抗褐飞虱基因Bph28(t)的分子标记引物及其标记方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子遗传学领域，具体涉及抗褐飞虱基因Bph28(t)的分子标记引物 及其标记方法和应用。
【背景技术】
[0002] 褐飞虱是一种典型的刺吸式单食性水稻害虫之一。我国产稻地区每年都有不同程 度的发生，水稻受褐飞虱危害严重时田间还会呈现飞虱火烧的现象。实践表明，选育抗、耐 虫品种是综合防治中最为经济有效的方法。发现并鉴定新的抗褐飞虱基因及了解其遗传机 理是培育持久抗性水稻品种的关键。
[0003] 迄今为止，已鉴定命名了 33个抗褐飞虱主效基因，部分鉴定的抗褐飞虱基因已经 用分子标记定位到水稻染色体上。早期IRRI的研宄人员利用鉴定出的优良抗性资源，相继 育出了一批抗褐飞虱的品种（系），如IR26、IR36、IR56和IR64等，我国科研人员李容柏、 钟代彬、张良佑等将筛选和鉴定出的优良抗源作为原始材料，利用传统杂交方法培育了一 系列优质的抗虫品种。这些抗虫品种的大面积推广在一定程度上有效地控制了褐飞虱的为 害。然而，由于褐飞虱生物型的容易发生变异，导致携带有单个抗性基因的水稻品种在较短 时间内就丧失了对褐飞虱的抗性，而聚合多个抗性基因水稻品种的抗性水平和延长抗性持 续的时间较长。如：水稻品种IR26携带有抗性基因Bphl，在大面积种植2~3年后就丧失 了对褐飞虱的抗性；而IR64除了携带一个主效的抗性基因Bphl之外，还包含几个与抗性相 关的微效QTL位点。由于在该品种中存在多个抗性位点，因此它在连续种植十多年以后能 保持对褐飞虱具有抗性。因此，挖掘和利用新的抗虫基因对于该虫的长期防治意义重大。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种抗褐飞虱基因Bph28(t)的分子标记引物及其标记方法 和应用。通过检测该分子标记，可以检测水稻Bph28(t)单基因系后代材料的褐飞虱抗性， 不仅操作简单，且准确率达95%以上，进而能加快抗褐飞虱水稻品种的选育进度。
[0005] 为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
[0006] -种抗褐飞虱基因Bph28(t)的分子标记引物，所述分子标记引物为Xuel7,其序 列为：
[0007] 5z 端引物序列：GAGCGCAGGGAGTGGATTAG
[0008] 3z 端引物序列：GTCCAACATGATAGCGACCG。
[0009] 如上述所述的抗褐飞虱基因Bph28(t)的分子标记引物在选育抗褐飞虱水稻品种 或筛选抗性基因资源中的应用。
[0010] 一种抗褐飞虱基因Bph28(t)的分子标记方法，采用上述所述的分子标记引物 Xuel7对目标材料的DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行检测，若能扩增出191bp的扩增片 段，则表明该杂交后代材料含有抗褐飞虱主效基因位点Bph28 (t)。
[0011] 如上述所述的分子标记方法，包括步骤：将分子标记引物Xuel7PCR扩增水稻抗源 W2183的后代材料或Bph28(t)单基因系的后代材料DNA，若能扩增出191bp的扩增片段，则 表明该杂交后代材料含有抗褐飞虱主效基因位点Bph28 (t)。
[0012] 如上述所述的分子标记方法，所述PCR扩增是采用10 y 1体系；所述10 y 1反应 体系为 lyL 10XPCR Buffer，0.2yL 10mM dNTP;0.3yL 10yM 引物，O.lyL Taq DNA polymerase，0. 5 yL DNA模板；PCR扩增的反应条件为：94°C预变性4min，94°C变性30sec， 60°C 退火 30sec，72°C延伸 45sec，34 个循环，72°C 终延伸 lOmin。
[0013] 如上述所述的分子标记方法，其特征在于：所述PCR扩增的产物是用7%的非变性 PAGE胶分离，然后通过银染显色记录扩增的DNA条带。
[0014] 本发明还提供了筛选上述抗性基因位点标记的方法，步骤如下：
[0015] (1)从广西普通野生稻的转育后代中进行抗褐飞虱鉴定并筛选出对稻褐飞虱生物 型1和2、孟加拉、湄公河（越南）九龙江（越南）、潘特钠加（印度）等6种生物型均具有 广谱、高抗性的抗源W2183;用该抗源转育的后代Bph28 (t)单基因系作为抗性亲本，黄华占 作为感性亲本杂交，构建了 F2抗性分离群体用于分子标记分析；每个F2单株通过自交获得 相应的F2:3家系，用于苗期抗虫鉴定；
[0016] (2)用CTAB法提取亲本及F2群体各单株的DNA，根据F 2:3家系抗虫鉴定的抗性值， 分别选择极端抗虫和感虫的F2单株各10株，分别取等量DNA混合组成抗、感DNA池；
[0017] (3)根据 Gramene 网站（http ://www. gramene. org/)公布的 SSR 分子标记按照比 较均匀的遗传距离选择了 498对引物对抗、感DNA池及2个亲本进行分析，筛选与抗褐飞虱 基因紧密连锁的标记，然后用具有多态性的标记对分离群体进行分析；
[0018] 新标记的开发，在Bph28(t)定位的区间内，参考已公布的日本晴和9311的基因组 序列，利用 NCBI 比对工具（http ://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)寻找两者序列上 的差异，在差异序列（多8bp)的两侧各lOObp的序列及其位置，然后根据这些序列通过软 件Primerf. 0设计引物，之后进行多态性检测与连锁分析；
[0019] (4)根据分子标记多态性，结合分离群体的抗性表型参数，用JoinMap3. 0和 MapQTL5. 0软件进行抗虫基因与分子标记的遗传连锁分析，L0D多3. 0,获得连锁图谱；
[0020] (5)根据QTL扫描分析的结果，确定分子标记RM335、RM5412、RM6659、RM16502和 Xuel7与抗性基因Bph28(t)的连锁关系。
[0021] (6)利用Xuel7分子标记扩增感性品种、抗性品种及Bph28 (t)单基因系的杂交后 代株系的基因组DNA。同时，对相应的株系进行抗虫鉴定，验证分子标记对抗褐飞虱基因筛 选的准确率。
[0022] 本发明的有益效果：
[0023] (1)发现了广西普通野生稻W2183的一个抗褐飞虱主效基因Bph28(t)紧密连锁的 分子标记。
[0024] (2)本发明所开发