方法，其特征在于，利用dot-ELISA检测单头灰飞虱体内水稻条纹病毒的方法包括以下步骤: (1)灰飞虱的采集及保存:在田间采集灰飞虱，放入提前准备好水稻苗的培养瓶中备用；或直接将灰飞虱放入75%的酒精瓶中保存；将暂不进行检测的灰飞虱放入-20°C或_80°C冰箱中保存； (2)灰飞風研磨:用灭菌牙签挑取单头灰飞風,置于干净并已装有3-5颗l-3mm小钢珠的1.5mL离心管中，每个离心管中加0.01 mo I/L PBS缓冲液后，放于高通量组织研磨仪中振荡研磨至明显组织消失；或者将单头灰飞虱放入1.5mL离心管中，每个离心管中加0.01mol/L PBS缓冲液后，用组织研磨棒捣碎至明显组织消失；研磨后把1.5mL离心管放到离心机中离心，使沉淀沉于底部取出上清待用； (3)硝酸纤维素(NC)膜准备:用铅笔在NC膜外层纸上划线，使NC膜印上方格线痕迹，每格规格0.7X0.7cm，平整放入培养皿中央； (4)取2μ L灰飞虱研磨液的上清液点到NC膜的方格中央；室温干燥20min ;重复点一次样，室温干燥； (5)将NC膜浸入到能覆盖NC膜的含5%脱脂奶粉封闭液中，室温封闭； (6)加入用含5%脱脂奶粉的PBST缓冲液稀释的水稻条纹病毒单克隆抗体至覆盖NC膜，37 °C孵育； (7)弃液体，加PBST缓冲液至覆盖NC膜，洗膜5-6次，每次3min，最后一次用PBS缓冲液洗； (8)弃洗脱液，加入用含5%脱脂奶粉的PBST缓冲液稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG 二抗至覆盖NC膜，室温孵育； (9)弃液体，加PBST缓冲液至覆盖NC膜，洗膜5-6次，每次3min，最后一次用PBS缓冲液洗； (10)弃洗脱液，将NC膜用滤纸吸干或静置晾干后，放入能覆盖NC膜的底物显色液TMB中反应，避光静置3-10min ； (11)待NC膜上的阳性对照呈现明显蓝色而阴性对照未显色时弃显色液终止反应； (12)将已显色的NC膜放入能覆盖NC膜的ddH20中，漂洗Imin后晾干，记录结果并照相保存； (13)检测结果判断:NC膜上的样品呈现蓝色，说明灰飞虱携带水稻条纹病毒；NC膜上的样品未显色时，说明灰飞虱未携带水稻条纹病毒；根据阳性样品数/总样品数计算灰飞風带毒率。
2.根据权利要求1所述，利用dot-ELISA检测单头灰飞虱体内水稻条纹病毒的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，用PBS缓冲液研磨灰飞虱时，PBS缓冲液的用量为150-250μ? ;高通量组织研磨仪的振荡频率为60Hz，振荡研磨时间为60-90s ;离心机离心条件为4°C，12000rpm,离心 3-lOmin。
3.根据权利要求1所述，利用dot-ELISA检测单头灰飞虱体内水稻条纹病毒的方法，其特征在于，所述步骤(5)中NC膜封闭时间为30-90min。
4.根据权利要求1所述，利用dot-ELISA检测单头灰飞虱体内水稻条纹病毒的方法，其特征在于，所述步骤(6)中水稻条纹病毒单克隆抗体使用前，经过含5%脱脂奶粉的PBST缓冲液按1:5000-1:10000的比例稀释处理后，37°C孵育30_90min。
5.根据权利要求1所述，利用dot-ELISA检测单头灰飞虱体内水稻条纹病毒的方法，其特征在于，所述步骤(8)中辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG 二抗使用前，经过含5%脱脂奶粉的PBST缓冲液按1:5000-1:20000的比例稀释处理后，37°C孵育30_90min。
6.根据权利要求1、2、4或5所述，利用dot-ELISA检测单头灰飞虱体内水稻条纹病毒的方法，其特征在于，所述的0.01 mol/L PBS缓冲液为由3g十二水磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，8g氯化钠和0.2g氯化钾组成的混合液，定容至100mL,调pH至7.2 ；PBST缓冲液为含 0.05% Tween-20 的 0.01 mol/L PBS 缓冲液。
【文档编号】G01N33/577GK104267186SQ201410544959
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年10月16日 优先权日:2014年10月16日
【发明者】李凡, 张水英, 李月月, 李梅蓉, 谭冠林, 杨耀珠, 马庆 申请人:云南农业大学