专利名称：一种快速提取单头灰飞虱rna的方法
技术领域：
本文发明一种快速提取单头灰飞虱RNA的方法，属于农业科学技术领域。
背景技术：
灰飞虱(Laodelphax striatellus Fall6n)是一种重要的农业害虫，其危害除刺吸稻株韧皮部汁液造成水稻生长迟缓、分蘖延迟、瘪粒增加外，更重要的是它能传播多种植物病毒，引起水稻、玉米、小麦等的病毒病，严重危害农业生产。灰飞虱传播的病毒主要为 RNA病毒，包括水稻条纹病毒(Rice stripe virus，RBSDV)、水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus, RBSDV)(Wheat rosette stunt virus, WRSV)等。 此外，灰飞虱还能携带一种小RNA病毒——Himetobi Pvirus (HiPV)。快速而准确地检测灰飞虱体内的RNA病毒对于病毒病的预测预报和病害防治、研究病毒与介体互作等方面具有重要的现实意义。目前昆虫体内RNA病毒的检测方法主要有两大类，一类是基于检测病毒核酸的方法，如RT-PCR等；另一类是利用特异性抗体进行免疫检测。基于检测病毒核酸的方法由于不需要制备病毒的特异性抗体，且具有检测灵敏度和精准度高、可对一种或多种病毒同时进行检测等优点而受到广泛使用。但不管是RT-PCR、 Real-time PCR，还是环介导等温扩增方法(RT-LAMP)，这些基于检测病毒核酸的方法在检测之前有个必需的步骤即提取灰飞虱RNA。常规提取灰飞虱RNA的方法是用液氮研磨虫体后，加入RNA提取试剂如Trizol等进行提取。这种方法存在的主要问题是灰飞虱虫体小， 灰飞虱体长仅为1.8 4. Omm，研磨虫体操作不方便，此外提取成本高，费时费力。市售的 Trizol试剂售价在6 10元/毫升。提取单头灰飞虱RNA需要的Trizol至少在300 μ L 以上，也即提取单头灰飞虱RNA时仅提取试剂就需2 3元，另还需购买氯仿、异丙醇、无水乙醇等试剂。通常完成一次RNA提取的时间至少为50分钟。针对以上问题，本文发明了一种快速提取单头灰飞虱RNA的方法，该方法操作简便，不需要Trizol等提取试剂，5min内即可完成提取过程，从而大大节省了检测成本，缩短了检测时间。
发明内容
本发明提供了一种快速提取单头灰飞虱RNA的方法。本发明的具体操作方法是将单头灰飞虱放入离心管中，加入IOOyL的无菌水， 用移液器吹打清洗灰飞虱，无菌水清洗2 3次后加入25 μ L的DEPC水，采用无菌的牙签将单头灰飞虱捣碎，12000g离心lmin，所得上清液即为灰飞虱RNA。采用本发明获得的灰飞虱RNA适用于灰飞虱体内RNA病毒的检测。在上述方法中， 用于提取RNA的水为DEPC水，可防止提取后RNA的降解，DEPC水的最少体积为15 μ L。离心率最小为8000g，离心时间最少为1分钟，离心率越高、离心时间越长则去除杂质的效果越好。对于灰飞虱体内含量较高的病毒，DEPC水的体积在25yL 200yL范围内对检测结果没有影响。离心后获得的上清液不能放置时间太长，最好离心后即进行反转录。本发明的灰飞虱RNA提取方法省略了常规RNA提取步骤，直接用牙签捣碎灰飞虱，使灰飞虱的RNA溶解到水中，离心后即得到灰飞虱的RNA(操作示意图见图1)。该提取方法不需要购买Trizol等化学试剂，仅需要DEPC水和牙签等低成本的物品，克服了检测成本高的问题，且操作简便，RNA提取时间由常规提取的50分钟以上减少到5min以内，显著提高了提取效率。
图1牙签碾磨示意2单头灰飞虱中直接检测RSV结果示意3单头灰飞虱中直接检测RBSDV结果示意4单头灰飞虱中直接检测HiPV结果示意5单头灰飞虱中同时检测RSV和HiPV结果示意图具体实施方法实例一检测单头灰飞虱体内的水稻条纹病毒(RSV)将单头灰飞虱装入200 μ L离心管，加入100 μ L无菌水清洗3次，用灭菌的牙签捣碎，12000g离心lmin，取10 μ L上清液进行反转录，采用RSV病毒的特异性引物RSV CP-F/ RSVCP-R进行PCR检测。反转录的具体操作步骤为在200 μ L离心管内加入IOyL上清液和IyL随机引物Random6，70°C放置5min后立即取出置于冰上放置lmin，依次加入5XM_MuLV反转录酶缓冲液 3 μ L、dNTPs (10mM/dNTP) 0· 5 μ L、RNase inhibitor (20U/ μ L) 0. 5 μ L、M-MuLV 反转录酶QOOU/μ L)0. 5μ L，42°C放置lh，70°C保温5min，即得到cDNA，可置于_20°C保存备用或直接用于PCR反应。PCR方法为按表1所示体系加入各组分所需的量。上游引物 RSV CP-F 的序列为5，-ATGGGTACCAACAAGCCAGCCAC-3，，下游引物 RSV CP-R 的序列为 5，-GTCATCTGCACCTTCTGCCTCGTC-3，，扩增的目标序列长度为966bp。加入各组分后按以下 PCR程序进行扩增94°C预变性5min ；94°C变性50s、58°C退火50s、72°C延伸90s，40个循环；最后72°C延伸lOmin。PCR结束后产物进行琼脂糖凝胶电泳。取8 μ L PCR产物经琼脂糖凝胶在0. 5 X TBE缓冲液和150V电压条件下电泳20min，在0. 5 μ g/mL的溴化乙锭(EB) 中染色lOmin，染色后于凝胶成像系统中观察。携带RSV的单头灰飞虱中可检测到966bp的电泳条带，如图2所示。
权利要求
1. “一种快速提取单头灰飞虱RNA的方法”的技术特征是不使用RNA提取试剂提取RNA， 单头灰飞虱用无菌水清洗2 3次，加入至少15 μ L的DEPC水，用无菌的牙签捣碎虫体，使灰飞虱RNA溶解在DEPC水中，转速8000g以上离心1分钟，获取的上清液即为灰飞虱RNA。
全文摘要
本发明提供一种快速提取单头灰飞虱RNA的方法，属于农业科学技术领域。单头灰飞虱RNA提取的常规方法是采用RNA提取试剂如Trizol等进行提取。这种方法存在的虫体不易碾磨，成本高，耗时长等缺点。本发明的快速提取方法采用无菌水清洗灰飞虱虫体，之后用牙签捣碎虫体，使灰飞虱RNA溶于DEPC水，离心获得灰飞虱RNA。与常规RNA提取方法相比，本发明的RNA提取方法操作简便，不需要购买昂贵的RNA提取试剂，大大减少了检测成本，节省了时间，是一种快速、经济而且便捷的提取方法。提取所得的灰飞虱RNA适用于对灰飞虱体内的一种或多种RNA病毒进行检测。
文档编号C12Q1/70GK102392018SQ20111037056
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月21日 优先权日2011年11月21日
发明者周彤, 周益军, 季英华, 张晓霞, 徐秋芳, 程兆榜 申请人:江苏省农业科学院