一种红木心材基因组dna的提取方法
【专利摘要】本发明公开了一种红木心材基因组DNA的提取方法，该提取方法包括以下步骤：将红木心材在液氮中研磨成粉末；在所得粉末中加入CTAB裂解液进行裂解；在所得裂解产物中加入纤维素酶继续裂解，将所得裂解物离心取上清，加入苯酚∶氯仿∶异戊醇混合溶液离心取上清；将所得上清转移至DNA吸附柱离心弃下清，用乙醇洗涤吸附柱，离心弃下清；在DNA吸附柱中加入常规的用于溶解DNA的试剂静置，离心即得。所述红木基因组DNA的提取方法解决了现有的提取基因组DNA的方法从红木心材中提取的基因组DNA质量不高的缺陷，能够从红木心材中提取并制备高质量的基因组DNA，所得基因组DNA的污染极低，能用于PCR扩增鉴定等用途。
【专利说明】—种红木心材基因组DNA的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种红木心材基因组DNA的提取方法。
【背景技术】
[0002]红木是一类外表呈红色的优质硬木的统称，历来就受到世界各地人民的青睐。近十几年来，随着中国古典家具和木雕工艺品收藏的升温，红木身价一翻再翻，市场上出现了大量的假冒红木现象。传统的红木鉴定方法主要从红木的心材颜色、气味、管孔弦向直径、气干密度、射线等指标进行鉴定，这种方法只能分辨到“类”，而通过基因识别技术则有望实现对红木“种”和产地的高分辨率鉴定。实现基因识别技术的关键前提是如何从红木树种的心材部分提取出高质量的DNA。
[0003]心材是由树木的死细胞组成，由于红木的心材部分含有大量的色素,传统的CTAB方法所提取的DNA往往混有大量难以去除的杂蛋白；又由于心材部分的DNA降解严重，仅仅采用试剂盒中的纯化柱方法又难以获得足量的基因组DNA，因此如何从红木的心材中提取到高质量DNA —直是本领域一个难以克服的技术难题。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是，针对目前现有的普通DNA提取方法难以从红木的心材中提取到高质量的基因组DNA这一缺陷，提供了一种红木心材提取基因组DNA的方法。
[0005]为解决上述技 术问题，本发明采取的技术方案之一为:一种红木心材基因组DNA的提取方法，其所述提取方法包括以下步骤:
[0006]( I)将红木心材在液氮中研磨成粉末；
[0007](2)在步骤(1)所得粉末中加入CTAB裂解液，60~70°C裂解3~6小时；
[0008](3)在步骤(2)所得裂解产物中加入纤维素酶，在48~55°C裂解0.5~2小时；
[0009](4)将步骤(3)所得裂解混合液9000~IlOOOrpm离心4~7分钟，取上清，并加入I倍体积~1.5倍体积的苯酚:氯仿:异戊醇的混合溶液，所述混合溶液中苯酚:氯仿:异戊醇的体积比为23: 22: 0.8~25: 24: 1，充分混匀后，9000~15000rpm离心4~7分钟，取上清；
[0010](5)将步骤(4)所得上清转移至DNA吸附柱离心弃下清，用体积百分比70~80%的乙醇洗涤吸附柱，离心弃下清；
[0011](6)在步骤(5)所得DNA吸附柱中加入常规的用于溶解DNA的试剂，静置，离心即得。
[0012]本发明所述红木心材选自本领域常规的红木的心材，所述红木较佳地是红酸枝木类，所述红酸枝木类较佳地选自巴里黄檀、赛州黄檀、绒毛黄檀、中美洲黄檀、奥氏黄檀、微凹黄檀或交趾黄檀中的一种或几种，所述红木心材最优地选自交趾黄檀。
[0013]本发明所述CTAB裂解液为本领域常规使用的CTAB裂解液，所述CTAB裂解液配方较佳地为:CTABI ~2%, PVP3 ~5%, NaC18 ~9%, Na2EDTA.2Η200.7 ~0.8%, β -巯基乙醇I~2%，Tris-HCl0.8~lmol/L，所述百分比为质量百分比。
[0014]其中所述CTAB裂解液的配方优选地为:CTAB2%，PVP5%，NaC18.18%，Na2EDTA.2Η200.74%, β -巯基乙醇 2%, Tris-HCllmol/L,所述 Tris-HCl 的 pH 值较佳地为7.0~8.0，更佳地为8.0，所述百分比为质量百分比。
[0015]其中步骤(2)所述CTAB裂解液加入量为:所得CTAB裂解液的红木心材的浓度较佳地为290mg/ml~570mg/ml,更佳地为360mg/ml~500mg/ml,优选地为430mg/ml。加入CTAB裂解液后裂解的温度较佳地为60~70°C，更佳地为62~68°C，优选地为65°C，裂解的时间较佳地为3~6小时，更佳地为4~5小时，优选地为5小时。[0016]其中步骤(3)纤维素酶为本领域常规的纤维素酶，其制备方法为本领域常规制备方法，市售可得。所述纤维素酶的添加量较佳地为40~60U/g，更佳地为45~55U/g优选地为50U/g。
[0017]其中所述纤维素酶的裂解的温度较佳地为48~55°C，更佳地为50~53°C，优选地为50°C，所述纤维素酶的裂解的时间较佳地为0.5~2小时，更佳地为I~1.5小时，优选地为I小时。
[0018]其中步骤(4)所述离心的速度较佳地为9000~llOOOrpm，更佳地为9500~1000Orpm,优选地为lOOOOrpm，离心的时间较佳地为4~7分钟，更佳地为5~6分钟，优选地为5分钟。
[0019]其中步骤(4)所述苯酚:氯仿:异戊醇的混合溶液中苯酚:氯仿:异戊醇的体积比较佳地为23: 22: 0.8~25: 24:1，优选地为25: 24: I，该苯酚:氯仿:异戊醇混合溶液的添加量较佳地为I倍体积~1.5倍体积，更佳地为I倍体积,加入所述苯酹:氯仿:异戍醇混合溶液后，离心的速度较佳地为9000~15000rpm,更佳地为10000~13000rpm,优选地为12000rpm，所述离心的时间较佳地为4~7分钟，更佳地为5~6分钟，优选地为5分钟。
[0020]其中步骤(5)所述DNA吸附柱为本领域常规的DNA吸附柱，其制备方法也是本领域常规制备方法，所述DNA吸附柱市售可得。所述离心的速度较佳地为9000~15000rpm，更佳地为10000~13000rpm，优选地为12000rpm，离心的时间较佳地为I~5分钟，更佳地为2~3分钟，优选地为2分钟。其中所述乙醇的体积百分比浓度范围较佳地为70~80%，优选地为75%。
[0021]其中步骤(6)所述常规的用于溶解DNA的试剂较佳地为ddH20或TE。所述ddH20的加入量较佳地为40~60 μ 1，优选地为50 μ 1，所述静置的时间较佳地为3~10分钟，优选地为5分钟。
[0022]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0023]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0024]本发明的积极进步效果在于:本发明所述红木心材基因组DNA的提取方法可以从多种红木心材中抽提基因组DNA，利用本发明所述提取方法制备所得基因组DNA具有污染少，质量高的优点。该提取方法制备所得基因组DNA可以用于各种DNA检测方法，可以作为PCR扩增检测的底物进行PCR扩增检测。【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为以实施例1制备的基因组DNA为模板所得PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果图。其中泳道I和泳道2为PCR扩增产物，M为Marker。
【具体实施方式】
[0026]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。
[0027]CTAB (hexadecyl trimethyl ammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)购买自北京索莱宝科技有限公司，PVP (聚乙烯吡咯烷酮)购买自北京索莱宝科技有限公司，β-巯基乙醇购买自北京索莱宝科技有限公司。
[0028]纤维素酶购买自苏柯汉生物技术有限公司，DNA吸附柱购买自Promega公司。苯酚、氯仿、异戊醇、Na2EDTA.2Η20以及其他化学制剂均购买自国药化学试剂有限公司，所用化学试剂均为分析纯。
[0029]实施例1提取红木交趾黄檀心材基因组DNA
[0030]提取过程的试剂配制及使用要求如下:
[0031]CTAB裂解液配方为:2g CTAB，5g PVP,8.18g NaCl，0.74g Na2EDTA.2H20，2mL3 -巯基乙醇，lOmLlmol/L 的 Tris-HCl (pH8.0)，加水定容到 100mL。 [0032]研磨钵:洗净后高温灭菌。
[0033]将苯酚:氯仿:异戊醇按照体积比为25: 24:1的体积比例混合配制IOml溶液。
[0034]红木交趾黄檀基因组DNA的提取方法包括以下步骤:
[0035](I)称取300mg的红木交趾黄檀心材木片，待研磨冷却后放入称量好的木片，在液氮中研磨成粉末。
[0036](2)在粉末中加入700 μ I的65°C预热CTAB裂解液，至于65°C放置5小时，期间每隔30min颠倒一次EP管。
[0037](3)加入终浓度为50U/g的纤维素酶，50°C水浴I小时，期间不断地颠倒EP管。
[0038](4)室温冷却后1000Orpm离心5min，小心吸取上清并量取上清体积,加入相同体积的苯酹:氯仿:异戍醇混合溶液=25: 24:1,充分混匀后12000rpm离心7min。
[0039](5)将上清分批次全部转移至DNA吸附柱，12000rpm离心Imin弃下清。
[0040](6)用体积百分比浓度为75%的乙醇洗除吸附柱上的蛋白质，重复二次后弃下清，自然晾干。
[0041](7)加入50μ I的ddH20，静置5min后，12000rpm离心2min即得红木交趾黄檀的
基因组DNA溶液。
[0042]实施例2红木交趾黄檀基因组DNA的质量验证
[0043]1、验证过程的试剂配制及其和过程如下所述:
[0044]1%的琼脂糖:称取0.1g的琼脂糖溶解于IOml的I X TAE中。
[0045]50 X TAE 缓冲液配方为:Tris242g，Na2EDTA.2H2037.2g，加入 800ml 的去离子水，充分搅拌溶解后加入57.1ml的醋酸。[0046]根据已经报道的红木交趾黄檀ITS2序列，设计PCR鉴定上游扩增引物和下游扩增引物，扩增引物的序列分别如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，PCR扩增产物大小为364bp。
[0047]合成PCR鉴定引物:PCR鉴定上游扩增引物序列(如序列表中SEQ ID NO:1所示)为:5， -CTTGCATCGATGAAGAACGTAG-3，；
[0048]PCR鉴定下游扩增引物序列(如序列表中SEQ ID NO: 2所示)为:5， -GCCTGACCTGAGGTCGCGTCAAG-3，。
[0049]上述两种PCR鉴定引物均由上海生工生物科技有限公司合成，将引物配制成IOpM浓度的溶液备用。
[0050]10 X PCR缓冲液、DNA聚合酶，dNTP以及ddH20取自PCR扩增试剂盒，该PCR扩增试剂盒为采购于天根生物科技有限公司的Golden Fast PCR KU。
[0051]所得PCR反应体系及其组分如表1所示:
[0052]表1PCR鉴定体系
[0053]
【权利要求】
1.一种红木心材基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤: (1)将红木心材在液氮中研磨成粉末； (2)在步骤(1)所得粉末中加入CTAB裂解液，60~70°C裂解3~6小时； (3)在步骤(2)所得裂解产物中加入纤维素酶，在48~55°C裂解0.5~2小时； (4)将步骤(3)所得裂解混合液9000~11000rpm离心4~7分钟，取上清，并加入I倍体积~1.5倍体积的苯酹:氯仿:异戍醇的混合溶液,所述混合溶液中苯酹:氯仿:异戊醇的体积比为23: 22: 0.8~25: 24: 1，充分混匀后，9000~15000rpm离心4~7分钟，取上清； (5)将步骤(4)所得上清转移至DNA吸附柱离心弃下清，用体积百分比70~80%的乙醇洗涤吸附柱，离心弃下清； (6)在步骤(5)所得DNA吸附柱中加入常规的用于溶解DNA的试剂，静置，离心即得。
2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，其中步骤(1)所述CTAB裂解液的配方为:CTAB1 ~2%，PVP3 ~5%，NaC18 ~9%，Na2EDTA.2H200.5 ~0.8%, β -巯基乙醇 I ~2%，Tris-HCl0.8~lmol/L，所述百分比为质量百分比。
3.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，其中步骤(2)所述的CTAB裂解液加入量为所得CTAB裂解液中红木心材的浓度为290mg/ml~570mg/ml，所述CTAB裂解液的裂解的温度为62~68°C，所述裂解的时间为4~5小时。
4.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，其中步骤(2)所述的CTAB裂解液加入量为所得CTAB裂解液的红木心材浓度为430mg/ml。
5.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，其中步骤(3)所述纤维素酶的添加量为40 ~60U/g。
6.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，其中步骤(3)所述纤维素酶的裂解温度为50~53°C，所述纤维素酶的裂解的时间为I~1.5小时。
7.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，其中步骤(4)所述离心的速度为10000~13000rpm,离心的时间为5~6分钟,其中所述苯酹:氯仿:异戍醇的混合溶液的加入量为与所得上清液的体积比为1: 1，该混合溶液中苯酚:氯仿:异戊醇的体积比为25: 24:10
8.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，其中步骤(5)所述离心的速度为9000~15000rpm,离心的时间为I~5分钟。
9.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，其中步骤(5)所述乙醇的体积百分比浓度为75%。
10.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，其中步骤(6)所述常规的用于溶解DNA的试剂为ddH20或TE，所述ddH20或TE的加入量为40~60 μ 1，所述静置的时间为3~10分钟。
【文档编号】C12N15/10GK103898094SQ201410095694
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月14日 优先权日:2014年3月14日
【发明者】李瑶, 周佳海, 张颖, 寿勇明 申请人:中国科学院上海有机化学研究所, 上海化学工业区医疗中心