专利名称：接种水稻黑条矮缩病毒专用灰飞虱的获得方法
技术领域：
本发明涉及一种专用于接种水稻黑条矮缩病毒的灰飞虱的获得方法 及其在农业上的应用，属于农业科学技术领域。
背景技术：
水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)是一 种由灰飞虱传播的病毒病害，侵染水稻引发水稻黑条矮缩病，水稻一旦感 病便无收获。该病害自1963年在我国浙江省余姚县发现以来，上世纪主 要在浙江南部杣稻产区发生危害，而在江苏等粳稻主产区却鲜有发现。 2004年初水稻条紋叶枯病在江苏等省爆发成灾， 一批抗病品种迅速大面积 推广应用，对病害的整体防控便起到了关键的作用。可是进一步的研究表 明，这类水稻条紋叶枯病抗病品种对RBSDV的抗性普遍较差，由于同一病原引发的玉米粗缩病近年来也处于流行期为病害的发生提供了充足的毒 源，加之灰飞虱发生量的连年增加，植保专家预测水稻黑条矮縮病有发生 流行危害的潜在风险。果然RSV抗病品种推广两年后水稻黑条矮缩病便在 江苏等粳稻主产区发生流行，据江苏省植保站统计截止2007年病害已在 该省沿海、淮北及里下河的盐城、连云港、泰州、淮安、扬州和徐州等地 严重发生，当年发生危害的面积达30.8万亩，而2008年水稻黑条矮缩病 的发生面积则超过400万亩，病害爆发流行的态势一触即发。面对具有突发性和爆发性特点的病毒病害，筛选抗病品种应用于生产 是最为直接有效的方法，然而水稻黑条矮缩病和水稻条紋叶枯病同为依赖 灰飞虱传播的病毒病特点却给水稻黑条矮缩病的抗性鉴定方法增添了许 多困难。首先，由于当前水稻主产区大多发生水稻条紋叶枯病，灰飞虱可 以经卵传播其病原RSV，这使得田间灰飞虱往往同时携带有RSV和RBSDV，因此开展田间鉴定时水稻品种对水稻黑条矮缩病的抗性鉴定结果往往受 到RSV的干扰。其次，采用田间采集灰飞虱进行室内接种时，鉴定结果也会受到同样的影响。另外，采用室内饲毒接种方法鉴定品种抗性也有相似 的问题，田间采集的灰飞虱和饲毒使用的毒源都容易受到RSV的干扰。同 时，灰飞虱不能经卵传播RBSDV，这使得我们无法通过带毒成虫后代筛选 方法获得专用于接种RBSDV的灰飞虱。上述原因使得水稻黑条矮缩病的抗性品种选育工作受到极大的限制，迫切需要尽快发明一种专用于接种水稻 黑条矮缩病毒用的灰飞虱的方法，以协助建成水稻黑条矮缩病的抗性鉴定 方法，为水稻抗黑条矮縮病的资源发掘筛选、品种选育和遗传规律研究提 供基本的研究手段。发明内容本发明提供了一种专用于获得接种水稻黑条矮缩病毒使用的灰飞虱 的方法。本发明的原理是通过人工筛选获得不携带RSV的灰飞虱，将其在携带 RBSDV而不携带RSV的水稻上词喂获毒，再将灰飞虱转移至不携带病毒的 健康秧苗上喂养渡过病毒的循回期，进而获得只携带RBSDV而不携带RSV 且可以应用于RBSDV接种的灰飞虱。在上述方法中"不携带RSV的灰飞虱"是通过以下手段获得的。从田 间采集灰飞虱在不携带RSV的健康水稻上喂养，交配后单头雌虫单独产卵， 釆用免疫学方法或分子方法检测雌虫是否带毒，保留不带毒雌虫后代单独 饲养至2龄以上，随机抽取群体中10%以上的灰飞虱检测是否带毒，若不带毒则保留并单独伺养繁殖，以后每代次随机抽取群体中10%以上的灰飞 虱检测确保不带毒，即获得不携带RSV的灰飞虱。在上述方法中"携带RBSDV而不携带RSV的水稻植株"是通过以下手 段获得的。从田间采集的具有植株显著矮縮、平行于叶脉的短条状叶片皱 折和白色蜡滴状突起等水稻黑条矮缩病症状或人工接种RBSDV获得水稻植 株，采用免疫学方法或分子方法分别检测RBSDV和RSV，确认其携带RBSDV 和不携带RSV,即获得携带RBSDV而不携带RSV的水稻。所述用于饲毒的灰飞虱为1-3龄，饲毒时间为2-3天，饲毒后的循 回期为10天以上，可根据操作需要、环境温度和带毒水稻植株的差异进 行选择。所述获得的只携带RBSDV而不携带RSV且可以应用于RBSDV接种的灰 飞虱需通过以下方法确认。从渡过循回期的灰飞虱群体中随机抽取10%以 上的灰飞虱，采用免疫学方法或分子方法分别检测RSV和RBSDV，若全部 都不携带RSV，而有部分或全部携带RBSDV,则确认获得只携带RBSDV而 不携带RSV且可以应用于RBSDV接种的灰飞虱。本发明提供了一种专用于接种水稻黑条矮缩病毒的灰飞虱的获得方 法，利用其建立的水稻黑条矮縮病的品种抗性鉴定方法可以排除由于灰飞虱同时传播水稻条紋病毒引起的干扰，使鉴定结果更加客观准确，抗性评 价更加科学合理。这一鉴定方法可以应用于水稻品种资源的发掘鉴定、品 种抗性评价、抗病品种选育和抗性遗传规律研究等众多领域。
图1为接种水稻黑条矮缩病毒专用灰飞虱接种水稻品种华粳6号后症 状图(左边桶内为感染水稻黑条矮缩病毒植株，右边为正常植株)。具体实施方法实施例l，接种RBSDV用灰飞虱鉴定水稻品种抗性① 不携带RSV的灰飞虱的获得。2005年4-5月从江苏海安重病区中采集灰飞虱若虫，在感病品种武育 粳3号上进行饲养，交配后单头雌虫单独产卵，随机抽取群体中10%的灰 飞虱采用斑点免疫结合法检测雌虫带毒情况，保留不带毒雌虫的后代，以 后每代次随机抽取群体中10%的灰飞虱釆用斑点免疫结合法检测确保不 带毒，即获得不携带RSV的灰飞虱。② 携带RBSDV而不携带RSV的水稻植株的获得。2008年7月从江苏农科院试验田釆集具有植株显著矮缩、平行于叶脉的短条状叶片皱折和白色蜡滴状突起等水稻黑条矮缩病症状水稻植株，剪 取叶片釆用斑点免疫结合法分别检测RSV和RBSDV,筛选出只携带RBSDV而不携带RSV的植株，即获得携带RBSDV而不携带RSV的水稻。③ 灰飞虱的饲毒和循回期选取1-2龄①述灰飞虱为在②述水稻植株上饲毒2天，伺毒后的循回 期为13天，从群体中随机抽取10%的灰飞虱釆用斑点免疫结合法分别检测 RSV和RBSDV，结果显示检测灰飞虱均不携带RSV,而有部分灰飞虱携带 RBSDV,带毒率为55. 2%。④ 对水稻品种的接种鉴定将水稻品种华粳6号播于1000ml烧杯中，每杯播种30株苗，重复1次。待秧苗长至1.5-2.0叶时进行接种鉴定，接种前2天淘汰病弱苗，挑选生长 一致的幼苗25株用于接种鉴定。按每株苗3头计算所需虫量，接入③述灰 飞虱。每天赶虫两次以确保被测稻苗均匀获毒。48小时后移走全部灰飞虱, 再将稻苗移栽至大田，注意水肥管理。7天以后开始调查，每3天调查一次, 连续调查5次。调查标准参照水稻黑条矮縮病的典型症状具有植株显著 矮缩、平行于叶脉的短条状叶片皱折和白色蜡滴状突起等(图l)。结果表 明接种鉴定水稻有部分表现出水稻黑条矮缩病症状，而没有表现水稻条紋 叶枯病症状的，这表明上述获得的灰飞虱可以用于接种水稻黑条矮缩病 毒，且不会受到水稻条紋病毒的干扰，鉴定结果是有效的，可以用于水稻 品种抗性评价。试验结果如表l。表i重复鉴定株RSV发病株RBSDV发病株RBSDV发病率12501040%22101047.6%本发明主要服务于针对水稻黑条矮缩病开展的抗性资源筛选发掘、抗 病品种的鉴定与评价和抗性品种的选育。同时该项技术还可在植物抗病性 的遗传学和抗水稻黑条矮缩病毒转基因的研究工作中作为生物学检测方 法应用，将能够大大加快研究的进程。上述实施不以任何形式限定本发明。
权利要求
1、一种专用于接种水稻黑条矮缩病毒的灰飞虱的获得方法，其特征在于通过人工筛选获得不携带水稻条纹病毒的灰飞虱，将其在携带水稻黑条矮缩病毒而不携带水稻条纹病毒的水稻上饲喂获毒，再将灰飞虱转移至不携带病毒的健康秧苗上喂养渡过病毒的循回期，进而获得只携带水稻黑条矮缩病毒而不携带水稻条纹病毒的灰飞虱。
2、 1中所述不携带水稻条紋病毒的灰飞虱，其关键在于从田间采集 灰飞虱在不携带水稻条紋病毒的健康水稻上喂养，交配后单头雌虫单 独产卵，釆用免疫学方法或分子方法检测雌虫是否带毒，保留不带毒 雌虫后代单独饲养至2龄以上，随机抽取群体中10%以上的灰飞虱检 测确认不带毒。
3、 1中所述携带水稻黑条矮缩病毒而不携带水稻条紋病毒的水稻，其 关键在于从田间釆集的具有植株显著矮缩、平行于叶脉的短条状叶 片皱折和白色蜡滴状突起等水稻黑条矮缩病症状的或人工接种水稻 黑条矮缩病毒获得的水稻植株，釆用免疫学方法或分子方法确认其携 带水稻黑条矮缩病毒而不携带水稻条紋病毒。
4、 1中所述专用于接种水稻黑条矮缩病毒的灰飞虱，其关键在于用 于饲毒的灰飞虱为l-3龄，饲毒时间为2-3天，饲毒后的循回期为 IO天以上。
全文摘要
本发明公开了一种专用于接种水稻黑条矮缩病毒的灰飞虱的获得方法及其在农业上的应用。本发明的原理是通过人工筛选获得不携带水稻条纹病毒的灰飞虱，将其在携带水稻黑条矮缩病毒而不携带水稻条纹病毒的水稻上饲喂获毒，再将灰飞虱转移至不携带病毒的健康秧苗上喂养渡过病毒的循回期，进而获得只携带水稻黑条矮缩病毒而不携带水稻条纹病毒的灰飞虱。利用其建立的水稻黑条矮缩病的品种抗性鉴定方法可以排除由于灰飞虱同时传播水稻条纹病毒引起的干扰，使鉴定结果更加客观准确，抗性评价更加科学合理。这一鉴定方法可以应用于水稻品种资源的发掘鉴定、品种抗性评价、抗病品种选育和抗性遗传规律研究等众多领域。
文档编号A01K67/00GK101401562SQ20081023503
公开日2009年4月8日 申请日期2008年11月13日 优先权日2008年11月13日
发明者吴丽娟, 彤 周, 周益军, 季英华, 熊如意, 程兆榜 申请人:江苏省农业科学院