重组型凝血酶原的制造方法、载体dna及试剂盒的制作方法

重组型凝血酶原的制造方法、载体dna及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供重组型凝血酶原的制造方法。所述制造方法包括提供整合有编码选自MBP、SUMO及NusA的标签的基因和编码凝血酶原的基因的载体DNA的步骤、及在鳞翅目昆虫或上述鳞翅目昆虫的培养细胞中表达融合有标签的凝血酶原的步骤。
【专利说明】重组型凝血酶原的制造方法、载体DNA及试剂盒 【【技术领域】】
[0001] 本发明涉及重组型凝血酶原的制造方法、载体DNA及试剂盒。 【【背景技术】】
[0002] 凝血酶原是在肝脏产生的分子量约72, 000的凝血酶前体蛋白质，也被称为血液 凝固第II因子。凝血酶原，在活体内，被活化第X因子、活化第V因子、磷脂及钙离子的复合 物限制性分解，转变为凝血酶。凝血酶是在血液凝固反应中将纤维蛋白原限制性分解而生 成纤维蛋白的丝氨酸蛋白酶，是与止血或创伤治愈等相关的重要的蛋白质。因此，凝血酶不 仅在临床领域用作止血剂或血液检查用试剂，还在分子生物学领域等中用作研究用试剂。
[0003] 凝血酶在血浆中大量存在，因此制剂或试剂用凝血酶主要以人或牛的血浆作为原 料制备。但是，在这些的原料中有混入肝炎病毒或人免疫缺陷病毒、异常朊病毒等的感染性 物质的危险性。另外，由于血浆是天然来源原料，所以制品的批间差异成为问题。
[0004] 因此，近年研究一开发了从由利用大肠杆菌或哺乳动物细胞的基因重组技术 制备的凝血酶原或前凝血酶制造凝血酶的方法(特开2002-306163、US2004/197858、 US2009/137001)。 【
【发明内容】
】
[0005] 本发明的范围仅由随附的权利要求定义，且不受此发明概述部分的任何限制。
[0006] 将凝血酶原或前凝血酶用大肠杆菌表达时，已知其几乎全部成为被称为包涵体的 不溶性凝集体。从而，将回收的不溶性凝集体用变性剂使之可溶之后，有必要进行重折叠 处理。但是，已知重折叠处理不仅烦琐，而且如凝血酶原或前凝血酶这样的复杂结构的蛋 白质的重折叠效率极其低下。另外，担心用从通过重折叠处理而可溶的凝血酶前体得到的 凝血酶的比活性(每单位重量的活性）低。例如，在SoejimaK等人（J. Biochem. vol. 130, p. 269-277, 2001)中记载了从由大肠杆菌表达系统得到的前凝血酶2制备凝血酶，显示通 过重折叠处理而可溶的蛋白质之中有4?7%左右为有酶活性的凝血酶。即，从通过重折叠 处理而可溶的凝血酶前体得到的凝血酶的比活性是血浆来源的天然型凝血酶的4?7%左 右。
[0007] 利用哺乳动物细胞的表达系统时可得到可溶性的凝血酶原或前凝血酶，但从工业 规模制造的观点来看，存在产量非常少，另外制造成本也高的问题。
[0008] 另一方面，用利用大肠杆菌或哺乳动物细胞的表达系统可表达向希望得到的蛋白 质融合了功能性标签蛋白质的重组型蛋白质。例如，作为重组型蛋白质的纯化用标签，有 6XHis标签、谷胱甘肽-S-转移酶（GST)标签、FLAG标签、麦芽糖结合蛋白质（MBP)标签等。 另外，近年开发了提高重组型蛋白质的表达量或可溶性的标签蛋白质。例如，已知MBP标签 或低分子泛素样修饰因子（SUM0)标签等是提高蛋白质的可溶性的标签，在利用大肠杆菌或 酵母的表达系统中，重组型蛋白质的可溶性得到改善（US2009/305342，US2007/037246 )。
[0009] 但是，已知存在下述情况：即使融合有可溶性标签的蛋白质整体保持可溶性，但目 的蛋白质部分不能形成正确的构象，进而该蛋白质不具有原本的活性。这样一来，通过融合 可溶性标签而看起来成为可溶性的重组型蛋白质，存在一旦切断可溶性标签，就成为不溶 性凝集体或失去活性的情况。
[0010] 鉴于如上述一样的情况，本发明人等以提供满足下述两方面条件的重组型凝血酶 原的制造方法为课题：可简便并且大量地制造可溶性的凝血酶原，和从得到的凝血酶原转 变的凝血酶有高的比活性。
[0011] 本发明人经锐意探索，结果发现通过将融合有特定标签的凝血酶原在利用鳞翅目 昆虫的表达系统中表达，可简便并且大量地得到可溶性的凝血酶原，从得到的凝血酶原转 变的凝血酶有高的比活性，从而完成本发明。
[0012] 即，本发明提供重组型凝血酶原的制造方法。此方法包括：提供整合有编码选自 MBP、SUM0及NusA的标签的基因和编码凝血酶原的基因的载体DNA的步骤、及在鳞翅目昆 虫或上述鳞翅目昆虫的培养细胞中表达融合有标签的凝血酶原们步骤。
[0013] 另外，本发明提供整合有编码选自MBP、SUM0及NusA的标签的基因和编码凝血酶 原的基因的载体DNA。
[0014] 另外，本发明提供试剂盒。此试剂盒包含：含有凝血酶的凝血酶试剂、及用于稀释 受试者的血浆的稀释用缓冲液。此凝血酶从使用整合有编码选自MBP、SUM0及NusA的标签 的基因和编码凝血酶原的基因的载体DNA，在鳞翅目昆虫或上述鳞翅目昆虫的培养细胞中 表达的融合有标签的凝血酶原取得。
[0015] 通过本发明，使简便并且大量地制造可溶性的重组型凝血酶原变得可能。从而，通 过本发明，无需进行不溶性凝集物的重折叠处理。另外，通过活化得到的重组型凝血酶原， 可得到有与天然型凝血酶大致等同程度的比活性的重组型凝血酶。 【【专利附图】

【附图说明】】
[0016] 图1是显示从表达本发明的融合有标签的凝血酶原或无标签的凝血酶原的蚕蛹 制备的样品中的凝血酶原的表达量的照片。
[0017] 图2是显示可溶性级分中含的本发明的融合有标签的凝血酶原的量的相对比的 图。
[0018] 图3是显示从融合有标签的凝血酶原及天然型凝血酶原得到的凝血酶的比活性 的图。
[0019] 图4A是显示从表达融合有标签的凝血酶原或无标签的凝血酶原的蚕蛹制备的样 品中的凝血酶原的表达量的照片。
[0020] 图4B是显示从表达融合有标签的凝血酶原或无标签的凝血酶原的蚕蛹制备的样 品中的凝血酶原的表达量的照片。
[0021] 图4C是显示从表达融合有标签的凝血酶原或无标签的凝血酶原的蚕蛹制备的样 品中的凝血酶原的表达量的照片。
[0022] 图4D是显示从表达融合有标签的凝血酶原的蚕蛹制备的样品中的凝血酶原的表 达量的照片。
[0023] 图5是显示可溶性级分中含的融合有标签的凝血酶原的量的相对比的图。
[0024] 图6是显示从表达融合有标签的凝血酶原或无标签的凝血酶原的蚕蛹制备的样 品中的凝血酶原的表达量的照片。
[0025] 图7是显示可溶性级分中含的融合有标签的凝血酶原的量的相对比的图。
[0026] 图8A是显示使用实施例3中制备的本发明的试剂制成的标准曲线的图。
[0027] 图8B是显示用实施例3中使用的对照试剂制成的标准曲线的图。
[0028] 图9A是显示实施例3中制备的本发明的试剂的保存稳定性的图。
[0029] 图9B是显示实施例3中使用的对照试剂的保存稳定性的图。
[0030] 【实施方式】
[0031] 以下参照【专利附图】

【附图说明】本发明的优选的实施方式。
[0032] 在本发明的凝血酶原的制造方法（以下，简称为"制造方法"）中使用整合有编码选 自MBP、SUM0及NusA的标签的基因和编码凝血酶原的基因的载体DNA。
[0033] MBP是有约42kDa的分子量的蛋白质，已知与革兰氏阴性菌中的麦芽糖糊精的输 送相关。在本发明的实施方式中，编码MBP的基因只要是编码作为重组蛋白质的标签而为 公众所知的MBP蛋白质或其衍生物的分离的基因就不特别限定，但优选为编码大肠杆菌 (E. coli)来源MBP的基因，更优选为编码SEQ ID N0:1所表示的氨基酸序列的基因。
[0034] SUM0是也被称为Sentrin、SMT3、PICl、GMPl及UBL1的泛素样蛋白质的一种，已知 在从酵母至包括人的脊椎动物中高度保守。在本发明的实施方式中，编码SUM0的基因只要 是编码作为重组蛋白质的标签而为公众所知的SUM0蛋白质或其衍生物的分离的基因就不 特别限定，但优选为编码酵母SUMO (SMT3)、人SUM0-3或SUMOstar (改性SUM0、LifeSensor 公司）的基因，更优选为编码SEQ ID N0:2所表示的氨基酸序列的基因。
[0035] NusA已知是有约55kDa的分子量的蛋白质，是与RNA聚合酶结合的转录延伸因 子。在本发明的实施方式中，编码NusA的基因只要是编码作为重组蛋白质的标签而为公 众所知的NusA蛋白质或其衍生物的分离的基因就不特别限定，但优选为编码大肠杆菌 (E.coli)来源NusA或Nus.Tag (商标）（Merck公司）的基因，更优选为编码SEQ ID N0:3 所表不的氣基酸序列的基因。
[0036] 编码凝血酶原的基因只要是来源于有凝血酶原（或者血液凝固第II因子）的目的 动物种的分离的凝血酶原基因就不特别限定，但优选为编码人凝血酶原的基因。再有，人 凝血酶原基因的碱基序列本身是公知的，例如，在由美国国立医学图书馆的国立生物信息 中心（National Center for Biotechnology Information :NCBI)提供的数据库，以登录号 NM_000506 登录。
[0037] 载体DNA只要是具有能够在鳞翅目昆虫或该昆虫的培养细胞中表达基因的启动 子、可在该启动子的下游进行上述的基因的插入的DNA就不特别限定，但优选为，可通过与 杆状病毒DNA的同源重组制作插入上述的基因的重组杆状病毒的转移载体。这样的载体 DNA本身在现有技术中是公知的，可举出例如pM02、pYNG、pBM030、pBM050、pVL1392等。再 有，上述的启动子可从现有技术中公知的启动子适宜选择，可举出例如多角体蛋白启动子、 pl〇启动子、蚕肌动蛋白启动子等。
[0038] 在整合上述各基因的载体DNA中，在启动子的下游整合编码融合有标签的凝血酶 原的基因。其中，编码标签的基因可插入到编码凝血酶原的基因的上游或下游中的任何一 侧，优选为编码凝血酶原的基因的上游。即，在载体DNA中，使标签融合到凝血酶原的N末 端侧的方式将编码标签的基因整合是优选的。具体而言，在载体DNA中，整合编码SEQ ID N0:7?9中任一个所示的氨基酸序列的基因是优选的。其中，由于凝血酶原转变为凝血酶 时凝血酶原的N末端侧被切断，标签融合到凝血酶原的N末端侧时，通过从凝血酶原转变为 凝血酶的操作也可同时进行标签的除去。
[0039] 在本发明的实施方式中，载体DNA再整合编码蛋白质分泌信号序列的基因是优 选的。那样的蛋白质分泌信号序列可从在重组型凝血酶原的制作或利用鳞翅目昆虫的表 达系统中使用的公知的序列适宜选择，可举出例如，凝血酶原来源分泌信号序列（SEQ ID N0:4)、蚕来源30K信号序列（SEQIDN0:5)及蚕来源SP信号序列（SEQIDN0 :6)。
[0040] 在本发明的实施方式中，载体DNA整合编码蚕来源30K信号序列及标签融合到N 末端侧的人凝血酶原的基因是优选的。
[0041] 在本发明的制造方法中，使用上述的载体DNA，在鳞翅目昆虫或其昆虫的培养细 胞中表达融合有标签的凝血酶原。其中，鳞翅目昆虫只要是适宜于重组蛋白质的表达的公 知的鳞翅目昆虫，就不特别限定，可举出例如蚕（Bombyx mori)、黄领麻纹灯蛾（Spilosoma imparilis)、作香（Antheraea pernyi)、草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾 (Trichoplusia ni)等。在它们之中，蚕是特别优选的。另外，作为鳞翅目昆虫的培养细胞， 只要是从适宜于重组型蛋白质的表达的鳞翅目昆虫建立的细胞株，就不特别限定，可举出 例如 BmN、BmN4、Splm、Anpe、Sf9、Sf21、High5 等。
[0042] 在本发明的实施方式中，从大量地制造重组型凝血酶原的观点来看，在鳞翅目昆 虫中表达融合有标签的凝血酶原是优选的。再有，鳞翅目昆虫是成虫、蛹及幼虫之任何的形 态均可，但从丝氨酸蛋白酶的活性及向杆状病毒的感受性的观点来看，使用蛹是优选的。 [0043] 在鳞翅目昆虫或此鳞翅目昆虫的培养细胞中表达融合有标签的凝血酶原的手段 不特别限定，可根据载体DNA的种类适应性地确定。例如，可通过将载体DNA由公知的基因 导入法直接转染进鳞翅目昆虫或此昆虫的培养细胞而表达融合有标签的凝血酶原。在本发 明优选的实施方式中，通过用上述的载体DNA重组的杆状病毒感染鳞翅目昆虫或此昆虫的 培养细胞来表达融合有标签的凝血酶原。
[0044] 将杆状病毒用具有目的碱基序列的DNA重组的方法本身在现有技术中是公知的。 例如，载体DNA是转移载体时，通过将由限制性内切酶等线性化的杆状病毒DNA，和整合编 码融合有标签的凝血酶原的基因的载体DNA共转染进鳞翅目昆虫的培养细胞，筛选感染细 胞，可得到重组杆状病毒。
[0045] 在本发明的实施方式中，杆状病毒的种类只要是可感染上述的鳞翅目昆虫或其昆 虫的培养细胞的病毒就不特别限定，但优选为核多角体病病毒（NPV)或其改性病毒。作为 那样的病毒，可举出例如1^111即￥、办(311即￥、4即6即￥、4〇即￥、香蛾科的香〇3〇1]^)5^1]1〇1'；〇或夜 蛾科的苜蓿银纹夜蛾（Autographa californica)等的感染两宿主的重组杆状病毒(参照特 开2003-52371号公报）等。在优选的实施方式中，使用半胱氨酸蛋白酶缺损（CPd)杆状病 毒（参照特愿平7-303488号）。
[0046] 用重组杆状病毒感染鳞翅目昆虫或其昆虫的培养细胞的手段不特别限定，可从现 有技术中公知的方法适宜选择。例如，感染鳞翅目昆虫时，可举出给该昆虫注射含重组杆状 病毒的液的方法等。另外，感染培养细胞时，向培养基添加含重组杆状病毒的液即可。通过 在向鳞翅目昆虫或其昆虫的培养细胞感染病毒起饲育或培养5?8天，可表达融合有标签 的凝血酶原。
[0047] 在本发明的实施方式中，如上述一样从表达融合有标签的凝血酶原的鳞翅目昆虫 或此昆虫的培养细胞取得该融合有标签的凝血酶原到的手段不特别限定。例如，鳞翅目昆 虫的情况中，可通过采集体液，或者将该昆虫破碎而制备匀浆来取得融合有标签的凝血酶 原。另外，培养细胞的情况中，可通过将该细胞物理破碎，或者溶解于含表面活性剂等的细 胞溶解剂的溶液来取得融合有标签的凝血酶原。
[0048] 其中，在本发明的制造方法中，由于表达的重组型凝血酶原的可溶性显著地升高， 所以可溶性级分中大量地含融合有标签的凝血酶原。从而，在本发明的实施方式中，再包括 从上述的表达步骤得到的鳞翅目昆虫或此昆虫的培养细胞取得含该融合有标签的凝血酶 原的可溶性级分的步骤是优选的。可溶性级分可通过过滤或离心如上述一样得到的鳞翅目 昆虫的体液或匀浆、或者细胞破碎液或细胞裂解物，分离上清而得到。再有，离心时，可向样 品任意地添加适当的缓冲液。那样的缓冲液只要适宜于蛋白质的保存就不特别限定，可举 出例如，Tris缓冲液、磷酸缓冲液等。
[0049] 在本发明的实施方式中，可将得到的重组型凝血酶原由现有技术中公知的方法转 变为凝血酶。不特别限定这样的方法，可举出例如，使作为凝血酶原活化酶的Ecarin作用 于重组型凝血酶原来得到凝血酶的方法。另外，得到的凝血酶的比活性可由现有技术中公 知的方法测定。例如，可通过使作为对凝血酶的显色性合成底物的S-2238(积水Medical株 式会社）和重组型凝血酶反应指定时间之后，添加反应停止液，测定吸光度来求出比活性。
[0050] 在本发明的范围内也包括以由整合有编码选自MBP、SUM0及NusA的标签的基因和 编码凝血酶原的基因的载体DNA重组作为特征的杆状病毒。对于此杆状病毒的制造及使用 而言，与对本发明的制造方法所述的同样。再有，在本发明的实施方式中，用再整合编码蛋 白质分泌信号序列的基因的载体DNA重组的杆状病毒是优选的。
[0051] 另外，在本发明的范围内也包括含整合有编码选自MBP、SUM0及NusA的标签的基 因和编码凝血酶原的基因的载体DNA的重组型凝血酶制造用试剂盒。此试剂盒中含的载体 DNA的制造及使用与本发明的制造方法所述的相同。
[0052] 在本发明的实施方式中，载体DNA整合到杆状病毒中是优选的。或者，在别的实施 方式中，载体DNA和杆状病毒也可分别收纳在个别的容器中。另外，载体DNA再整合编码蛋 白质分泌信号序列的基因是优选的。
[0053] 另外，在本发明的范围内也包括使用整合有编码选自MBP、SUM0及NusA的标签的 基因和编码凝血酶原的基因的载体DNA，在鳞翅目昆虫或上述鳞翅目昆虫的培养细胞中表 达的融合有标签的凝血酶原。此融合有标签的凝血酶原的制造与本发明的制造方法所述的 相同。
[0054] 另外，在本发明的范围内也包括从上述的融合有标签的凝血酶原得到的含有凝血 酶的凝血酶试剂。
[0055] 本发明的凝血酶试剂，为凝血酶的稳定化，也可含公知的稳定剂。这样的稳定剂只 要是凝血酶试剂中通常使用的物质就不特别限定，但例如，可举出钙离子、有机酸、表面活 性剂、蛋白质等。
[0056] 将钙离子通过水溶性的钙化合物的添加供给到试剂中是优选的。作为那样的钙化 合物，可举出例如，氯化钙、乳酸钙、葡萄糖酸钙、葡萄糖醛酸钙、酒石酸钙等。可将这些钙化 合物的1种或2种以上组合使用。钙化合物的对凝血酶的稳定化有效量只要是升高凝血 酶试剂的稳定性的量就不特别限定，但作为凝血酶试剂中的钙化合物的浓度，例如5mM? lOOmM是优选的，10mM?50mM是更优选的。
[0057] 作为有机酸，可举出例如，蚁酸、醋酸、丙酸、酪酸、缬草酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、 葡萄糖酸、乳酸、葡萄糖醛酸、二醇酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、戊二酸、氨基醋酸、 氨基己酸等。作为这些有机酸，也可使用游离酸或其盐中的任何一种。另外，可将这些的有 机酸的1种或2种以上组合使用。有机酸的添加量只要是升高凝血酶试剂的稳定性的量就 不特别限定，但作为凝血酶试剂中的表面活性剂浓度，例如10mM?500mM是优选的，50mM? 200mM是更优选的。
[0058] 作为表面活性剂，可从阴离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、两性离子性表 面活性剂及非离子性表面活性剂适宜选择。作为阴离子性表面活性剂，可举出例如，十二 烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、十二烷基-N-肌氨酸酸钠、胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆 酸钠等。作为阳离子性表面活性剂，可举出例如，鲸蜡基三甲基铵溴化物、十四烷基铵溴化 物、十二烷基吡啶鎗氯化物等。作为两性离子性表面活性剂，可举出例如，3- [(3-胆酰胺 基丙基）二甲基铵基]-1-丙烷磺酸（CHAPS)、3- [(3-胆酰胺基丙基）二甲基铵基]-2-羟 基-1-丙烧磺酸（CHAPS0)、棕榈酰溶血卵磷脂、十二烧基-N-甜菜碱、十二烧基-β -丙氨酸 等。作为非离子性表面活性剂，可举出例如，辛基葡萄糖苷、庚基硫代葡萄糖苷、癸酰-Ν-甲 基葡萄糖酰胺、聚氧乙烯十二烷基醚、聚氧乙烯七甲基己基醚、聚氧乙烯异辛基苯基醚 (TritonX系列）、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖 醇酯（Tween系列）等。
[0059] 上述的表面活性剂之中，非离子性表面活性剂是特别优选的。另外，可将上述的表 面活性剂的1种或2种以上组合使用。该表面活性剂的添加量只要是升高凝血酶试剂的稳 定性的量就不特别限定，但作为凝血酶试剂中的表面活性剂浓度，例如〇. 〇〇1?1重量/体 积％是优选的，〇. 005?0. 1重量/体积％是更优选的。
[0060] 作为稳定剂的蛋白质，可举出例如，白蛋白、明胶、球蛋白，可将这些蛋白质的1种 或2种以上组合使用。该蛋白质的添加量只要是升高凝血酶试剂的稳定性的量就不特别限 定，但作为凝血酶试剂中的蛋白质浓度，例如〇. 05?10重量/体积％是优选的，0. 1?5重 量/体积％是更优选的。
[0061] 上述的稳定剂考虑凝血酶的在溶液状态保存时、在干燥状态保存时、在冷冻状态 保存时及溶解干燥品或融解冷冻品时等中的向凝血酶的酶活性的影响而进行选择。再者， 组合使用多种稳定剂时，也使以对于凝血酶的液状品而言，使含在液状品中，对于干燥品或 冷冻品而言，最终成液状时发挥稳定化效果地调节含有。
[0062] 本发明的凝血酶试剂也可含缓冲剂。作为这样的缓冲剂，例如，可从在pH4?9的 范围有缓冲能力的缓冲剂适宜选择使用。作为那样的缓冲剂，例如，可从柠檬酸、磷酸、醋 酸、咪唑、GTA、HEPES、M0PS、BIS-TRIS、TRIS、M0PS0、ADA、MES等组合使用1种或2种以上。 这些缓冲剂的添加量只要是有缓冲能力的量，就不特别限定。缓冲剂的添加量是，例如凝血 酶试剂中的浓度是5?lOOOmM是适宜的，更优选为50?500mM。
[0063] 本发明的凝血酶试剂也可含高分子多糖类。作为这样的高分子多糖类，可举出例 如，葡聚糖40、葡聚糖70、葡聚糖200, 000、葡聚糖500, 000、Ficoll等。另外，可将这些高 分子多糖类的1种或2种以上组合使用。这些高分子多糖类的添加量只要是升高再现性的 量就不特别限定。作为凝血酶试剂中的高分子多糖类的浓度，例如0. 1?10重量/体积％ 是优选的，0. 3?3重量/体积％是更优选的。
[0064] 本发明的凝血酶试剂也可含合成高分子类。作为这样的合成高分子类，可举出例 如，聚乙烯基醇500、聚乙烯基醇1500、聚乙烯基醇2000、聚乙二醇1500、聚乙二醇2000、聚 乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇20000及聚乙烯基吡咯烷酮等。可将 这些合成高分子类的1种或2种以上组合使用。这些合成高分子类的添加量只要是升高再 现性的量就不特别限定。作为凝血酶试剂中的合成高分子类的浓度，例如〇. 1?10重量/ 体积％是优选的，〇. 3?3重量/体积％是更优选的。
[0065] 另外，可在本发明的凝血酶试剂中添加适当的防腐剂。作为防腐剂，例如，可从环 丙沙星、丙酸或安息香酸钠等中组合使用1种或2种以上。另外，根据需要，也可含氯化钠 等的盐或，氨基酸、糖等的一般稳定剂等。
[0066] 本发明的凝血酶试剂的凝血酶含量只要是其活性调节到目的活性值就不特别限 定。
[0067] 作为具体性的凝血酶试剂，例如，可使用由200U/mL的凝血酶，和含有醋酸及乳酸 钙的缓冲液组成的PH6. 0的溶液。
[0068] 本发明的凝血酶试剂可为液状品、冷冻品或干燥品。本发明的凝血酶试剂是干燥 品时，通过添加纯化水或缓冲液来溶解。
[0069] 上述的浓度记载的是溶液品中的浓度，使用干燥品等时，是记载溶解时的浓度。
[0070] 在本发明的范围内也包括含上述的凝血酶试剂和用于稀释受试者的血浆的稀释 用缓冲液的凝固能力检查试剂盒。
[0071] 作为本发明的凝固能力检查试剂盒中含的稀释用缓冲液，可举出例如，MES、 Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、M0PS0、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、P0PS0、HEPPS0、 EPPS、Tricine、Bicine、TAPS、CHES、CAPSO、CAPS 等的 Good 缓冲液、巴比妥缓冲液。另外， 可举出TC缓冲液（Sysmex株式会社制)。
[0072] 本发明的凝固能力检查试剂盒可再含以指定的浓度含有纤维蛋白原的标准液。此 时，本发明的凝固能力检查试剂盒可使用纤维蛋白原的定量用试剂。纤维蛋白原的定量顺 序具体而言如下。首先，将标准液用稀释用缓冲液稀释5倍、10倍、20倍(稀释倍率可适宜调 节)。接下来，将各稀释标准液〇. 2mL于37°C加温3分钟，各加0. lmL预先加温至37°C的检 查试剂或凝血酶试剂，测定凝固时间，将各稀释标准液的测定值标绘于图而制成标准曲线。 然后，将血浆待测样品用稀释用缓冲液稀释10倍(稀释倍率可适宜调节)，对于得到的稀释 待测样品同样地测定凝固时间，基于得到的凝固时间，可从标准曲线求出浓度。
[0073] 另外，也可为了测定凝血酶抑制物质的活性、例如，抗凝血酶活性、水蛭素的活性、 还有化学合成抑制剂的活性而使用本发明的凝固能检查试剂盒。
[0074] 在上述的凝固能力检查试剂盒中，凝血酶试剂、及稀释用缓冲液分别包装。例如， 凝血酶试剂收容到第1试剂容器中，稀释用缓冲液收容到第2试剂容器中。另外，凝固能力 检查试剂盒再含以指定的浓度含有纤维蛋白原的标准液时，标准液收容到第1及第2试剂 容器之外的第3试剂容器中。再有，凝固能力检查试剂盒，也可根据期望，将别的试剂收容 到别的试剂容器。再者，凝固能力检查试剂盒也可根据期望，具备用于稀释试剂之一或多个 的1种或多个缓冲液、使用说明书、可在反应中使用的容器等。
[0075] 接下来，根据实施例详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。 【实施例】
[0076] 【实施例1 :整合标签基因及人凝血酶原基因的杆状病毒的制作】
[0077] ( 1)人凝血酶原基因的克隆
[0078] 基于数据库中公开的人凝血酶原基因（以下，也称为hPTH基因）的碱基序列（NCBI Acc. No. NM_000506)，设计用于克隆hPTH基因的引物组。各引物的序列如下所示。
[0079] F ：5'-AAGAATTCATGGCCAACACCTTCTTGGAGGAG-3, (SEQ ID NO:10)
[0080] R:5'-AATCTAGACTACTCTCCAAACTGATCAATGACCTT-3' （SEQ ID N0:11)
[0081] 使用上述的引物组，通过以人肝脏cDNA库（clontech公司)作为模板的PCR法单离 hPTH基因。将分离的DNA片段使用QIAquick (QIAGEN公司）纯化，用限制性内切酶EcoRI 及Xbal处理之后，整合到pM02载体（Sysmex株式会社)的多克隆位点。将得到的质粒构建 体命名为pM02-hPTH。
[0082] (2)编码标签的基因的亚克隆
[0083] 基于已经报告的malE基因、SUM0基因及NusA基因的碱基序列，设计用于亚克隆 各基因的引物组。各引物的序列如下所示。
[0084] · malE基因用引物组
[0085] F :5'-AAGGTACCATGAAAATAAAAACAGGTGCGC-3'（SEQ ID N0:12)
[0086] R:5'-TTGAATTCGCTCTGAAAGTACAGATCCTCAGTCTGCGC-3' （SEQ ID N0:13)
[0087] · SUMO基因用引物组
[0088] F ：5'-AAGGTACCATGTCCCTGCAGGACTCAG-3, (SEQ ID NO:14)
[0089] R:5'-TTGAATTCGCTCTGAAAGTACAGATCCTCAATCTGTTCTC-3' （SEQ ID N0:15)
[0090] · NusA基因用引物组
[0091] F ：5'-AAGAATTCGCTCTGAAAGTACAGATCCTCCGCTTCGTCAC-3, (SEQ ID NO:16)
[0092] R:5'-AAGGTACCATGAACAAAGAAATTTTGGCTGTAG-3' （SEQ ID N0:17)
[0093] 使用上述的malE基因用引物组,通过以pMAL_p5x (NewEngland Biolab公司）作 为模板的PCR法单离malE基因。同样地，使用SUMO基因用引物组及NusA基因用引物组， 通过以pISUMOstar (LifeSensor公司）及pET-44 ( + ) (Merck公司）作为模板的PCR法分 别分离SUM0基因及NusA基因。
[0094] (3)整合编码标签的基因和凝血酶原基因的载体DNA的制作
[0095] 将分离的各标签基因的DNA片段使用QIAquick (QIAGEN公司）纯化，用限制性内 切酶EcoRI及ΚρηΙ处理。然后，将各基因的DNA片段整合到pM02-hPTH中的hPTH基因之 上游而得到本发明的载体DNA(转移质粒)。将得到的各转移质粒分别称为pM02-MBP-hPTH、 pM02-SUM0-hPTH 及 pM02-NusA hPTH。
[0096] (4)重组杆状病毒的制作
[0097] 重组杆状病毒的制作通过改变Maeda等的方法（InverterbrateCell system and Applications，Vol. 1，ρ· 167-181，CRCPress，Boca Raton (1989))而进行。具体而言如 下。首先，将上述的转移质粒用质粒纯化试剂盒（QIAGEN公司）纯化。然后，将这些的转移 质粒（0. 5 μ g)和直链化的CPd杆状病毒（ATCC VR2500)的DNA (0. 2 μ g)，使用脂转染试剂 (X_tremeGENE9DNATransfection Reagent :Roche 公司）共转染于 BmN 细胞（Maeda，1989)。 筛选通过利用96孔板的有限稀释法进行，挑选确认感染迹象的病毒，回收培养上清。由此， 得到整合编码标签的基因和凝血酶原基因的本发明的重组杆状病毒。再有，对于pM02-hPTH 也与上述同样制作重组杆状病毒。
[0098] (5) BmN细胞中的融合有标签的凝血酶原的表达的检查
[0099] 上清的回收后，制备BmN细胞的裂解物。对于得到的裂解物，用SDS-PAGE及蛋白印 迹进行解析。再有，在蛋白印迹中，作为第1抗体，使用小鼠抗凝血酶抗体（N0VUS公司）;作 为第2抗体，使用抗小鼠 IgG (Dako公司）;及作为检测试剂，使用Immobilon Western HRP 试剂（Millipore公司）。结果，在BmN裂解物中确认被预测有作为融合有标签的凝血酶原 的分子量的蛋白质表达。
[0100]【实施例2 :蚕中的融合有标签的凝血酶原的表达及比活性的检查】
[0101] (1)融合有标签的凝血酶原的表达
[0102] 用实施例1中制作的重组杆状病毒接种蚕蛹（品种是近秋锦和。从上田蚕种公 司购入蚕卵，由Sysmex株式会社人工饲育至蛹)。病毒接种的7天后，回收感染的蛹，将其 于-80°C冷冻。将冷冻的蛹用混合机破碎。将得到的破碎液中的蛹残渣通过低速离心处理 及过滤除去，得到匀浆。将得到的匀浆以20000 X g进行30分钟的离心处理，分离上清和沉 淀物。将得到的上清作为可溶性级分，将沉淀物作为不溶性级分。
[0103] 对于得到的匀浆、可溶性级分及不溶性级分，用SDS-PAGE及蛋白印迹解析。再有， 在蛋白印迹中，作为第1抗体，使用小鼠抗凝血酶抗体（N0VUS公司）;作为第2抗体，使用抗 小鼠 IgG (Dako公司）;及作为检测试剂，使用Immobilon Western HRP试剂（Millipore公 司）。结果示于图1A?D。另外，基于蛋白印迹的结果，将各可溶性融合有标签的凝血酶原 的可溶性级分中的表达量的比率示于图2。再有，在图2的图中，将未融合标签的凝血酶原 (图1D :对照区）的可溶性级分的条带强度作为1，显示各可溶性融合有标签的凝血酶原（图 1A?C)的可溶性级分的条带强度的相对比。
[0104] 从图1A?D的匀浆的条带得知，融合有标签的凝血酶原及未融合标签的凝血酶原 均在蚕蛹中表达。但是，在可溶性级分中几乎不含未融合标签的凝血酶原。即得知，在未融 合标签时，蚕蛹中表达的凝血酶原几乎全部成为不溶性蛋白质。对此得知,作为标签融合 MBP、SUM0或NusA的凝血酶原大量地含在可溶性级分中。另外，从图2得知，任何的融合有 标签的凝血酶原，均相比未融合标签的凝血酶原，可溶性成为约12倍以上。
[0105] (2)融合有标签的凝血酶原的比活性
[0106] 将上述得到的可溶性级分使用Q sepharoseFastFlow (GE healthcare公司）简 易纯化。向纯化的可溶性级分添加作为凝血酶原活化酶的Ecarin (Sigma公司）至终浓度 成lU/ml，于37°C反应2小时。对于得到的反应液，用使用SDS-PAGE及小鼠抗凝血酶抗体 (N0VUS公司）的蛋白印迹进行解析。再有，在蛋白印迹中，作为第1抗体，使用小鼠抗凝血 酶抗体（N0VUS公司）；作为第2抗体，使用抗小鼠 IgG (Dako公司）；及作为检测试剂，使用 Tmmobi 1 on Western HRP 试剂（Millipore 公司）。
[0107] 蛋白印迹的结果得知，各标签融合人凝血酶原由Ecarin的作用而活化，有与天然 型人凝血酶原同等的分子量。然后，从各标签融合人凝血酶原得到的凝血酶的比活性（NIH U/mg)使用作为凝血酶的特异性合成底物的S-2238 (积水Medical株式会社)进行测定。再 有，作为对照，使用使Ecarin作用于天然型人凝血酶原（人血楽来源、Calbiochem公司）而 得到的凝血酶。测定的结果示于图3。从图3得知，从各标签融合人凝血酶原得到的凝血酶 有天然型同等的比活性。
[0108]【比较例1 :本发明的标签以外的标签及信号肽的效果的检查】
[0109] 检查由在蚕的重组蛋白质表达系统表达凝血酶原时，大肠杆菌表达系统中常用的 标签（His、FLAG、DOCK及GST)是否对可溶性的改善有效。另外，也检查信号肽的种类对可 溶性的影响。
[0110] (1)载体DNA的制作
[0111] 将实施例1中分离的hPTH基因整合到pMOUSysmex株式会社)载体，制作在hPTH 基因上游有人凝血酶原来源分泌信号的载体DNA。同样将hPTH基因分别整合到pM15载体 (Sysmex株式会社)、pM23载体（Sysmex株式会社)、pM31a载体（Sysmex株式会社)及pM47载 体（Sysmex株式会社)，制作导入具有人凝血酶原来源分泌信号、且C末端各自融合6 X Hi s、 FLAG、DOCK及GST的编码人凝血酶原的基因的载体DNA。接下来，将分离的hPTH基因分别 整合到pM16载体（Sysmex株式会社)、pM27载体（Sysmex株式会社)、pM35a载体（Sysmex株 式会社）及pM51载体（Sysmex株式会社)，制作导入具有蚕来源30K信号、且C末端各自融 合6XHis标签、FLAG、DOCK、GST的编码人凝血酶原的基因的载体DNA。接下来，将分离的 hPTH基因分别整合到pMSP-01载体（Sysmex株式会社)、pM-SP06载体（Sysmex株式会社)、 pM_SP24载体（Sysmex株式会社)、pM_SP32载体（Sysmex株式会社)及pM_SP48载体（Sysmex 株式会社)，制作导入在hPTH基因上游有蚕来源SP信号的载体DNA、C末端各自融合6 XHis 标签、FLAG、DOCK、GST、且再具有蚕来源SP信号的编码人凝血酶原的基因的载体DNA。
[0112] (2)重组杆状病毒的制作及融合有标签的凝血酶原的表达
[0113] 使用上述制作的各载体DNA，与实施例1同样地制作重组杆状病毒。然后，与实施 例2同样地，用得到的各重组杆状病毒感染蚕蛹，匀浆而制备可溶性级分及不溶性级分。
[0114] (3)融合有标签的凝血酶原的可溶性的检查
[0115] 对于得到的匀浆、可溶性级分及不溶性级分，用SDS-PAGE及蛋白印迹进行解析。 再有，在蛋白印迹中，作为第1抗体，使用小鼠抗凝血酶抗体（N0VUS公司）;作为第2抗体，使 用抗小鼠 IgG (Dako公司）;及作为检测试剂，使用ECL检测试剂盒（GE healthcare公司）。 结果示于图4A?D。再有，在图4中，N.C表示非感染蚕，P.C表示天然型人凝血酶原(人血 浆来源、Calbiochem公司）。另外，基于蛋白印迹的结果，将各种的融合有标签的凝血酶原 的可溶性级分中的表达量的比率示于图5。再有，在图5的图中，将图4B的融合蚕来源30K 信号肽的无标签的凝血酶原(与实施例2的对照相同的条件)的可溶性级分的条带强度作为 1，显示其他可溶性级分的条带强度的相对比。
[0116] 从图4A?D的匀浆的条带得知，融合有标签的凝血酶原及未融合标签的凝血酶原 均在蚕蛹中表达。另外，几乎见不到由信号肽的种类所致的表达量的差异。但是，在可溶性 级分中几乎不含融合His、FLAG、D0CK及GST中的任何标签的凝血酶原。另外，以图5得知， 融合任何的标签的凝血酶原相比未融合标签的凝血酶原可溶性差。即得知，即便融合这些 标签，蚕蛹中表达的凝血酶原的可溶性无改善。
[0117] 【比较例2 :本发明的标签以外的融合蛋白质的效果的检查】
[0118] 检查由在蚕的重组蛋白质表达系统表达凝血酶原时，本发明的标签以外的融合蛋 白质(亲和素、链霉亲和素的完全型及链霉亲和素的核型）是否对于可溶性的改善有效。
[0119] (1)载体DNA的制作
[0120] 基于数据库中登录的亲和素基因 （NCBI Acc.No.NM_205320. 1)、链霉亲和素 (核型及完全型）基因 （NCBI Acc.No.X03591. 1)的碱基序列，由人工基因合成法（Life Technology公司）制备各基因。制备的基因在5'末端附加 ΚρηΙ位点、3'末端附加 EcoRI 位点，插入到pUC19 (Life Technology公司）。将这些与在实施例1同样的条件下纯化及 进行限制性内切酶处理，将各基因的DNA片段整合到pM02-hPTH中的hPTH基因的上游，制 备导入N末端各自融合亲和素、链霉亲和素(完全）及链霉亲和素(核）的编码人凝血酶原的 基因的载体DNA。
[0121] (2)重组杆状病毒的制作及融合有标签的凝血酶原的表达
[0122] 使用上述制作的各载体DNA，与实施例1同样地制作重组杆状病毒。然后，与实施 例2同样地用得到的各重组杆状病毒感染蚕蛹，匀浆而制备可溶性级分及不溶性级分。
[0123] (3)融合有标签的凝血酶原的可溶性的检查
[0124] 对于得到的匀浆、可溶性级分及不溶性级分，用SDS-PAGE及蛋白印迹进行解析。 再有，在蛋白印迹中，作为第1抗体，使用小鼠抗凝血酶抗体（N0VUS公司）;作为第2抗体，使 用抗小鼠 IgG(Dako公司）;及作为检测试剂，使用Immobilon Western HRP试剂（Millipore 公司）。将结果示于图6A?D。另外，基于蛋白印迹的结果，将各种的融合有标签的凝血酶 原的可溶性级分中的表达量的比率示于图7。再有，在图7的图中，将无标签的凝血酶原(与 实施例2的对照相同的条件)的可溶性级分的条带强度作为1，显示其他可溶性级分的条带 强度的相对比。
[0125] 从图6A?D的匀浆的条带得知，融合有标签的凝血酶原及未融合标签的凝血酶原 均在蚕蛹中表达。另外得知，融合任何的标签的凝血酶原几乎含在不溶性级分中。另外，以 图7得知，在融合亲和素的凝血酶原中，可溶性不改善。另外得知，在融合链霉亲和素的完 全型或核型的凝血酶原中，相比无标签的凝血酶原可溶性改善，但不算充分。
[0126] 【实施例3 :凝血酶试剂的制备及试剂性能的评价】
[0127] (1)凝血酶试剂的制备
[0128] 在本实施例中，使用在实施例2中在比活性的测定中使用的MBP融合凝血酶原。从 此MBP融合凝血酶原使用Ecarin取得活化的凝血酶。将此凝血酶与0. 9%安息香酸钠，和 0. 2%TWeen80溶液混合，制备本发明的凝血酶试剂。本试剂中的凝血酶活性是200U/ml。
[0129] ( 2)凝血酶试剂的性能评价
[0130] 对于上述得到的本发明的凝血酶试剂，进行灵敏度、正确度、及稳定性的评价。凝 固时间的测定使用Coagrex800 (Sysmex株式会社制）进行。作为样品，使用血液凝固用对 照N (Sysmex株式会社制)，作为缓冲液，使用TC缓冲液（Sysmex株式会社制)。作为对照 试剂，使用含人来源的天然型凝血酶的市售试剂ThromboCheckFib (L) (Sysmex株式会社 制)。对照试剂的凝血酶活性是200U/ml。
[0131] 【灵敏度的评价】
[0132] 将使用TC缓冲液稀释5倍、10倍、或者20倍的样品100 μ 1于37°C加温1分钟之 后，测定在添加预先加温的本实施例的凝血酶试剂或对照试剂50μ 1起的凝固时间。进行 2次测定（Ν1及Ν2)。
[0133] 灵敏度的评价以使用20倍稀释的样品时的平均凝固时间和使用5倍稀释的样品 时的平均凝固时间的差进行评价。结果示于表1。由表1验证了，本实施例的凝血酶试剂与 对照试剂有同等的灵敏度。
【权利要求】
1. 重组型凝血酶原的制造方法，其包括： 提供下述载体DNA的步骤，所述载体DNA整合有编码选自MBP、SUMO及NusA的标签的 基因和编码凝血酶原的基因、和 在鳞翅目昆虫或上述鳞翅目昆虫的培养细胞中表达融合有标签的凝血酶原。
2. 权利要求1的方法，还包括下述步骤： 从上述表达步骤得到的上述鳞翅目昆虫或上述鳞翅目昆虫的培养细胞获得含上述融 合有标签的凝血酶原的可溶性级分。
3. 权利要求1的方法，其中 在上述载体DNA中，编码上述标签的基因以上述标签融合到凝血酶原的N末端侧的方 式整合。
4. 权利要求1的方法，其中 上述载体DNA整合有编码SEQ ID N0:7?9中任一个所示的氨基酸序列的基因。
5. 权利要求1的方法，其中 在上述表达步骤中，上述融合有标签的凝血酶原在上述鳞翅目昆虫中表达。
6. 权利要求1的方法，其中 在上述表达步骤中，上述融合有标签的凝血酶原在上述鳞翅目昆虫的蛹中表达。
7. 权利要求1的方法，其中 上述鳞翅目昆虫是蚕。
8. 权利要求1的方法，其中 上述表达步骤包括用以上述载体DNA重组了的杆状病毒转染上述鳞翅目昆虫或上述 鳞翅目昆虫的培养细胞的步骤。
9. 权利要求1?8中任一项的方法，其中 上述载体DNA中整合有编码蛋白质分泌信号序列的基因。
10. 权利要求9的方法，其中 上述蛋白质分泌信号是选自来自凝血酶原的分泌信号序列、来自蚕的30K信号序列、 及来自蚕的SP信号序列中的至少1种。
11. 载体DNA，其整合有编码选自MBP、SUMO及NusA的标签的基因和编码凝血酶原的基 因。
12. 权利要求11所述的载体DNA，其中进一步整合有编码蛋白质分泌信号序列的基因。
13. 杆状病毒，其含权利要求11所述的载体DNA。
14. 用于制备重组凝血酶原的试剂盒，其包含权利要求11的载体DNA。
15. 权利要求14的试剂盒，其中所述载体DNA包含在杆状病毒中。
16. 权利要求14的试剂盒，其中 上述载体DNA中整合有编码蛋白质分泌信号序列的基因。
17. 融合有标签的凝血酶原，其是使用权利要求11所述的载体DNA，在鳞翅目昆虫或上 述鳞翅目昆虫的培养细胞中表达的。
18. 凝血酶试剂，其包含从权利要求17的融合有标签的凝血酶原获得的凝血酶。
19. 试剂盒，其包含： 含有凝血酶的凝血酶试剂；和 用于稀释受试者的血浆的稀释用缓冲液； 其中上述凝血酶获自凝血酶原，所述凝血酶原是使用整合有编码选自MBP、SUMO及 NusA的标签的基因和编码凝血酶原的基因的载体DNA，在鳞翅目昆虫或上述鳞翅目昆虫的 培养细胞中表达的融合有标签的凝血酶原。
20.权利要求19的试剂盒，还包括以指定的浓度含有纤维蛋白原的标准液。
【文档编号】C12N9/74GK104046606SQ201410095588
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年3月14日 优先权日:2013年3月15日
【发明者】坂东孝彦, 菅井睦美 申请人:希森美康株式会社