鱼类总基因组dna的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种提取基因组DNA的方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]鱼类是最古老的脊椎动物。它们几乎栖居于地球上所有的水生环境中。从淡水的湖泊、河流到咸水的大海和大洋。鱼类是一种终年生活在水中，用鳃呼吸，用鳍辅助身体平衡与运动的变温脊椎动物。目前全球已命名的鱼种约在32100种。是脊椎动物亚门中最原始最低级的一群。鱼肉富含蛋白质、钙、磷、铁、维生素B1、卵磷脂等多种营养物质，可增强记忆、思维和分析能力，延缓脑力衰退，因此对人类体力和智力的发展具有重大作用。鱼肉适合多种烹饪手法，不仅滋味鲜美，而且易被人体消化吸收。除鱼肉外鱼的其他部分还可制成鱼肝油、鱼胶、鱼粉等滋补品。获取鱼类总基因组DNA进行科学研究，对于进行鱼类遗传育种、资源评估等方面都具有重大的意义。获取鱼类总基因组DNA首先必须对鱼类的DNA进行提取。
[0003]酚氯仿法是一种常用的DNA提取方法，通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质，通常是将处理好的样本，分别加入细胞裂解液，蛋白酶K，苯酚，以及氯仿和异戊醇的混合液逐步进行处理，再加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。苯酚可以使蛋白质变性，同时抑制DNase的降解作用。加入苯酚后，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。氯仿可以除去核酸溶液中的苯酚，加速有机相与液相分层。异戊醇可以降低表面张力，减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相和下层的有机溶剂相维持稳定。
[0004]目前，提取鱼类总基因组DNA所用材料主要用的是鱼类的血液，肌肉或鱼鳍。这些提取材料在从鱼类身上获得时对鱼类本身的伤害较大，很有可能会导致鱼类死亡，从而使得一些后续的实验特别是要将样品鱼进行繁殖的实验无法进行。
[0005]鱼鳞作为鱼身体的一部分根据其外形，构造和发生特点，可分为楣鳞、硬鳞、圆鳞、栉鳞四种类型。鱼鳞的存在对于鱼类的生存而言具有重要作用。第一，在鱼类腹部的鳞片可以反射和折射亮光，如同镜子一般，使水底下的凶猛水生动物眩目，产生水天一色之感，从而无法分辨鱼类的存在，而鱼类背部的鱼鳞颜色较深，这与水底颜色相似，从而使水上的天敌无法分辨鱼类的存在。第二，鱼鳞为鱼体提供了一道保护屏障，使鱼类的身体与周围含有无数微生物的环境隔离，从而有效地避免鱼类感染疾病的几率及提高了鱼类抵抗疾病的能力。第三，鱼鳞作为一层外部骨架，既可以使鱼体保持一定的外型，此外，生物学家还可根据鳞片上环生的年轮，判断鱼的年龄，从而可以较为正确地掌握其生长、死亡率及健康状况。第四、鱼鳞上的粘液可以使鱼体减少阻力，使天敌在捕捉时滑手，从而得以逃生。有些鱼类如金鱼、热带鱼等，其体态多姿且鳞片色彩艳丽，因此具有较高的观赏价值，深受人们喜爱。以鱼鳞作为原料提取鱼类总基因组DNA不会对鱼类造成较大伤害，但因为鱼鳞含有的细胞较少，基因组DNA含量较少，杂质较多一般不用做提取基因组DNA的实验材料。如图2所示，如果以鱼鳞为原材料，采用酚氯仿法进行DNA的提取，提取的DNA含有杂质，且有非常严重的拖带现象，无法满足实验的需求。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种试剂方便易取，提取DNA效果好，DNA完整度高的鱼类总基因组DNA的提取方法。尤其可以以鱼鳞为原材料进行提取，不受样品量的限制。
[0007]本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是:一种鱼类总基因组DNA的提取方法，包括以下具体步骤:
A.取适量含有DNA的鱼类组织，清净粉碎后放入离心管中；
B.向离心管中加入适量的Chelex-1OO溶液，沸水浴15?20min;再加入适量的蛋白酶K溶液，50?60°C水浴3h以上；
C.吸取离心管中的液体置于另一个离心管中进行离心分离；
D.取上清液置于另一个离心管中，加入适量的RNase溶液，37°C水浴45min以上；
E.向离心管中加入适量的Tris饱和酚溶液，混匀后进行离心分离，并取上清液置于另一个离心管中；此步骤进行I?3次；
F.向离心管中加入适量的氯仿和异戊醇混合液，混匀后进行离心分离，并取上层溶液置于另一个离心管中；此步骤进行I?3次；氯仿和异戊醇混合液是氯仿与异戊醇按体积比为24:1混合而成;
G.向离心管中加入适量的乙醇溶液，4°C放置Ih以上，使得DNA沉淀；
H.对离心管进行离心分离，弃上清液；
1.向离心管中加入适量的乙醇溶液，进行离心分离，弃上清液；此步骤进行I?3次； J.去除乙醇后，加入适量的无菌水将DNA溶解，-20°C保存备用。
[0008]为了保证鱼鳞的细胞破碎，蛋白质、多糖、脂质等杂质的去除更加彻底，一种优选的技术方案是:上述Chelex-1OO溶液的浓度为5%，所述蛋白酶K溶液的浓度为20mg/mL，所述RNase溶液的浓度为5mg/mL。
[0009]为了保证DNA提取的效果好，一种优选的技术方案是:上述每0.2g鱼鳞使用Chelex-1OO溶液的体积为300?700 μ L，蛋白酶K溶液的体积为20?40 μ L，RNase溶液的体积为5?8 μ L ;每次加入离心管中Tris饱和酚溶液的体积与该离心管中液体体积相同，每次加入离心管中氯仿和异戊醇混合液的体积与该离心管中液体体积相同。
[0010]为了保证DNA的沉淀效果好，一种优选的技术方案是:上述步骤G向离心管中加入的乙醇溶液是预冷的浓度为95%以上的乙醇溶液，加入量是该离心管中液体体积的2?3倍。
[0011]—种优选的技术方案是:上述将离心管中的液体混匀是将离心管颠倒混匀5?1min0
[0012]为了更好地去除乙醇，一种优选的技术方案是:上述步骤J中去除乙醇是将离心管进行离心分离后，抽出底部的乙醇，放在滤纸上置于无菌工作台上吹风，直至将乙醇除尽。
[0013]为了更好地溶解DNA，一种优选的技术方案是:上述J中加入的无菌水温度为650C ;所述步骤I中加入的乙醇溶液是浓度为70%的乙醇溶液。
[0014]一种优选的技术方案是:上述含有DNA的鱼类组织是鱼鳞；所述鱼鳞是取自活鱼的新鲜鱼鳞，或者是浸泡于浓度为70%以上的乙醇中的鱼鳞，从而使得取样更加方便。本发明鱼类总基因组DNA的提取方法以鱼鳞为原材料时与现有技术相比优势极其明显。
[0015]另一种优选的技术方案是:所述含有DNA的鱼类组织是肌肉组织、血液或鱼鳍。本发明鱼类总基因组DNA的提取方法以肌肉组织、血液或鱼鳍为原材料时与现有技术相比具有一定的优势。
[0016]为了保证离心分离的效果，一种优选的技术方案是:上述离心分离时的温度为4°C，离心转速为12000rpm，离心时间为5?15min。
[0017]本发明具有积极的效果:本发明的鱼类总基因组DNA提取方法是对经典酚氯仿法进行了改进。先用煮沸的Chelex-1OO溶液使得样品细胞破裂并吸附一定量蛋白质，然后加入蛋白酶K降解大部分蛋白质，离心取上清再加入RNase对RNA进行降解，使得细胞中的蛋白质、多糖、脂质等杂质去除更加彻底，从而大幅地改善了 DNA提取的效果，可以提取到较好的完整的鱼类总基因组DNA。
[0018]Chelex-1OO是一种化学螯合树脂，由苯乙烯和二乙烯苯共聚体组成，故又名聚苯乙烯二乙烯基苯，为一种不溶于酸、碱溶液及有机溶剂的高分子化合物，外形呈白色颗粒状，无味，在PH值为4至14的环境中仍可保持其自身的稳定性。成对的亚氨基二乙酸离子[R-CH2N(CH2COO-) 2】作为Chelex-1OO的两性基团连接在Chelex-1OO的骨架上，成对的亚氨基二乙酸离子具有螯合多价离子的作用，特别是对高价金属离子具有很强的亲和力和螯合作用。一般情况下生物检材中的金属离子在高温和低离子强度溶液条件下能催化D