专利名称：一种适用于多糖多酚植物组织高质量rna快速提取方法
技术领域：
本发明涉及从植物组织中的快速提取高质量的RNA，特别是从多糖多酚的植物组织包括植物的果实中提取高质量RNA的试剂及方法。
背景技术：
富含多糖、多酚及次生代谢物的植物组织高质量RNA的提取较为困难，目前一般采用冷酚法、热酚法以及LiCl沉淀法。冷酚法步骤较多，整个过程需要保持低温状态；而LiCl沉淀法需沉淀过夜，耗时长、效率低。因此，找到一种适用于富含多糖、多酚及次生代谢物的植物组织高质量RNA快速提取的方法可以为开展此类植物分子生物学的研究奠定良好的基础。一些商品化的试剂盒大都是采用TRIZOL法，无法从富含多糖、多酚及次生代谢物的植物组织中获得高质量的RNA。有部分针对富含多糖、多酚植物组织RNA提取的专门试剂，但适用性不广，提取的RNA有基因组DNA污染，效果不甚理想。本发明的目的是克服现有从富含多糖、多酚及次生代谢物的植物组织中提取RNA方法的不足，提供一种新的提取方法高效、快速地从富含多糖、多酚及次生代谢物的植物组织中分离高质量RNA的方法。使用本发明提取的植物组织RNA质量高，适用于下游与基因表达有关的分子生物学实验，但在提取过程中，5S RNA丢失，所以本发明不适用于提取植物组织中的smallRNA (20 25nt)。
发明内容
本发明的目的是提供主要试剂及操作方法从富含多糖、多酚及次生代谢物的植物组织中快速提取高质量RNA用于下游分子生物学实验，提高实验成功率和实验效率。为实现上述目的，本发明的技术方案为提供一种适用于多糖多酚植物组织高质量RNA快速提取方法，其特征在于使用裂解液、沉淀液、重悬液按裂解-抽提-沉淀-重悬-抽提-沉淀流程提取RNA ；具体步骤如下(1)取多糖多酚植物组织于液氮中粉碎；(2)在2mL离心管加入1. 2mL 65°C预热的裂解液，加入液氮粉碎后的植物组织，振荡混勻；C3)加入600 μ L的氯仿和异戊醇的混合液，氯仿和异戊醇的体积比为M 1，振荡混勻，4°C以下，8000r/min，离心15min ；(4)取上清，加入400μ L沉淀液，混勻，-20°C沉淀0. 5 2小时后，4°C以下，12000r/min，离心 15min ；(5)弃上清，以500 μ L重悬液沉淀，加入500 μ L冰冷的水饱和酚(PH < 5. 0)，振荡混勻后冰上放置10min，4°C以下，12000r/min，离心15min ；(6)取上清，加入500 μ L氯仿与异戊醇的混合液，振荡混勻后冰浴10min，4°C以下，12000r/min,离心 15min ；(7)取上清，加入ImL无水乙醇，冰上沉淀30min，4°C以下12000r/min，离心15min ；(8)沉淀物以75%乙醇洗涤2次，风干，RNase free H2O溶解。较佳地，所述的裂解液由以下成分配制50mM Tris-HCl (PH 8. 0) (RNasefree H2O配制)；IOmM EDTA(PH 8.0) ；IM NaCl ；2% (ff/V)CTAB ；IOOmMLiCl ；2% PVP40(可以使用前加入)；2% β-巯基乙醇(使用前加入)。其中EDTA，NaCl，CTAB，LiCl均需用0. DEPC处理过夜。较佳地，所述的沉淀液由以下成分配制8M LiCl, 0. 1% DEPC处理过夜后灭菌。较佳地，所述的重悬液由以下成分配制0. 2M NaCl, 0. 1% DEPC处理过夜后灭菌。本发明的有益效果1、快速；2、高效；3、RNA质量高；4、无DNA污染本发明的优点可以从富含多糖、多酚及次生代谢物的植物组织中快速提取高质量的RNA。
图1 使用本发明试剂及方法从富含多糖、多酚植物组织中提取的RNA ；图2 香蕉叶片及根的RNA ；其中1、2为香蕉叶片RNA图；3、4为香蕉根RNA图；图3 香蕉、龙眼、番木瓜果肉RNA ；其中5、6为番木瓜果肉RNA图，7、8为香蕉果肉RNA图，9、10为龙眼果肉RNA具体实施例方式下面结合优选实施例对本发明作进一步说明，但本发明决不限于下述实施例。实施例1应用本发明试剂及方法提取香蕉叶片以及根部的RNA(1)从香蕉幼苗上取新鲜叶片及根各200mg于液氮中粉碎；(2)在2mL离心管加入1. 2mL 65°C预热的裂解液，加入液氮粉碎后的植物组织，振荡混勻；C3)加入600 μ L的氯仿和异戊醇的混合液，氯仿和异戊醇的体积比为M 1，振荡混勻，4°C下，8000r/min，离心 15min ；(4)取上清，加入400μ L沉淀液，混勻，_20°C沉淀0. 5 2小时后，4 °C以下，12000r/min，离心 15min ；(5)弃上清，以500 μ L重悬液沉淀，加入500 μ L冰冷的水饱和酚(PH < 5. 0)，振荡混勻后冰上放置10min，4°C以下，12000r/min，离心15min ；(6)取上清，加入500 μ L氯仿与异戊醇的混合液，振荡混勻后冰浴10min，4°C以下，12000r/min,离心 15min ；(7)取上清，加入ImL无水乙醇，冰上沉淀30min，4°C以下，12000r/min，离心15min ；荡混勻
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⑶沉淀物以75%乙醇洗涤2次，风干，RNasef ree H2O溶解。实施例二 应用本发明试剂及方法提取香蕉果肉的RNA
(1)取新鲜香蕉幼果IOOmg于液氮中粉碎；
(2)在2mL离心管加入1.2mL65°C预热的裂解液，加入液氮粉碎后的植物组织，振
C3)加入600 μ L的氯仿和异戊醇的混合液，氯仿和异戊醇的体积比为M 1，振荡混勻，4°C以下，8000r/min，离心15min ；(4)取上清，加入400μ L沉淀液，混勻，_20°C沉淀0. 5 2小时后，4 °C以下，12000r/min，离心 15min ；(5)弃上清，以500 μ L重悬液沉淀，加入500 μ L冰冷的水饱和酚(PH < 5. 0)，振荡混勻后冰上放置10min，4°C以下，12000r/min，离心15min ；(6)取上清，加入500 μ L氯仿与异戊醇的混合液，振荡混勻后冰浴10min，4°C以下，12000r/min,离心 15min ；(7)取上清，加入ImL无水乙醇，冰上沉淀30min，4°C以下，12000r/min，离心15min ；(8)沉淀物以75%乙醇洗涤2次，风干，RNasef ree H2O溶解。实施例三应用本发明试剂及方法提取龙眼果肉RNA(1)取新鲜龙眼果肉IOOmg于液氮中粉碎；(2)在2mL离心管加入1. 2mL 65°C预热的裂解液，加入液氮粉碎后的植物组织，振荡混勻；C3)加入600 μ L的氯仿和异戊醇的混合液，氯仿和异戊醇的体积比为M 1，振荡混勻，4°C以下，8000r/min，离心15min ；(4)取上清，加入400μ L沉淀液，混勻，_20°C沉淀0. 5 2小时后，4 °C以下，12000r/min，离心 15min ；(5)弃上清，以500 μ L重悬液沉淀，加入500 μ L冰冷的水饱和酚(PH < 5. 0)，振荡混勻后冰上放置10min，4°C以下，12000r/min，离心15min ；(6)取上清，加入500 μ L氯仿与异戊醇的混合液，振荡混勻后冰浴10min，4°C以下，12000r/min,离心 15min ；(7)取上清，加入ImL无水乙醇，冰上沉淀30min，4°C以下，12000r/min，离心15min ；(8)沉淀物以75%乙醇洗涤2次，风干，RNase free H2O溶解。实施例四应用本发明试剂及方法提取番木瓜果肉的RNA(1)取新鲜番木瓜幼果各IOOmg于液氮中粉碎；(2)在2mL离心管加入1. 2mL 65°C预热的裂解液，加入液氮粉碎后的植物组织，振荡混勻；C3)加入600 μ L的氯仿和异戊醇的混合液，氯仿和异戊醇的体积比为M 1，振荡混勻，4°C以下，8000r/min，离心15min ；(4)取上清，加入400μ L沉淀液，混勻，_20°C沉淀0. 5 2小时后，4 °C以下，12000r/min，离心 15min ；(5)弃上清，以500 μ L重悬液沉淀，加入500 μ L冰冷的水饱和酚(PH < 5. 0)，振荡混勻后冰上放置10min，4°C以下，12000r/min，离心15min ；(6)取上清，加入500 μ L氯仿与异戊醇的混合液，振荡混勻后冰浴10min，4°C以下，12000r/min,离心 15min ；(7)取上清，加入ImL无水乙醇，冰上沉淀30min，4°C以下，12000r/min，离心15min ；(8)沉淀物以75%乙醇洗涤2次，风干，RNase free H2O溶解。实施例五应用本发明试剂及方法提取木薯叶片、叶柄、根的RNA(1)取_80°C冻存的木薯叶片、叶柄、根各200mg于液氮中粉碎；(2)在2mL离心管加入1. 2mL 65°C预热的裂解液，加入液氮粉碎后的植物组织，振荡混勻；C3)加入600 μ L的氯仿和异戊醇的混合液，氯仿和异戊醇的体积比为M 1，振荡混勻，4°C以下，8000r/min，离心15min ；(4)取上清，加入400μ L沉淀液，混勻，_20°C沉淀0. 5 2小时后，4 °C以下，12000r/min，离心 15min ；(5)弃上清，以500 μ L重悬液沉淀，加入500 μ L冰冷的水饱和酚(PH < 5. 0)，振荡混勻后冰上放置10min，4°C以下，12000r/min，离心15min ；(6)取上清，加入500 μ L氯仿与异戊醇的混合液，振荡混勻后冰浴10min，4°C以下，12000r/min,离心 15min ；(7)取上清，加入ImL无水乙醇，冰上沉淀30min，4°C以下，12000r/min，离心15min ；(8)沉淀物以75%乙醇洗涤2次，风干，RNase free H20溶解。本发明方法提取的RNA质量检测及与Trizol法提取的RNA的对比1.方法1. 1采用NanoDrop 2000紫外分光光度计对实施例一、例二、例三、实施例四、实施例五中提取的RNA进行定量检测，各RNA样品的检测量都为IyL;1. 2以1Trizol提取_80°C冻存的木薯叶片、叶柄、根的RNA (操作方法见1Trizol试剂说明书)，取1 μ L RNA在NanoDrop 2000紫外分光光度计上进行检测。2.结果2. 1实施例一、例二、实施例三、实施例四中RNA定量检测结果，见表1 表IRNA定量检测结果(NanoDrop 2000紫外分光光度计，Factor = 40)
样品编号样品名禾尔浓度(ng/pL)OD 260/280OD 260/230Sample Type1ai-1.7-71236.72.082.38RNA2ai-3.7-714372.082.42RNA3br-1312.31.971.71RNA4br-21101.951.59RNA5papaya-1200.62.051.86RNA6papaya-2360.32.081.81RNA7bf-1161.82.022.29RNA8bf-2196.72.002.31RNA9longan-11172.012.31RNA10longan-2480.72.112.09RNA (ai-1. 7-7，ai_3. 7-7 为香蕉叶片 RNA ；br-1, br-2 为香蕉根 RNA ；papaya-1,papaya-2为番木瓜果肉RNA ；bf-1, bf-2为香蕉果肉RNA ；longan-Ι，longan-2为龙眼果肉RNA)从表1中可以看出，实施例一、例二、实施例三、实施例四提取到的RNA，其0拟60/280的比值处于1. 95 2. 11之间，0拟60/230的比值在1. 59 2. 42之间，RNA的质量均较高，没有明显的降解和酚、多糖和盐份的污染，适用于下游分子生物学实验。2. 2实施例五提取的RNA与Trizol法提取的RNA比较，结果见表2从表2可以看出，实施例五中使用本发明方法提取的木薯叶片、叶柄、根的RNA其0D260/280的值在2. 04 2. 10之间，0D260/230的值在2. 29 2. 37之间，说明RNA的质量很高；而使用iTrizol法提取的木薯叶片、叶柄、叶片的RNA其0拟60Λ80的值在1. 29 2. 08之间，0D260/230的值在0. 43 10. 27之间，说明RNA质量不高，有部分降解或酚、多糖以及盐份的污染，这样的RNA难以应用于下游分子生物学实验中。表2实施例五提取的RNA与Trizol法提取的RNA比较(NanoDrop 2000紫外分光光度(CL1，CL2, D5A03-L, D5A63-L 为叶片 RNA ；CSl, CS2, CD5-LS，D5A01-LS 为叶柄 RNA ；CRl，CR2, CR' 1, CR' 2 为根 RNA)
权利要求
1.一种适用于多糖多酚植物组织高质量RNA快速提取方法，其特征在于使用裂解液、沉淀液、重悬液按裂解-抽提-沉淀-重悬-抽提-沉淀流程提取RNA ；具体步骤如下(1)取多糖多酚植物组织于液氮中粉碎；(2)在2mL离心管加入1.2mL65°C预热的裂解液，加入液氮粉碎后的植物组织，振荡混勻；(3)加入600μ L的氯仿和异戊醇的混合液，氯仿和异戊醇的体积比为M 1，振荡混勻，4°C下，8000r/min，离心 15min ；(4)取上清，加入400μ L沉淀液，混勻，_20°C沉淀0. 5 2小时后，4°C以下，12000r/min,离心 15min ；(5)弃上清，以500μ L重悬液沉淀，加入500 μ L冰冷的水饱和酚(PH < 5. 0)，振荡混勻后冰上放置10min，4°C以下，12000r/min，离心15min ；(6)取上清，加入500μ L氯仿与异戊醇的混合液，振荡混勻后冰浴lOmin，4°C以下，12000r/min，离心 15min ；(7)取上清，加入ImL无水乙醇，冰上沉淀30min，4°C以下，12000r/min，离心15min；(8)沉淀物以75%乙醇洗涤2次，风干，RNasefree H2O溶解。
2.如权利要求1所述的适用于多糖多酚植物组织高质量RNA快速提取方法，其特征在于所述的裂解液由以下成分配制50mM Tris-HCl (PH 8. 0) (RNasefree H2O配制)；10mMEDTA (PH 8.0) ； IM NaCl ；2% (ff/V) CTAB ； IOOmM LiCl ；2% PVP40 ；2% β-巯基乙醇。
3.如权利要求1所述的适用于多糖多酚植物组织高质量RNA快速提取方法，其特征在于所述的沉淀液由以下成分配制8M LiCl, 0. 1% DEPC处理过夜后灭菌。
4.如权利要求1所述的适用于多糖多酚植物组织高质量RNA快速提取方法，其特征在于所述的重悬液由以下成分配制0. 2M NaCl, 0. 1% DEPC处理过夜后灭菌。
全文摘要
本发明公开了一种适用于多糖多酚植物组织的高质量RNA快速提取方法，具体步骤为65℃预热裂解液，加入液氮粉碎后的植物组织，振荡混匀后加入氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提；加入沉淀液到上清，离心弃上清；加重悬液重悬沉淀，分别以水饱和酚(pH＜5.0)和氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，离心取上清；加入无水乙醇沉淀，沉淀物以75％乙醇洗涤，风干，RNase free H2O溶解。本发明的有益效果在于1、可从富含多糖、多酚及次生代谢物的植物组织中成功提取高质量RNA；2、操作时间短；3、无DNA污染。本发明中采用的裂解液主要成分为CTAB、Tris-HCl、LiCl、EDTA、NaCl、PVP40；沉淀液的主要成分为LICl；重悬液的主要成分为NaCl。
文档编号C12N15/10GK102392017SQ201110370399
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月21日 优先权日2011年11月21日
发明者于晓玲, 彭明, 李文彬, 阮孟斌 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所