专利名称：灰飞虱从冷冻病叶中获得水稻黑条矮缩病毒的方法
技术领域：
本发明涉及一种灰飞虱从冷冻病叶中获得水稻黑条矮缩病毒的方法 及其在农业上的应用，属于农业科学技术领域。
背景技术：
水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)是一 种由灰飞虱传播的病毒病害，侵染水稻引发水稻黑条矮缩病，水稻一旦感 病便无收获。该病害自1963年在我国浙江省余姚县发现以来，上世纪主 要在浙江南部籼稻产区发生危害，而在江苏等粳稻主产区却鲜有发现。 2004年初水稻条紋叶枯病在江苏等省爆发成灾， 一批抗病品种迅速大面积 推广应用，对病害的整体防控便起到了关键的作用。可是进一步的研究表 明，这类水稻条紋叶枯病抗病品种对RBSDV的抗性普遍较差，由于同一病 原引发的玉米粗缩病近年来也处于流行期为病害的发生提供了充足的毒 源，加之灰飞虱发生量的连年增加，植保专家预测水稻黑条矮缩病有发生 流行危害的潜在风险。果然RSV抗病品种推广两年后水稻黑条矮缩病便在 江苏等粳稻主产区发生流行，据江苏省植保站统计截止2007年病害已在 该省沿海、淮北及里下河的盐城、连云港、泰州、淮安、扬州和徐州等地 严重发生，当年发生危害的面积达30.8万亩，而2008年水稻黑条矮缩病 的发生面积则超过400万亩，病害爆发流行的态势一触即发。
面对具有突发性和爆发性特点的病毒病害，筛选抗病品种应用于生产 是最为直接有效的方法，然而水稻黑条矮缩病和水稻条紋叶枯病同为依赖 灰飞虱传播的病毒病特点却给水稻黑条矮缩病的抗性鉴定方法增添了许 多困难。由于灰飞虱不能经卵传播RBSDV，以病苗对灰飞虱进行饲毒后必 须于当代进行接种使用，这就要求研究单位和育种单位需要尽量长的时间 保存有患病的水稻或小麦植株，用于饲毒。可是患病的水稻或小麦植株往 往在表现严重矮化，长势差，很难长期保存。这使得水稻黑条矮缩病的抗 性品种选育工作受到极大的限制，迫切需要发明一种水稻黑条矮缩病毒毒 源的保存的方法，既可以长期保存毒源，又可以方便的使灰飞虱获得病毒 用于接种，以协助建成更为便捷易行的水稻黑条矮缩病品种抗性鉴定方 法，为水稻抗黑条矮缩病的资源发掘筛选、品种选育和遗传规律研究提供基本的研究手段。
发明内容
本发明提供了一种灰飞虱从冷冻病叶中获得水稻黑条矮缩病毒的方法。
本发明的原理是预先采集携带水稻黑条矮缩病毒的植株叶片以冷冻方 法保存，通过伺喂的方法灰飞虱便能从冷冻病叶上获得水稻黑条矮缩病 毒，再将灰飞虱转移至不携带病毒的健康秧苗上喂养渡过病毒的循回期 后，即获得可应用于接种鉴定的携带水稻黑条矮缩病毒的灰飞虱。
在上述方法中"携带水稻黑条矮缩病毒的植株叶片"是通过以下手段 获得的。从田间釆集的具有植株显著矮缩、平行于叶脉的短条状叶片皱折 和白色蜡滴状突起等水稻黑条矮缩病或小麦绿矮病症状的植株，也可以是 人工接种获得水稻或小麦患病植株，采用免疫学方法或分子方法检测确认 其携带水稻黑条矮缩病毒，即获得携带水稻黑条矮缩病毒的植株叶片。
在上述方法中，冷冻保存叶片的温度是-2(TC至-8(TC。
所述用于饲喂的冷冻叶片在解冻后，放置于相对封闭的容器中，其可 以是以尼龙纱布封口玻璃杯或圆形开口塑料容器，要求有较好的空气流动 性确保灰飞虱存活，同时又可防止灰飞虱逃出容器。
所述用于饲毒的灰飞虱为1-3龄，饲毒时间为2-3天，饲毒后的循 回期为10天以上，可根据操作需要、环境温度和带毒水稻植株的差异进 行选择。
所述获得可应用于接种鉴定的携带水稻黑条矮缩病毒的灰飞虱需通过 以下两种方法确认。 一是从渡过循回期的灰飞虱群体中随机抽取10头以 上的灰飞虱，采用免疫学方法或分子方法检测是否携带水稻黑条矮缩病 毒，若全部或部分携带病毒，则确认获得。二是从渡过循回期的灰飞虱群 体中随机抽取一定数量的灰飞虱，釆用人工接种的方法接种感病水稻品 种，若接种后水稻品种表现出水稻黑条矮缩病症状或通过分子手段证实含 有病毒，则确认获得。
本发明提供了一种灰飞虱从冷冻病叶中获得水稻黑条矮缩病毒的方 法，利用其建立的水稻黑条矮缩病的品种抗性鉴定方法可以很好的克服灰 飞虱釆用患病植株获毒方法中患病植株难以长期保存的技术瓶颈，拓宽了 品种抗性鉴定时间。这一鉴定方法可以应用于水稻品种资源的发掘鉴定、 品种抗性评价、抗病品种选育和抗性遗传规律研究等众多领域。
图1为冷冻病叶饲毒灰飞虱示意图。
图2为获得水稻黑条矮缩病毒后灰飞虱单管单苗单虫接种水稻品种示 意图。
图3为接种水稻发病症状示意图(B为感染水稻黑条矮缩病毒植株，A
为正常植株)。
图4为接种水稻黑条矮缩病毒后水稻的RT-PCR检测示意图(M为 Marker III; CK为健康植株对照；1， 3， 7， 9为发病植株；2， 4， 6， 8,10， 12为 正常植株)。
具体实施方法
实施例1,灰飞虱从冷冻小麦病叶中获得水稻黑条矮缩病毒的方法
① 携带水稻黑条矮缩病毒的植株叶片的获得。
2009年5月于江苏郅州小麦重病区釆集具有典型"绿矮"症状的小麦。 参照Trizol (Reagent)说明书方法提取小麦总RM。根据已发表的RBSDV 的S9序列设计引物(引物由上海英俊生物技术公司合成)
R: 5' -GGATTACAACAHACACAMCGAAA-3'
Fl: 5' -GRTAGACAGGCAAAYMTAAGCGT -3'。
釆用RT-PCR检测确定病株是否携带水稻黑条矮缩病毒。反转录按照 M-MLV反转录酶(Promega)说明书进行。PCR扩增体系为cDNA模板3. 0 ^L, Taq plus酶0.5 pL， dNTP (每份IO mmol.L-l) 0.5 pL, 10 xPCR缓冲液 (含Mg2+) 2. 5 |iL, 5'端引物(10 pmol. L-1) 1. 0 |uL， 3'端引物(10 pmol. L-l)l. O(iL， ddH20 16. 5 pL，合计25pL。反应程序为95。C预变性5min; 94。C变性lmin; 51。C退火lmin; 72。C延伸lmin; 35个循环；最后72。C延 伸10min, 4'C保存，1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的目的条带(1118bp )。 同时釆用斑点免疫结合法(DIBA)确定病株不携带水稻条紋病毒(RSV)。 挑选出6株仅含有水稻黑条矮缩病毒的小麦植株后取其叶片保存于- 0'C
冰箱中。
② 饲毒用灰飞虱的获得
2008年4-5月从江苏农科院小麦田中采集灰飞虱若虫，在感病品种武 育粳3号上进行饲养，交配后单头雌虫单独产卵，随机抽取群体中10%的灰飞虱采用斑点免疫结合法检测雌虫带毒情况，保留不带毒雌虫的后代， 以后每代次随机抽取群体中10%的灰飞虱采用斑点免疫结合法检测确保 不带毒，即获得不携带RSV的灰飞虱。为避免传毒介体污染，每次飼毒前
取100只DIBA法检测确定为无毒虫。 ③灰飞虱从冷冻病叶中获得病毒
45天后取出适量①述病叶，-4。C放置2小时后，放置温室中，3小时 后移入烧杯内，每个烧杯接入60只l-2龄无毒的灰飞虱，饲毒前使其饥 饿3小时。饲毒48小时后将存活的灰飞虱移入养虫苗并记录存活的灰飞 虱数量(如图l)。同时分别取等量的新鲜病叶及健康叶片于烧杯内，同样 方法伺毒，饲毒48小时后将灰飞虱移至养虫苗中并记录存活的灰飞虱数 量。词毒两天后，冷冻叶片、新鲜病叶及健康叶片存活灰飞虱数平均为35、 52. 5及54,存活率分别为58.3%, 87. 5°/ 及90%,虽然冷冻叶片饲毒灰飞 虱存活率低于新鲜叶片，但有一半以上的灰飞虱能在冷冻叶片上存活两 天。接种后对移出的25只灰飞虱进行RT-PCR检测，冷冻叶片饲毒的灰飞 虱扩增出目的条带分别为6只、5只、7只，平均带毒率为24%,新鲜叶片 饲毒灰飞虱扩增出有目的条带分别8只、9只，9只，平均带毒率为34.7% (如表1 )。这表明灰飞虱能从冷冻病叶上获得水稻黑条矮缩病毒。
表i
处理饲毒虫量存活虫量存活率带毒率
冷冻病叶-1602847%25%
冷冻病叶-2604067%22%
冷冻病叶-3603762%23%
新鲜病叶-1605388%32%
新鲜病叶-2605083%36%
健康叶片-3605795%0%
健康叶片-1605287%0%
健康叶片-2605592%0%
④获毒后灰飞虱的传毒能力
将③述冷冻病叶和新鲜病叶饲毒获得的灰飞虱移入养虫苗继续饲养
15天，每个重复选取25只灰飞虱，采用单苗单虫方法于1.5叶期时接种 感病品种华粳6号(图2), 4天后移出全部灰飞虱，再将稻苗移栽至大田， 注意水肥管理。7天以后开始调査，每3天调查一次，连续调查5次。调
查标准参照水稻黑条矮缩病的典型症状具有植株显著矮缩、平行于叶脉 的短条状叶片铍折和白色蜡滴状突起等(图3)。结果如表2，冷冻病叶饲毒灰飞虱接种华粳6号后发病率为6.7%,新鲜病叶的发病率为10%。用① 述RT-PCR方法检测接种后水稻叶片，有典型发病症状的华粳6号均能扩 增到目的条带，无发病症状的华粳6号均不能扩增的目的条带(图4)。这 表明灰飞虱从冷冻病叶上获得水稻黑条矮缩病毒后可以接种至水稻品种 上。
本发明主要服务于针对水稻黑条矮缩病开展的抗性资源筛选发掘、抗 病品种的鉴定与评价和抗性品种的选育。同时该项技术还可在植物抗病性 的遗传学和抗水稻黑条矮缩病毒转基因的研究工作中作为生物学检测方 法应用，将能够大大加快研究的进程。
上述实施不以任何形式限定本发明。
冷冻病叶-i
冷冻病叶-2 冷冻病叶-3 新鲜病叶-1 新鲜病叶-权利要求
1、一种灰飞虱从冷冻病叶中获得水稻黑条矮缩病毒的方法，其特征在于预先采集携带水稻黑条矮缩病毒的植株叶片以冷冻方法保存，通过饲喂的方法灰飞虱便能从冷冻病叶上获得水稻黑条矮缩病毒，再将灰飞虱转移至不携带病毒的健康秧苗上喂养渡过病毒的循回期后，即获得可应用于接种鉴定的携带水稻黑条矮缩病毒的灰飞虱。
2、 l中所述冷冻方法保存，其关键在于冷冻保存叶片的温度是-20 。C至—80°C。
全文摘要
本发明提供了一种灰飞虱从冷冻病叶中获得水稻黑条矮缩病毒的方法。本发明的原理是将携带水稻黑条矮缩病毒的植株叶片以冷冻方法保存，通过饲喂的方法使灰飞虱从冷冻病叶上获得水稻黑条矮缩病毒，待灰飞虱渡过病毒的循回期后，即获得可应用于接种鉴定的携带水稻黑条矮缩病毒的灰飞虱。利用本方法建立的水稻黑条矮缩病的品种抗性鉴定方法可以很好的克服采用患病植株饲喂灰飞虱获毒方法中患病植株难以长期保存的技术瓶颈，拓宽了品种抗性鉴定时间，可望加快抗病资源的筛选速度和抗病品种的选育进程。
文档编号C12N7/00GK101633908SQ20091003414
公开日2010年1月27日 申请日期2009年9月1日 优先权日2009年9月1日
发明者吴丽娟, 彤 周, 周益军, 季英华, 熊如意, 英 王, 程兆榜 申请人:江苏省农业科学院