稻飞虱翅中总rna高效提取的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农业生物技术领域，尤其涉及一种稻飞虱翅中总RNA高效提取的方 法。
【背景技术】
[0002] 褐飞虱（NilaparvataIugens)、灰飞虱（Laodelphaxstriatellus)和白背飞虱 (Sogatellafurcifera)同属于半翅目（Hemiptera)、飞風科（Delphacidae)，是目前亚洲 水稻上的重要害虫。它的危害不仅能以成虫和若虫群集刺吸水稻韧皮部筛管汁液，影响水 稻生长发育，同时也是多种病毒病害传播的媒介昆虫。水稻南方黑条矮缩发病轻重就与带 毒白背飞虱的迀入量有关。稻飞虱成虫个体可分为长翅型与短翅型，其它昆虫种类翅的分 化现象也很普遍。现有的研究表明，昆虫翅型的分化受多种因子的影响。目前已确定外界 环境条件与遗传因子共同决定了昆虫的翅型。因此飞虱翅中与翅型相对表达量有差异的相 关基因对研究飞虱翅型分化具有重要的意义。
[0003] 欲对RNA进行研究，首先要从组织中提取得到高质量的RNA。但RNA与DNA不同， 极容易发生降解，RNA降解将对后续研究的真实性及可靠性产生极大的影像。引起RNA降 解的主要因素是RNA酶。RNA酶有2种来源，一种是外源性的，一种是内源性的。因此在采 集用于RNA提取的样品时，重点就在于如何防止外源性RNA酶污染及抑制内源性RNA酶活 性上。外源性RNA酶可以通过DEPC等RNA酶抑制剂处理实验用品以及严格的实验操作和 试验环境的控制来加以排除。而内源性RNA酶却很难去除，只能通过液氮或干冰制造低温 或者组织样品保护液浸泡的方法来进行抑制。但对于某些组织来说，这样的处理很难达到 预期效果，比如飞虱翅翼组织。
[0004] 由于飞虱翅质地透明、纤薄，使用传统液氮冻存后不方便研磨，且翅翼角质化程度 高，使用样品提取液无法快速渗透到组织内部，起不到抑制RNA酶的效果。这些都是影响翅 总RNA提取量及质量的重要因素，这些问题都阻碍了对翅中基因RNA水平表达研究的进展。 本发明就是为了解决以上难题而提供了一种从样品收集开始，包括样品分离、液渗透浸入， 到总RNA的高效提取的方法。
[0005]目前尚未见有飞虱翅中总RNA高效提取的报道。
【发明内容】
[0006] 发明目的：为了克服现有技术中存在的不能有效高效提取稻飞虱翅中总RNA的问 题，本发明提出了一种能够获得高质量RNA，且不被外源或内源RNA酶降解到最低限度，能 最大限度地保持被提取的总RNA的纯度，以利于后续试验的利用的稻飞虱翅中总RNA高效 提取的方法。
[0007] 技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：稻飞虱翅中总 RNA高效提取的方法，包括以下步骤：
[0008]a)实验用具及耗材灭菌及RNA酶灭活处理：用0. 1 %DEPC水溶液浸泡实验器材和 枪头24h以上，部分耗材利用灭菌锅高温高压湿热灭菌处理，玻璃棒及石英砂等利用干燥 箱200°C干热灭菌处理2h以上；工作台面用RNA酶清除剂擦拭干净；解剖针置于无水乙醇 中浸泡后用酒精灯进行灼烧灭活处理；
[0009]b)稻飞虱翅的分离：将稻飞虱成虫利用无RNA酶水漂洗数次后，放入离心管中迅 速置于液氮罐中数十秒，使其迅速死亡，用灭菌后的解剖针迅速解离出稻飞虱翅部，避免残 留翅根部肌肉组织带入，装入已加入300yLTrizol试剂的离心管中，并放置在冰上，收集 到长翅60头以上，短翅120头以上的稻飞虱翅翼后，将离心管置于-40°C保存24h;
[0010] C)总RNA的提取：
[0011] cl)在室温下解冻步骤b得到的样品，待样品处于熔融状态时利用高温灭菌后的 玻璃棒沿着管壁研磨翅翼，待研磨难以进行时加入200目规格0.Olg石英砂助研磨，使翅脉 中内容物充分释放，研磨完毕再加入700yLTrizol试剂，混匀静置2min;
[0012] c2)加入200yL氯仿，剧烈振荡后室温静置；
[0013]c3)将上述混合物离心后获得水相、蛋白相和氯仿相，取水相，加入与水相等体积 的异丙醇溶液，轻轻颠倒混匀后室温下静置IOmin;
[0014]c4)将步骤c3)中得到的混合物继续离心后弃掉液体，保留管底微量白色固体；
[0015]c5)配制75%乙醇溶液：吸取无水乙醇750yL于一个新的无RNA酶离心管中，再 加入0. 1 %DEPC处理水250yL，颠倒摇匀，放置冰上冷却；
[0016] c6)将ImL75%乙醇溶液加入步骤c4)得到的含有沉淀物的离心管中，剧烈振荡， 使白色沉淀物悬浮在乙醇溶液中；
[0017] c7)重复以上步骤c4)_c6)，再进行两次洗涤；
[0018]c8)小心弃掉离心管中上清液，用滤纸吸干离心管壁液体，将离心管放在超净工作 台中通风吹干，加入20yL无RNA酶水，用Nanodrop核酸定量仪测定浓度，分装置于-70°C 超低温冰箱备用，同时利用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。
[0019] 更进一步的，所述步骤b)中稻飞虱用吸管吸取放入离心管中。
[0020] 更进一步的，所述步骤Cl)中解冻前采用低温高速离心机-4°C进行预冷处理后再 置于室温下解冻。
[0021] 更进一步的，所述步骤C2)中剧烈振荡时间为15s，室温静置5min;
[0022] 更进一步的，所述步骤c3)中离心条件为12000g4°C离心15分钟。
[0023] 更进一步的，所述步骤c3)中吸取水相体积为400yL。
[0024] 更进一步的，所述步骤c4)中离心条件为12000g4°C离心15分钟。
[0025] 更进一步的，所述步骤c4)中石永红移液器以及滤纸吸取管壁及官底残余液体。
[0026] 更进一步的，所述步骤c8)中取2yL进行琼脂糖凝胶电泳检测，IyL进行浓度测 定。
[0027] 有益效果：本发明提供的一种稻飞虱翅中总RNA高效提取的方法，与传统利用 Trizol提取RNA相比具有以下优点：方法简单方便，只需要在步骤中加入冷冻贮存及石英 砂助研磨，就能高效的提取出飞虱翅翼中总RNA，提取的翅中总RNA，不被外源或内源RNA酶 降解到最低限度，能最大限度地保持被提取的总RNA的纯度，以利于后续试验的利用；获得 的翅中总RNA纯度高、完整度好，浓度满足多种实验需求，可用于反转录cDNA、PCR、qPCR等 下游操作等分子生物学的操作应用，实用价值显著。
【附图说明】
[0028] 图1为本发明实施例获得的产物在琼脂糖电泳后得到的条带。
[0029] 图2为本发明实施例获得的产物通过逆转录及通过PCR扩增褐飞虱翅中wingless 基因的结果。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明：
[0031] 1)试验步骤：
[0032] 选取褐飞虱作为试验对象。
[0033] a)实验用具及耗材灭菌及RNA酶灭活处理：用0. 1 %DEPC水溶液浸泡实验器材和 枪头24h以上，部分耗材利用灭菌锅高温高压湿热灭菌处理，玻璃棒及石英砂等利用干燥 箱200°C干热灭菌处理2h以上；工作台面用RNA酶清除剂擦拭干净；解剖针置于无水乙醇 中浸泡后用酒精灯进行灼烧灭活处理；
[0034] b)褐飞虱翅的分离：用吸管吸取一定数量的褐飞虱放入离心管中迅速置于液氮 罐中数十秒，使其迅速死亡，利用无RNA酶水漂洗两次后用灭菌后的解剖针迅速解离出稻 飞虱翅部，避免残留翅根部肌肉组织带入，利用解剖针挑取翅翼装入已加入300yLTrizol 试剂的离心管中，并放置在冰上，减少RNA分解，收集到长翅60头以上，短翅120头以上的 稻飞虱翅翼后，将离心管置于_40°C保存24h;
[0035] c)总RNA的提取：
[0036] cl)打开低温高速离心机-4°C进行预冷处理，在室温下超净台中解冻步骤b得到 的样品，待样品处于熔融状态时利用高温灭菌后的玻璃棒沿着管壁研磨翅翼，待研磨难以 进行时加入200目规格0.Olg石英砂助研磨，使翅脉中内容物充分释放，研磨完毕再加入 700yLTrizol试剂，混匀静置2min;
[0037] c2)加入200yL氯仿，剧烈振荡15s后室温静置5min;
[0038] c3)将上述混合物12000g4°C离心15min，上清液转移新的离心管中，加入与上清 液等体积的异丙醇溶液，轻轻颠倒混匀后室温下静置IOmin;