一种通过Notch通路调节胰腺癌细胞EGFR表达的方法
【专利摘要】一个通过Notch通路调节胰腺癌细胞EGFR表达的方法，是通过Notchl?siRNA干扰胰腺癌细胞后，EGFR明显下降。并经过ChIP-seq发现Notch和CSL共同结合在EGFR的启动子上。这说明Notch通路通过CSL来调节胰腺癌细胞中EGFR表达，进而抑制肿瘤生长。该方法首次在胰腺癌细胞中明确了Notch通路和EGFR表达的关系。可为肿瘤的靶向治疗提供重要的靶点。
【专利说明】—种通过Notch通路调节胰腺癌细胞EGFR表达的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及通过Notch通路调节胰腺癌细胞EGFR表达的方法，属于肿瘤分子生物学领域。
【背景技术】
[0002]表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)可启动细胞核内的有关基因，从而促进细胞分裂增殖。目前已经发现在胃癌、乳腺癌、膀胱癌和头颈部鳞癌中，EGFR表达增高，说明表皮生长因子受体是在许多肿瘤的发生发展中起关键作用。
[0003]Notch信号通路是一个高度进化并且保守的通路，介导细胞和细胞之间的相互作用。当相邻的细胞配体与受体相互作用时，会导致Notch蛋白连续裂解，释放出受体的胞内段(NICD)。NICD转入细胞核内，并在细胞核中与DNA结合蛋白CSL(CBFi / RBP-J κ，Suppressor of Hairless, Lag-1的首字母缩写)结合,启动目标基因的转录。我们的研究证明EGFR的表达受Notch-1的调控，通过调控Notch-1可以降低EGFR的表达。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是为控制肿瘤细胞的增殖与生长，如何阻断EGFR所介导的信号通路。
[0005]本发明的技术解决方案为使用NotchlsiRNA来干扰胰腺癌细胞后，可使EGFR表达明显下降。
[0006]本方法具有如下的优点和效果:
[0007]1.本方法可使EGFR表达明显下降。
[0008]2.本方法，具有稳定性好，作用明显的特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1ChIP样品验证的PCR电泳结果(M: IOObp DNA Marker ； 1:用RNA pol II抗体做的阳性对照组；2:Flag抗体沉淀Notchl的样品组；3:Flag抗体沉淀CSL的样品组；4:非特异性IgG抗体做的阴性对照组)；
[0010]图2测序片段中CSL结合位点示意图(在我们所测序片段之中比对CSL结合位点后，我们发现了有两处是和CSL结合位点序列一致的)。
【具体实施方式】
[0011]1.合成干扰片段
[0012]合成特异性针对Notchl基因mRNA的siRNA和阴性对照siRNA。
[0013]2.转染
[0014]在含有10%的胎牛血清的1640培养基中培养BxPC3细胞，在细胞培养箱中于37°C、50mL / L C02饱和湿度下培养，试验组转染第一步中所获得重组表达载体质粒，对照组转染PCDNA3空质粒。细胞提前24小时传代，六孔板中融合度至80%左右后，即按照Lipofectamine?2000说明书进行阴性对照siRNA序列和Notchl siRNA的转染。
[0015]3.WESTERN BLOT 检测
[0016]在上述胰腺癌细胞中加入RIPA蛋白裂解液裂解细胞后，我们按照试剂盒要求提取总蛋白，制作聚丙烯酰胺浓缩胶和分离胶，取不同组别的等量蛋白样品进行电泳，然后依次进行转膜、封闭、一抗、二抗孵育和洗涤(其中一抗稀释浓度为:1: 500;二抗稀释浓度为:1: 3000)。最后，显色曝光并通过X线胶片曝光洗片，经自动电泳凝胶分析系统扫描井测定各组蛋白条带的灰度值进行比较，EGFR表达下降。
[0017]4.染色质免疫沉淀实验
[0018](I)所培养BxPC3细胞的汇合度为80%时(每盘约I X IO7个，用RPMI1640培养基)，开始准备实验。
[0019](2)用Roche公司的转染试剂将5种质粒分别转染进BxPC3细胞中，每种质粒至少转染2盘细胞，37度恒温箱培养48h后收获细胞。
[0020](3)在试验开始前一天将蛋白G琼脂糖球珠的封闭处理:取300 μ L溶胀好的蛋白G琼脂糖球珠，短暂离心后弃上清，加入ImL双蒸水，在混匀器上4°C旋转3min洗去残留的盐和乙醇，重复洗3次。加入双蒸水900 μ L、10mg / mL BSA100 μ L，在混匀器上4°C旋转孵育过夜，备用。
[0021](4)向培养基 中加入4%甲醛溶液，使其终浓度为I %，混匀后在室温下静置交联10分钟。再加入1.25M甘氨酸，使其终浓度为0.125M，混匀后在室温下静置5分钟终止交联反应。倒掉反应液，将培养皿至于冰上。
[0022](5)用适量4 °C I XPBS将每盘细胞洗2次，吸干洗液。之后每盘加
1.2mL4°C 1XPBS，用细胞刮刮下细胞，移至1.5mL EP管中。4°C 5000rpm离心5min，弃上清，得到细胞沉淀。
[0023](6)在每管细胞沉淀中加入300 μ L4 V Lysis buffer、终浓度为I X的25Xcocktail和终浓度为ImM的PMSF，吹打重悬混匀，涡旋振荡3_5次，在冰上静置裂解IOmin0之后4°C 8000rpm离心5min,弃上清,得到细胞核沉淀。
[0024](7)在每管细胞核沉淀中加入300μL^?细胞核裂解液、终浓度为IX的25 X cocktaiL和终浓度为ImM的PMSF，吹打重悬混匀，涡旋振荡3_5次，在冰上静置裂解IOmin0
[0025](8)冰上超声3次，超声强度50，每次5s，每次间隔lmin。之后4°C 12000rpm离心
IOmin,取上清。
[0026](9)每管取少量等体积上清，合并于I管中作为Input样品，总体积50yL即可。再加入50 μ L双蒸水，终浓度为0.2Μ的NaCL和2 μ L RNase Α,混匀后37°C孵育30min。之后加入2μ L蛋白酶K，65°C解交联过夜。酚/氯仿抽提，I %琼脂糖凝胶电泳鉴定超声片段大小，以200-500bp为宜。
[0027](10)于每管超声上清液中加入等体积封闭好的均质蛋白G琼脂糖球珠悬液(总用量500 μ L)，终浓度为I X的25 X cocktail，在混匀器上4°C旋转孵育2小时进行预清洗，以除去体系中的非特异免疫球蛋白。之后4°C 5000rpm离心2min，收集上清。
[0028](11)每管加入终浓度为IX的25Xcocktail，再于其中一管中加入2μ g NormalRabbit IgG非特异性抗体作为阴性对照,其他每管中各加入2 μ g Notchl抗体,在混匀器上4°C旋转孵育过夜。
[0029](12)将余下的另一半蛋白G琼脂糖球珠悬液混匀后等量加入各管中，再加入终浓度为I X的25X cocktail，在混匀器上4°C旋转孵育2小时进行免疫沉淀。之后4°C 5000rpm离心2min，弃上清，得到结合有DNA-转录因子-转录因子抗体复合物的蛋白G琼脂糖球珠沉淀。
[0030](13)于4°C环境下，在混匀器上将蛋白G琼脂糖球珠沉淀分别用ImL低盐缓冲液、高盐缓冲液和LiCl缓冲液各洗I次，最后用TE (pH = 8.0)缓冲液洗两次，每次5min，4°C 5000rpm 离心 2min,弃上清。
[0031](14)配好洗脱液。在每管蛋白G琼脂糖球珠沉淀中加入300μ L洗脱液重悬，在加热混匀器上65°C、1200rpm振荡30min进行洗脱。之后常温5000rpm离心2min,收集上清。在每管上清中加入终浓度为0.2M的NaCL和2 μ L蛋白酶K，65°C解交联过夜，苯酚/氯仿抽提，得到纯化的目的DNA。
[0032]
【权利要求】
1.一个通过Notch通路调节胰腺癌细胞EGFR表达的方法，其特征在于使用NotchlsiRNA干扰作用胰腺癌细胞后，EGFR表达明显下降。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于使用的是NotchlsiRNA来干扰胰腺癌细胞。
3.根据权利要求2所 述的检测方法。
【文档编号】C12N5/10GK103992987SQ201410095644
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年3月17日 优先权日:2014年3月17日
【发明者】张玉祥, 刘浩 申请人:首都医科大学