专利名称：全人源的抗人表皮生长因子受体的单链抗体及其应用的制作方法
全人源的抗人表皮生长因子受体的单链抗体及其应用技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种新的可与人表皮生长因子受体特异结合的高亲和力全人源单链抗体，能抑制表皮生长因子受体的活化，从而抑制高表达表皮生长因子受体肿瘤细胞A431的生长，是一种具有抗肿瘤活性的基因工程抗体。
背景技术：
正常细胞的增殖是通过各自的配体严格激活其生长因子受体来控制的，比如生长因子受体酪氨酸激酶。癌细胞也是在生长因子受体的激活下增殖的，但失去了正常增殖的严格控制。这种失控可能是由很多因素引起，比如生长因子的过度表达或生长因子受体的过度表达，以及由生长因子调控的生化途径的自发性激活。参与致癌的受体包括表皮生长因子受体，来源于血小板的生长因子受体，类胰岛素生长因子受体，神经生长因子受体和成纤维生长因子受体等。
人表皮生长因子受体(印idermal growth factor rec印tor，也称为HER-1或 Erb-Bl，本文称作“EGFR”)是170kDa的跨膜糖蛋白，是表皮生长因子受体家族中的四成员之一，其由c-erbB原癌基因编码，由胞外区、跨膜区及胞内区3部分组成。胞内区显示固有的酪氨酸激酶活性，跨膜区由一个亲脂性多肽螺旋构成；胞外区分成4个亚区，是EGFR 与配体(生长因子等)结合的部位。在非活性状态下EGFR受体与其配体结合后可形成同源或异源二聚体，受体胞内区发生磷酸化可以启动一系列胞内信号级联。EGFR结合包括以下各项的配体表皮生长因子(EGF)，转化生长因子-α (TGF-α)，双调蛋白，肝素结合 EGFQib-EGF)，β动物纤维素和印iregulin。EGFR及其配体是细胞信号传导系统的一部分， EGFR经由酪氨酸激酶介导的信号转导途径调节许多细胞过程，包括但不限于激活控制细胞增殖、分化、细胞存活、程序性细胞死亡、血管发生、有丝分裂发生和转移的信号转导途径。 研究表明，EGFR基因拷贝数增加或者过度表达，均能促进正常细胞的转化和恶性肿瘤的转移，EGFR的信号传导网络在肿瘤的形成和发展过程中占了重要的地位。已经发现它的表达在许多人类肿瘤，包括头和颈、乳腺、结肠、前列腺、肺和卵巢的癌中上调，过量表达的程度与不佳的临床预后相关。EGFR高表达的肿瘤预后差，容易转移、生存时间短。EGFR由于涉及到肿瘤形成，已经成为抗肿瘤治疗的特异性靶目标。
靶向EGFR药物主要由两类一类是直接作用于受体细胞内区段以防止信号传导的合成的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，主要包括吉非替尼、erlotinib等等；另一类是阻断配体结合到受体胞外功能域的单克隆抗体(MAb)，包括西妥昔单抗(cetuximab)等。
西妥昔单抗(Cetuximab，商品名Erbitux)是抗人EGFR的嵌合型IgGl单克隆抗体，它于2006年被美国食品药品管理局批准与依立替康联合或单独用药以治疗表达表皮生长因子受体的、对依立替康的化疗无效或耐受的转移结肠直肠癌患者。但Cetuximab是一个嵌合型抗体，仍未能达到人源化。因此，靶向EGFR胞外区的全人源抗体能降低免疫原性，另外分子量只有全长抗体的1/6的抗EGFR单链抗体可以通过E. coli发酵降低生产成本。发明内容
发明目的
本发明提供一种具有潜在医学和药学价值的全人源抗人EGFR的单链抗体。本发明单链抗体的特征为特异性结合人EGFR胞外区，在体外能够抑制表皮癌细胞A431的生长。
技术方案
一种全人源的抗人表皮生长因子受体的单链抗体，其特征在于
抗人表皮生长因子受体的单链抗体包括重链可变区域和轻链可变区域，并且重链可变域和轻链可变区域通过柔性肽连接，重链可变区域的氨基酸序列为SEQ ID N0:1;轻链可变区域为SEQ ID NO 2的氨基酸序列，柔性肽的氨基酸序列为SSGGGGSGGGGSGGSA，SEQ IDNO :9。
所述的抗人表皮生长因子受体的单链抗体，具有重链⑶R3域，该域包含SEQ ID NO 5的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列；所述的抗人表皮生长因子受体的单链抗体，具有轻链CDR3域，该域包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列。
所述的抗人表皮生长因子受体的单链抗体具有重链⑶R2域，该域包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列；所述的抗人表皮生长因子受体的单链抗体具有轻链CDR2域，该域包含SEQ ID NO :7的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列。
所述的抗人表皮生长因子受体的单链抗体具有重链⑶Rl域，该域包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列；所述的抗人表皮生长因子受体的单链抗体具有轻链CDRl域，该域包含SEQ ID NO :6的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列。
一种分离的核酸，其特征在于该核酸编码上述的抗体。
一种表达载体，含有上述的核酸。
一种重组宿主细胞，含上述的表达载体。
上述任一项的抗体或抗体片段的应用，选择性地与EGFR结合或抑制EGFR与EGFR 配体的结合或中和EGFR。
上述任一项的抗体片段，选自单链抗体、Fab、单链Fv、双抗体和三抗体。
上述任一项的抗体或抗体片段的偶联物。
所述的偶联物，含有抗肿瘤药物、靶组成部分或报告组成部分。
ElO-VH
1 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTC
1QVQLVQSGAEVKKPGSSVKV
VH-CDRl
61 TCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCC
21 S C K A S G G T F S S Y A ISffVRQA
VH-CDR2
121 CCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTAC4
41PGQGLEffMGG I I P I F G T A N Y
181GCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTAC
61AQKFQGRVTITADESTSTAY
VH-CDR3
241ATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGAACTCGG
81MELSSLRSEDTAVYYC ARTR
301CTTAAGCATCAGTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTC
101LKHQ WGQGTLVTV
ElO-VL
1 CTTTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGG
1LSSELTQDPAVSVALGQTVR
VL-CDRl
61 ATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCA
21 I T C Q G D SLRSYY ASffYQQKP
VL-CDR2
121 GGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGAC
41 GQAPVLVIY GKNN R P S G I P D
181 CGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCG
61 RFSGSSSGNTASLTITGAQA
VL-CDR3
241 GAAGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTCCGGTATTCGGCGGA
81 EDEADYYC NSRDSSGPV FGG
301 GGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT
101GTKLTVLG
发明进一步说明
本发明中全人源抗EGFR单链抗体基因序列全长711个核苷酸，预期有237个氨基酸。具有113个氨基酸的重链可变区(SEQ ID NO 1)和108个氨基酸的轻链可变区(SEQ ID NO :2)，通过16个氨基酸的柔性肽连接(SEQ ID NO 9)。
含有本发明表皮生长因子受体单链抗体基因的表达载体和宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增本发明单链抗体基因的任意片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明的另一个目的是提供一种可以表达和纯化上述抗表皮生长因子受体抗体的方法。
本发明通过噬菌体展示抗体库技术，以人EGFR胞外区蛋白为靶抗原，筛选得到一个能特异性结合EGFR的全人源单链抗体ElO ；用ImM IPTG诱导表达；利用渗透休克提取细菌周质蛋白，低温离心去除细胞碎片，将上清过镍亲和层析柱进行分离纯化；Western Blot 鉴定分离纯化得到的ElO ；细胞ELISA分析抗体和表皮癌细胞A431表面EGFR的结合作用； 检测单链抗体ElO对表皮癌细胞A431的生长抑制作用。
本发明得到的抗表皮生长因子单链抗体与表皮癌细胞A431表面表皮生长因子受体具有高特异性结合，体外抑制肿瘤细胞生长实验结果表明，本发明得到的单链抗体可以明显抑制肿瘤细胞的生长。本发明为治疗和诊断以表皮生长因子受体抗原的表达，特别是过量表达为特征的疾病提供了基于抗体的疗法，相关疾病包括但不限于自身免疫病和癌症。
图1是单链抗体ElO的结构示意图。
图2是ElO重组载体的酶切图谱。ElODNA由箭头标出，DNA大小以1Λ为单位。
图3显示SDS-PAGE蛋白质电泳图，描述发酵表达的ElO通过镍柱进行分离纯化的结果，泳道1为菌体周质提取物上清，泳道2 4为含50mM咪唑缓冲液洗涤镍柱结果，泳道 5 7为含IOOmM咪唑缓冲液洗脱镍柱获得的目的蛋白。
图4展示利用Wfestern Blot鉴定分离到的ElO。
图5展示ElO与表皮癌细胞A431表面EGFR的ELISA结合活性，以及空白 (A431+MPBS)、阴性(MPBS+E10)和抗体对照(A431+control scFv)。
图6是一曲线图，描述全人源抗EGFR单链抗体ElO对A431细胞的生长抑制作用。
以下借助非限制性实施例举详细描述本发明。对本领域技术人员而言，在不背离本发明精神的前提下对它所做的任何显而易见的改动，特别是对若干部件的等同替换，都构成对本发明专利权的侵犯，将承担相应的法律责任。
具体实施方式
实施例中涉及的百分比，其中固定试剂为重量体积百分比，液体试剂为体积百分比。
实施例1全人源抗EGFR单链抗体的筛选
以包被缓冲液(IOOmM Tris, NaCl 150mM, pH9. 0)稀释EGFR胞外区蛋白(购自北京义翘神州生物技术公司)至100μ g/ml ；取4ml加入到免疫管中，4°C包被过夜；次日，弃上清，PBS迅速洗管3次；2% MPBS (含有2%脱脂牛奶的PBS)，37°C封闭池；弃封闭液，用 PBS迅速洗管3次；将噬菌体抗体库(1012 IO13p. f. u) (Dana library,哈佛医学院捐赠) 悬浮于2%10^5并加入到免疫管中，室温反复倒转301^11后，于室温静置901^11以上； 以含有0. 1% Tween-20的PBS洗管10次，再以PBS洗管10次去除去污剂；加入Iml IOOmM 三乙胺(700 μ 1 7. 18mol/L三乙胺加入到50ml水中)，室温反复倒转孵育lOmin，进行特异性洗脱；0.5ml IM Tris (pH7. 4)用于迅速中和洗脱下来的噬菌体；中和后的噬菌体用于感染对数期的大肠杆菌TG1，进行扩增和制备，用于下一轮筛选。
实施例2抗EGFR单链抗体的可溶性表达及分离纯化
挑选测序正确的TGl菌株，收集噬菌粒，按常规操作(参照抗体药物工程，P51)感染表达菌株大肠杆菌HB2151，培养至0D600nm = 0. 8，加入终浓度ImM的IPTG，30°C诱导过夜，15% SDS-PAGE检测诱导表达的结果。
6000rpm，4°C离心15min，收集菌体；PBS重悬洗涤菌体一次，采用渗透休克法破碎菌体，即高渗溶液(50mM Tris-HCl，20 %蔗糖，ImM EDTA, pH8. 0)重悬菌体，缓慢搅拌IOmin， 4°C，9000g离心lOmin，倒出上清，用冰冷的5mM MgSO4重悬沉淀，缓慢搅拌10min，4°C， IOOOOg离心20min，将上清与上一步上清合并用于镍亲和层析(购自GE)，用不同浓度的咪唑洗涤杂蛋白，洗脱目的蛋白；15% SDS-PAGE检测收集的样品，_20°C保存目的蛋白，命名为E10，其氨基酸序列为SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2，由SEQ ID NO 9相连。
实施例3抗EGFR单链抗体的^festern Blot鉴定
纯化得到的ElO进行变性SDS-PAGE电泳，分离胶浓度为15% ;4°C，IOOmA恒流转印 2h，将蛋白转印到PVDF膜(购自Millipore)；转印结束，将膜在5% MTBS (含有5%脱脂牛奶的TBS)中室温封闭Ih ；用5% MTBS按1 2000稀释anti-His鼠抗体(购自Millipore)， 室温孵育 lh，TBS 洗涤 3 遍，每次 IOmin ；用 5% MTBS 按 1 5000 稀释 HRP-anti_Mouse 二抗(购自联科生物)，室温孵育lh，TBS洗涤3遍，每次IOmin ；用DAB显色，结果如图7所7J\ ο
实施例4可溶性单链抗体ElO的细胞ELISA
将表皮癌细胞A431 (购自中国科学院上海细胞库)消化，离心后重悬，1 X IO5包被酶标板过夜让细胞贴壁12h，分为4组，每组3个孔。次日，弃培养基，温PBS洗2次，充分干燥后，每孔加入50 μ 1 PBS配制的0. 25%戊二醛作用10 12min，弃固定液，PBS洗3次，每孔加入300μ1 5%脱脂奶粉(MPBS)4°C过夜封闭。次日PBS洗3次，按分组要求加入不同浓度抗体或者对照100 μ 1，37°C孵育2h，以含有0. 05% Tween20的PBS洗涤3次，再以PBS 洗涤3次。每孔加入100μ 1用5%MPBS 1 2000稀释的鼠抗His抗体，37°C孵育lh，以含有0.05% Tween20的PBS洗涤3次，再以PBS洗涤3次。加入100 μ 1用5% MPBSl 5000 稀释的HRP-偶联羊抗鼠IgG多克隆抗体，37°C孵育lh，以含有0. 05% Tween20的PBS洗涤3次，再以PBS洗涤3次。每孔加入100 μ 1底物液(100 μ g/mLTMB, IOOmmo 1/L乙酸钠， pH6. 0，每50mL缓冲液加入10 μ 1 30%过氧化氢)，室温孵育IOmin。每孔加入50 μ 1 5% (ν/ν)稀硫酸终止反应。测定OD65t^nOD45tl，以OD45tl值减去OD65tl值作为最后检测结果。Ρ/Ν =(阳性细胞孔A值-空白孔A值)/(阴性细胞孔A值-空白孔A值)> 2为阳性。
实施例5抗EGFR单链抗体对表皮癌细胞Α431的生长抑制作用
将Α431 细胞 IXlO4- 2X IO4 接种 96 孔细胞培养板，100 μ 1/ 孔，在 37°C 5% CO2 培养箱中培养24h后用0. 5%小牛血清培养基替换原培养基。将培养的A431细胞分为6组， 按照分组要求加入2倍梯度稀释的E10，继续培养48h，观察细胞生长状况后每孔加入Ilyl 的MTT，37°C继续培养4h，小心倾去上清，每孔加入150 μ 1 DMSO,在酶标仪570nm/630nm波长处测定光吸收值(0D值)，计算细胞增殖。ElO的生物活性由细胞生长的抑制率评价。抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)X 100%。权利要求
1.一种全人源的抗人表皮生长因子受体的单链抗体，其特征在于抗人表皮生长因子受体的单链抗体包括重链可变区域和轻链可变区域，并且重链可变域和轻链可变区域通过柔性肽连接，重链可变区域的氨基酸序列为SEQ ID NO 1 ；轻链可变区域为SEQ ID NO 2的氨基酸序列，柔性肽的氨基酸序列为SSGGGGSGGGGSGGSA。
2.根据权利要求1所述的一种全人源的抗人表皮生长因子受体的单链抗体，其特征在于所述的抗人表皮生长因子受体的单链抗体，具有重链CDR3域，该域包含SEQ ID NO 5 的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列；所述的抗人表皮生长因子受体的单链抗体，具有轻链CDR3域，该域包含SEQ ID NO 8的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的一种全人源的抗人表皮生长因子受体的单链抗体，其特征在于所述的抗人表皮生长因子受体的单链抗体具有重链CDR2域，该域包含SEQ ID N0:4的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列；所述的抗人表皮生长因子受体的单链抗体具有轻链CDR2域，该域包含SEQ ID NO 7的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列。
4.权利要求1所述的一种全人源的抗人表皮生长因子受体的单链抗体，其特征在于所述的抗人表皮生长因子受体的单链抗体具有重链CDRl域，该域包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列；所述的抗人表皮生长因子受体的单链抗体具有轻链CDRl域，该域包含SEQ ID NO :6的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列。
5.一种分离的核酸，其特征在于，该核酸编码权利要求1的一种全人源的抗人表皮生长因子受体的单链抗体。
6.一种表达载体，含有权利要求5所述的核酸。
7.—种重组宿主细胞，含有权利要求6所述的表达载体。
8.根据权利要求1 4任一项的抗体或抗体片段的应用，其特征在于选择性地与EGFR 结合或抑制EGFR与EGFR配体的结合或中和EGFR。
9.权利要求1 4任一项的抗体片段，选自单链抗体、Fab、单链Fv、双抗体和三抗体。
10.权利要求1 4任一项的抗体或抗体片段的偶联物。
全文摘要
本发明属基因工程抗体技术领域，具体地公开了一种全人源抗EGFR单链抗体E10、其制备方法及用途。本发明还公开了E10的重链可变区和轻链可变区免疫球蛋白分子的氨基酸序列，以及包含重链可变区和轻链可变区免疫球蛋白分子的氨基酸序列，包括对应于互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的序列。本发明还提供产生和表达E10的方法，从天然人源噬菌体抗体库中筛选获得了一株全人源抗EGFR单链抗体E10，后通过原核细胞分泌表达、亲和层析纯化获得单链抗体。本发明的单链抗体可特异性结合于人表皮生长因子受体(EGFR)，可以抑制表皮癌细胞A431的生长，可应用于制备诊断剂和治疗剂。
文档编号C12N15/13GK102504026SQ201110369620
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月21日 优先权日2011年11月21日
发明者周雅琼, 张娟, 王旻 申请人:中国药科大学