一种提取矿石中细菌基因组的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物学领域，具体涉及一种提取矿石中细菌基因组的方法。
【背景技术】
[0002]矿石是含有用矿物并具有开采价值的岩石。凡是地壳中的矿物自然集合体，在现代技术经济水平下，能以工业规模从中提取国民经济所必需的金属或其他矿物产品者，称为矿石。
[0003]一般分为贫矿石、普通矿石和富矿石。有时仅分为贫矿石和富矿石，这种划分没有统一的标准，一般每个工业部门和矿区都有各自的计算范围。按所含有用矿物性质和利用的特征分为金属矿石和非金属矿石两大类。
[0004]云南省素有〃有色金属王国〃的美誉。云南省有12种有色金属矿产分布广泛，储量丰富，分别是锡、铅、锌、铜、镍、钴、铺、妈、招、铁、猛钛砂、银铀族。云南省北衙地区是一个与喜马拉雅期富碱斑岩活动有关的以金为主的中、低温热液复合式多金属成矿区。1988年中国科学院地质与地球物理研究所国家重点黄金科技攻关项目“滇西-川西南金矿成矿规律及靶区优选”课题组确认了北衙金矿靶区。北衙金矿位于三江缝合带与扬子板块的接合部位，属扬子板块的西缘，是20世纪80年代末在哀牢山-金沙江喜马拉雅期富碱岩浆岩多金属成矿带上新发现的一个具有超大规模远景的金矿床。
[0005]微生物无处不在，即使在含有大量金属离子，且营养物质很少的矿石中也能生存。目前，很多细菌可以用于生物浸矿，例如:氧化亚铁硫杆菌、氧化硫硫杆菌等。目前生物浸矿已发展成为工业上处理低品位矿石及废石等物料，提取铀、铜、金和银等金属是既简单又经济的一种有效方法。
[0006]目前研究微生物的方法主要有两种，即传统的实验室纯培养法和免培养法。环境生存着大量微生物，但可培养的微生物只占1%左右，而大部分的微生物由于种种原因，是无法培养获得的。提取样品中的总基因组，避开了微生物分离培养的问题，增加了发现新物种的机会，可以全面客观地反映样品中微生物的多样性。
[0007]目前，市场上有很多商用基因组提取试剂盒都可以快速、高效地提取细菌基因组DNA，但是这些试剂盒都是针对可培养的细菌，而针对免培养细菌效率则非常低。运用手工提取法提取样品中的基因组，最大的缺点就是会造成样品基因组的损失，而试剂盒中的吸附柱可以高效吸附DNA，弥补了手工提取造成基因组损失的不足，但由于吸附柱的吸附膜孔径较小，无法通过类似矿粉的大颗粒物质。本方法通过增加TE缓冲液的浓度，以螯合更多的金属离子，最大限度发挥溶菌酶的作用来提高基因组的提取率。前期使用手工提取法，提取矿石中的基因组，获得粗提液；后期采用试剂盒中的吸附柱吸附基因组，两种方法相结合，达到最大限度获取基因组的目的，最后可根据洗脱液的数量调节基因组溶液的浓度。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种提取矿石中细菌基因组的方法，实现在大块固体矿石中达到高效、方便提取基因组的目的。
[0009]本发明方法采用了手工提取与试剂盒提取相结合的方法，一方面用手工提取可以避免大块固体无法通过试剂盒离心柱膜的弊端，另一方面结合试剂盒提取可以有效提高基因组的获得率。
[0010]前期处理矿石样品时，所有接触到的工具必须经过灭菌或酒精擦拭，以免带入外界细菌污染样品。其中使用的缓冲液的浓度比实验室常用的缓冲液浓度高，目的为了螯合矿粉中过多的金属离子，因为金属离子的存在会影响溶菌酶的活性，造成下一步实验的有效性降低。加入5 mol/L的NaCl是为了提供高盐环境，加入SDS可以使蛋白变性，同时加入蛋白酶K，可以除去其中所含的蛋白。加入CTAB/NaCl溶液的目的是为了除去多糖，以得到纯净的基因组用于下一步实验。在手工提取中，要保证每次离心的时间都是10 min，若离心时间较少则影响提取的效率。实验过程中，对于氯仿:异戊醇和Tris饱和酚:氯仿:异戊醇的这两步抽提过程，要尽量避免吸取到下层物质，否则会影响基因组的后续实验，例如PCR、酶切等。
[0011]本发明提取矿石中细菌基因组的方法按以下步骤进行:
(1)称取10g~15 g筛选后的样品置于Beckman离心管中，加入10 mL~15 mL的pH8.0TE缓冲液，在振荡器上充分震荡混匀；
(2)10000 rpm~12000rpm 离心 5~10 min，弃上清，加入 10 ml ~15 mL 的 ρΗ8.0 TE 缓冲液，充分混匀；
(3)再加入0.5 mL~0.75 ml 20 mg/ml的溶菌酶溶液，充分混匀，置于37°C摇床80rpm~150 rpm 过夜；
(4)8000-13000rpm 离心 5~10 min，弃上清，6 ml -10 mL 的 ρΗ8.0 TE 缓冲液，充分混匀；
(5)再加入250 μ 1~300 μ I 质量体积比 20% 的 SDS 溶液、I ml -1.5 ml 5 mol/L 的 NaCl溶液、0.8 ml?1.2 ml的的CTAB/NaCl溶液，震荡混匀后加入20~25 μ I 20mg/ml的蛋白酶K溶液，60~70°C水浴放置10~15 min ；
(6)将离心管取出，置于室温冷却，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液(氯仿和异戊醇按体积比24: I的比例混合制得)，混匀后8000~13000 rpm离心5?10 min，小心将上清液吸出，注意不要吸到下层物质；
(7)在吸出的上清液中加入等体积的Tris饱和酚/氯仿/异戊醇混合液(Tris饱和酸:氯仿:异戊醇=25: 24: 1)，混勾后8000~13000 rpm离心5~10 min，小心将上清吸出，注意不要吸到下层物质；
(8)在步骤(7)吸出的上清液中加入上清液体积0.5-0.7倍的异丙醇，混匀，放于4°C沉淀1~2 h，此步骤可能会出现沉淀；
(9)将步骤(8)所得溶液与沉淀都加入到基因组提取试剂盒的离心吸附柱中，8000-13000 rpm离心30s~2 min，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中，由于吸附柱容量比较小，所以多次重复此步骤，直到所有溶液与沉淀都通过吸附柱；
(10)向吸附柱中加入400~600μ I缓冲液(以各试剂盒自带缓冲液为准)，10000-13000rpm离心30s~2 min，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；
(11)向吸附柱中加入500~800 μ I漂洗液(以各试剂盒自带漂洗液为准)，10000-13000rpm离心30s~2 min，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；
(12)向吸附柱中加入400~600μ I漂洗液(以各试剂盒自带漂洗液为准)，10000-13000rpm离心30s~2 min，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；
(13)10000-13000rpm离心1~5 min，倒掉废液；将吸附柱置于无菌环境中开盖放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
(14)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50~80μ I洗脱缓冲液(以各试剂盒自带洗脱缓冲液为准)，室温放置3~5 min, 10000-13000 rpm离心3~5min，将溶液收集到离心管中；此步骤中洗脱缓冲液的体积不应小于50μ1 ;
(15)将离心得到的溶液再加入到吸附柱中，室温放置3~5min, 10000-13000离心3~5min,收集溶液；
(16)16S rRNA基因扩增检测提取的DNA基因组
利用16S rRNA基因扩增的通用引物，以提取的基因组为模板，在45~55°C退火，进行琼脂糖凝胶电泳并观察结果，如果能够扩增出细菌的16S rRNA基因，证明成功提取了基因组。
[0012]本发明具有如下优点:手工提取可以避免样品无法通过基因组提取试剂盒吸附柱膜的弊端，获得基因组提取液；手工提取的基因组提取液通过试剂盒离心吸附柱洗脱后，可以增加基因组的获得率，比传统手工洗脱后的基因组获得率高。本方法针对矿石样品的特殊性进行设计，提高缓冲液的浓度可以有效螯合金属离子，避免金属离子过多影响溶菌酶的活性。此方法可以运用于各种矿石中基因组的提取，具有应用范围广、提取效率高的特点。
[0013]本发明方法提供的方法应用于云南省北衙金矿、兰坪铅锌矿以及富宁磁铁矿，都达到良好的提取效果。
【附图说明】
[0014]图1是利用手提方法CTAB/NaCl法提取云南省北衙金矿矿石中基因组的琼脂糖凝胶电泳图谱；
图2是利用试剂盒提取云南省北衙金