胰腺β细胞增殖的刺激的制作方法

专利名称：胰腺β细胞增殖的刺激的制作方法
技术领域：
本发明提供了一种与胰腺P细胞增殖和/或胰岛素分泌相关的 新型蛋白、编码该蛋白的核酸和构建体以及包含该核酸和构建体的
细月包。本发明还^是供了 TMEM27蛋白的诊断学和治疗学应用。
背景技术：
为了维持生理性生长和肥胖过程中的血糖量正常，胰腺P细胞 增殖是一种重要的适应机制。越来越多的证据表明(3细胞质量是动 态的，并且在胰岛素4氐抗和妊娠过程中对胰岛素分泌的要求有所增 加，这可能引起p细胞质量迅速而明显的变化。p细胞质量由p细 胞生长(复制)和(3细胞死亡(凋亡)之间的平衡来控制，然而， 控制p细胞质量的因素的分子基础仍有待阐明。理解P细胞质量是 如何调控的，对于设计合理途径以在胰岛素抵抗状态下防止胰腺(3 细胞损失以及扩充用于1型糖尿病中的移植的p细胞非常重要。
在发育过程中，(3细胞由月夷l^f且细胞群产生。由一且细月包分4匕的 P细胞是有丝分裂期后的，直接谱系示踪研究表明祖细胞群在胚胎 形成的整个过程中持续存在，以允许新P细胞的分化。在新生儿期， 新p细胞通过分化的|3细胞复制而形成，引起(3细胞质量的巨大增 加。除了在需求增加的条件下，成人期(3细力包lt量几乎没有增加。 在妊娠过程中，在啮齿动物和人类中，均)現察到(3细胞显著增殖。 这是由于暴露于胎盘催乳素(PL )、催乳素(PRL )和生长激素(GH )的|3细胞减数分裂活性增加。人们对病理性胰岛素一氏抗状态下的生 长刺激信号则理解得比專交少。
几种胰岛素抵抗和糖尿病的小鼠模型，例如和JM伤小 鼠或者通过胰岛素受体底物-1 (IRS-1)基因失活或力夷岛素受体和 IRS-1的双杂合(DH)敲除产生的突变小鼠，表现出显著的胰岛增 殖。相反，IRS2功能的丧失则引起(3细胞显著减少和糖尿病。已知 葡萄糖本身刺激P细胞复制，然而，多种上述小鼠模型在出现可冲企 测的高血糖症之前，其总胰岛质量已经增加了。而且，大多数情况 下，所述增殖反应与高血糖症水平没有关系，暗示可能有不依赖于 葡萄糖的因素促进胰岛生长。
发育过程中的内分泌胰腺生长依赖于多种转录因子，所述转录 因子表现出高度特异的时空表达模式，其控制细胞分化机制。在早 期月夷A泉发育过程中，内分泌一且细胞的细月包命运决策和分泌祖细月包分 化成产生激素的胰岛细胞，受到特异性转录因子顺序表达的严密调 控。这些因子的表达对于维持成人(成体)生命中的正常胰腺p细 胞功能也非常重要。例如，几种转录因子的突变导致2型糖尿病的 一个亚型，称为青春晚期糖尿病(MODY)，其特征在于常染色体显 性遗传、发病年龄早，且形成具有胰岛素分泌累积性障碍的显著高 血糖症。MODY最常见的形式由编码肝细胞核因子(Tcfl)的基因 突变引起。Tcfl功能丧失的突变小鼠以及转基因小鼠(其表达膽A泉 P细胞中天然存在的显性失活形式的人HNF-1 (P291fsinsC)),由 于葡萄糖剌激的胰岛素分泌障碍，表现出随年龄累积的高血糖症。 这些小鼠表现出P细胞数量、增殖速率和胰腺胰岛素含量的累积性 减少。这些数据表明Tcf-l耙基因对于维持正常p细胞质量也是必 需的，尽管其身份仍然未知。

发明内容
在一个具体实施方式
中，本发明提供一种分离的核酸，其包含
编码TMEM27蛋白的基因的调控区，其中所述调控区包含至少一 个Tcfl蛋白的高亲和力结合位点。在一个具体实施方式
中，所述调 控区具有对应于或同源于SEQIDNO:10或11的核酸序列。在另一 个具体实施方式
中，所述结合4立点包含只f应于或同源于SEQ ID NO:12、 13、 14或15的核酸序列。在另一个具体实施方式
中，本 发明提供一种细胞，或者在另外一个具体实施方式
中，提供包含本 发明核酸的载体。
在另一个具体实施方式
中，本发明提供一种分离的多肽，其包 含TMEM27蛋白的分泌形式，其中所述多肽大小约25 kDa，且包 含对应于或同源于SEQ ID NO:16的序列的N-末端片^:。
在另一个具体实施方式
中，本发明提供一种增加胰腺P细胞质 量的方法，所述方法包4舌用TMEM27多月太4妻触膽J^ (3细月包或可经 i秀导变成力夷〗泉P细力包的细胞，且一是供有利于P细胞增殖的条件。
在另一个具体实施方式
中，本发明提供一种增加胰腺(3细胞质 量的方法，所述方法包括用编码TMEM27多肽的核酸4娄触月臭&， p 细胞或可经诱导变成胰腺P细胞的细胞，且提供有利于所述核酸表 达的条件。
在另 一个具体实施方式
中，本发明提供一种改变患者新陈代谢 的方法，所述方法包4舌用TMEM27多肽或编石马所述TMEM27多肽 的核酸接触胰腺P细胞或可经诱导变成胰腺卩纟田月包的纟田月包。
在另一个具体实施方式
中，本发明提供一种抑制、遏制或治疗 患者^f唐尿病的方法，所述方法包4舌用TMEM27多肽或编码所述TMEM27多肽的核酸接触胰腺P细胞或可经i秀导变成月夷&泉|3细胞的 纟田月包。
在另一个具体实施方式
中，本发明提供一种估计患者胰岛质量 的方法，所述方法包4舌确定所述患者血清中TMEM27 ;农度的步-骤 以及将所述浓度与对照浓度进行比#交的步骤。
在另一个具体实施方式
中，本发明提供一种用于鉴定与 TMEM27蛋白或其分泌形式相互作用的蛋白的方法，所述方法包括 在足以^足进所述多肽与所述感兴趣分子之间特异性相互作用的条 件下，用感兴趣分子4妻触TMEM27多肽一革殳时间，以及鉴定所述 感兴趣分子的步-骤。
在另一个具体实施方式
中，本发明提供一种增加胰腺(3细胞质 量的方法，所述方法包括用丝氨酸或金属蛋白酶抑制剂4妾触减J泉(3 细胞或可经诱导变成胰腺p纟田月包的纟田月包，并才是供利于所述核酸表达 的条件。
在另 一 个具体实施方式
中，本发明提供 一 种改变患者新陈代谢 的方法，所述方法包括用用丝氨酸或金属蛋白酶抑制剂4妻触膽Ji (3 细胞或可经诱导变成胰腺p纟田月包的纟田月包。
在另一个具体实施方式
中，本发明—提供一种抑制、遏制或治疗 患者糖尿病的方法，所述方法包括用丝氨酸或金属蛋白酶抑制剂接 触胰&i (3细月包或可经i秀导变成月夷i^卩纟田月包的细月包。


图l表明TMEM27的表达受Tcfl调控。(A)相比野生型小鼠 对照，7b/,-小鼠胰岛中的TMEM27表达降低。用RT-PCR测定表达水平，GAPDH用作对照。(B)启动子分析在人类调控区(SEQID NO: 10)和小鼠调，控区(SEQ ID NO: 11 ) TMEM27基因上游预 测了两种保守的Tcf结合位点，位于相对于转录起始位点-60和-117的碱基对。将人类和小鼠启动子序列进行比对，并将Tcf结合 位点用蓝色框起来。第二位点(红框)表示推定的Pdx-l结合位点。 力口亮的序歹'J (绿色)表示突变Tcf结合位点的位置。(C ) HepG2细 胞中的转录激活分析，该细胞用pcDNA3或pTcfl、 pCMV-(3-半乳 冲唐芬酶和利用815 bp TMEM27小鼠启动子的萤光素酶才艮告子基因 进行转染。Tcf结合位点在所述才艮告载体的启动子序列中单独发生 突变，而MIN6纟田月包用载体pT271uc-wt、 pT271uc—ml或pT271uc—m2 进行转染。将萤光素酶活性相对于卩半乳糖苷酶活性进行标准化。 每一个数值均代表8次独立试验的平均值。(D )利用针对Tcf结合 位点1和2的寡核普酸以及MIN6的总细胞^是耳又物进^亍的EMSA分 析。竟争物表示50倍过剩、针对结合位点1和2的未标记双链寡 核香酸。暗色(深色)楔子表示Tcfl与标记32P标记的探针之间的 相互作用，亮色(浅色)楔子表示加入a-Tcfl抗体后该相互作用的 抗体月交移动。Pdxl也结合于位点2,因为该相互作用可以通过抗 -Pdxl 4元体而变动。(E) MIN6细月包中的ChIP分冲斤i正实了 Tcfl与 TMEM27启动子的体内相互作用。通过PCR扩增跨越结合位点1 和2的150 bp区域。该相互作用在不表达TMEM27的原4气肝细胞 中不存在。用于Tcfl的ChIP通过扩增ApoM启动子内^争越Tcfl 结合位点的区域而进行验证。
图2表明TMEM27在发育过程中的小鼠胰腺中表达。用抗 Col-4、抗胰岛素和抗胰高血糖素抗体对来自小鼠发育过程指定时间 点的石蜡包i里"夷"泉组织进4于免疫荧光。
图3表明TMEM27是N-糖基化蛋白且形成二聚体。(A)将 MIN6细胞与量不断增加的衣霉素一起孵育，衣霉素在天(门)冬酰胺残基抑制4唐基化作用。^又向细月包加7、 DMSO则无效应。(B) 将MIN6细胞的上清与N-聚并唐酶一起孵育。Western印迹中的分子 量变动表示所述酶乂人分泌的TMEM27去除了寿唐部分。分泌蛋白用 抗Col-3抗体进行4企测。(C )将MIN6细胞裂解物与PBS或交耳关剂 DTBP和BMH —起孵育。非还原条4牛下的SDS-PAGE和利用抗 Col—4抗体的免疫印迹显示有一个条带的分子量为全长TMEM27分 子量的2倍。在还原条件下，在PBS和DTBP处理的细刀包裂解物中 则4又才企测到单体。相反，由于BMH交耳关不可逆，所以在BMH处 理的样品中，二聚体持续存在。
图4表明TMEM27从胰岛的|3细胞上切割并分泌。(A)在 MIN6细月包的Western印迹中，抗Col-4抗体冲企测到TMEM27的两 个条带。在过表达pTMEM27.V5-His的细胞中，25kDa条带变4寻更 加丰富。(B)来自(A)的细胞裂解物的免疫印迹用抗a-V5抗体 进行斗企观'J。在pTMEM27.V5-His转染的细胞中，抗V5抗原表位的 抗体也才全测到两种条带，在pcDNA3转染的细胞中则未才佥测到。 (C)表示细月包系用pcDNA3或pTMEM27进4亍转染，用抗Col-4 在细月包裂解物的Western印迹中才全测到了全长蛋白。用抗Col-3则 仅在MIN6细胞的上清中才全测到分泌蛋白。全长蛋白表达增加仅引 起MIN6细胞中分泌蛋白的量增加。(D)分离小鼠胰岛并孵育72 小时。收集上清并将力夷岛转移至裂解IC冲液中。在裂解物的Western 印迹中用抗Col-4检测到全长蛋白，在用相同体积上清上样的进行 的Western印迹中则用抗Col-3 4全测到分泌蛋白。(E ) MIN6细月包用 4十对GFP或TMEM27的siRNA进4亍电穿孔。在用si-TMEM27#l 和#2进4亍电穿孔的细月包中，于电穿孔后48小时用抗Col-4 4企测到 TMEM27蛋白水平的降低。用来自相同细胞、体积相等的上清进行 SDS-PAGE,用抗Col-3检测到分泌蛋白的水平降低。(F ) MIN6细 月包用pcDNA3、 pTMEM27或pTMEM27-HA进4亍电穿孑L。通过利用 抗Col-4抗体的细月包裂解物进4亍Western印迹，4企测到TMEM27过200680020054.8
说明书第7/44页
表达。来自相同细月包的上清用抗HA抗原表4立的抗体进4亍Western 印迹。
图5表明TMEM27定位于胰腺p细胞的小嚢泡中和细胞膜上。 (A )将MIN6细胞用0.01%皂角戒进行透化并用抗Col-4抗体进行 染色。利用抗Col-3抗体进行免疫荧光显微镜检查，给出了类似结 果。(B)用抗Col-4抗体对MIN6细胞进行电子显微镜检查，将 TMEM27定位于小嚢泡中。轭合于10 nm金颗粒的IgG用于4全测所 述抗体。(C)利用与(B)中相同的方法，在与细胞膜融合过程中 4企测到包含TMEM27的小囊泡。
图6表明TMEM27 i曾力口 p纟田月包的体夕卜复命J。 ( A)在/人 小鼠和野生型小鼠对照分离的胰岛中，用半定量RT-PCR测定 TMEM27的表达水平。GAPDH用作上才羊只于照。(B)在/人4争基因 ^P-^e一/c小鼠及其野生型小鼠(同窝出生^f子)对照中，如上测定 TMEM27的表达水平。(C )从野生型和oM 6小鼠分离的胰岛数量 和大小匹配，并在相同体积的培养基中孵育72小时。用抗Col-3 才全测分泌蛋白。(D) MIN6纟田胞用针对萤光素酶或TMEM27的 siRNA进行电穿孔。摄制20倍放大的细胞代表图像。电穿孔后48 小时，将细胞用胰蛋白酶进行处理、用锥虫蓝染色并用血细胞计数 器进行计数。每一个数值均代表6次独立实验的平均值。(E )MIN6 细胞用pcDNA3或pTMEM27进4亍电穿孑L，如上重复实-验。(F) MIN6细胞如所指定的进行电穿孔，通过["H]胸苷掺入来测量细胞的 复制。
图7表明，响应于月夷&泉卩细月包中TMEM27表达增加而出现胰 岛质量增加。(A)在从RIP-TMEM27转基因小鼠和野生型小鼠对 照分离的月夷岛Western印迹中，用抗Col-4才企观'J到TMEM27表达增 加。(B)将来自转基因和对照动物(n=3)的整个胰腺在石蜡中包 埋，并针对胰岛素进行染色。图像代表每一种基因型在5倍放大的图示。(C )利用Metamorph專欠件对7 pm切片中的月夷岛素染色进4亍 定量。对每一个胰腺，均在距离大于200 pm的切片中定量至少50 个胰岛。(D)将整个胰腺从转基因和野生型小鼠(n二3)上分离， 并在酸/乙醇中均质化。胰岛素含量相对于每个胰腺重量进行标准化。
图8表明TMEM27可以是丝氨酸和/或金属蛋白酶的底物。相 比于与佛波酯佛波(12-)-肉豆蔻酸(-13-)乙酸(PMA)或与BB94+PMA 一起孵育的MIN6细胞，与丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶抑制剂BB94 一起孵育的MIN6细胞具有较低水平抗体识别的已切割N末端。用 抗V5 (其标记TMEM27的C末端)抗体一企测的细力包，在所有小组 中均表现出可比较的条带。
具体实施例方式
在接下来的详细描述中，为了提供对本发明的彻底理解，列出 了大量特殊细节。然而，本领域的技术人员能理解本发明可以在无 这些特殊细节的情况下实施。在其他实例中，为了使本发明清楚， 未对/>知的方法、步骤和组分进行详细描述。
在一个具体实施方式
中，本发明提供一种胰腺p细胞特异蛋白， 其参与p细力包增殖和力夷岛素分泌。
如本文所述，MODY常见形式由编码肝细月包核因子(Tcfl)的 基因突变引起。胰腺(3细胞中Tcfl功能丧失的突变小鼠，由于葡萄 糖刺激的胰岛素分泌障碍，表现出随年龄累积的高血糖症。所述小 鼠表现出p细胞数量、增殖速率和胰腺胰岛素含量的累积性减少， 表明Tcfl耙细胞对于维持正常p细胞质量也是必需的。Tcfl是 TMEM27转录的直4姿激活剂，如本文中所i正实的。本文中显示在胰 l泉发育过禾呈中TMEM27在激素阳性细胞中表达，在成熟膽J^中则限于胰腺卩细胞中表达。已表明TMEM27是一种糖蛋白，在胰腺 中特异性切割并由(3细胞释放，且是体外和体内(3细胞复制的刺激剂。
在一个具体实施方式
中，本发明^是供一种分离的核酸，其包含 编码TMEM27蛋白的基因的调控区，其中所述调控区包含Tcfl蛋 白的至少 一个高亲和力结合^i点。
在一个具体实施方式
中，术语"调控区"指的是启动子，其是 一种DNA序列，在一个具体实施方式
中，其位于编码序列的上游， 对于基因的基础转录和/或调控转录非常重要。
在一个具体实施方式
中，该启动子是内源性启动子，包含Tcfl 蛋白的至少一个高亲和力结合位点。在一个具体实施方式
中，该启 动子是内源性启动子的突变体，其包含至少一个Tcfl蛋白的高亲和 力结合^立点。该启动子序列中的突变可以增强Tcfl结合，或者在另 一个具体实施方式
中延迟Tcfl解离，或者在另一个具体实施方式
中，通过任何途径改变Tcfl与TMEM27启动子的结合，从而影响 其转录。在另一个具体实施方式
中，将根据得到的TMEM27表达 水平来评估这些突变体的启动子强度。
在一个具体实施方式
中，该调控区具有对应于或同源于SEQ ID NO: 10或11的牙亥酉臾序歹'J 。
用于本发明中的核酸可以通过本领域中^^知的任何合成或重 組方法而生成。核酸还可以利用本领域中已知的技术经^奮饰而改变 生物物理学或生物学特性。例如，该核酸可以经〗f饰增加其对核酸 酶的稳定性(例如，"末端加帽")，或改良其亲油性、溶解度或对 互补序列的结合亲和力。这些核酸可以包含载体、表达盒、启动子 序列、感兴趣基因或其任何组合。才艮据本发明所述的DNA也可以通过本领域中已知的方法化学 合成。例如，所述DNA可以通过本领域中已知的方法全部或部分 /人四种核香酸化学合成。这些方法包4舌Camthers(1985)中描述的方 法。DNA也可以通过制备重叠的双链寡核苷酸、填补空缺并将末 端连才妄在一起而合成(通常参见Sambrook et al.(1989)禾口 Glover et al.(1995))。表达该蛋白功能性同系物的DNA可以通过位点指导 (Site-directed )的i秀变4乍用由里予生型DNA制备而4寻到(见例如 Zoller et al.(1982); Zoller(1983);和Zoller(1984); McPherson(1991))。 得到的DNA可以通过本领域中已知的方法而扩增。 一个恰当的方 法是在Saiki et al.(1988)、 Mullis et al.、美国专利第1,683,195号和 Sambrook etal.(1989)中描述的聚合酶链式反应(PCR )法。
在另一个具体实施方式
中，该结合4立点包含对应于或同源 于SEQIDNO:12、 13、 14或15的核酉史序列。
在另一个具体实施方式
中，本发明提供一种包含本发明核酸的 细刀包，或者在另外一个具体实施方式
中，4是供包含本发明核酸的载体。
在一个具体实施方式
中，术语"载体"指的是包含感兴趣序列 (其已经在该载体内亚克隆)的核酸构建体。
为了产生才艮据本发明所述的载体，编码TMEM27调控区的多 核苷酸，(在一些具体实施方式
中，为TMEM27的编码区，而在一 些具体实施方式
中为其^f也感兴趣序列)可以连^妻入市售的表达载体
系统中，所述表达载体系统适于转导/转化真核或原核细月包以指导被 转导/转化的细胞内重组产物的表达。应该理解，为了取代、复制或 突变5见存的启动子或增强子序列和/或？ 1入^H可其〗也多核苷S交序列，
容易通过通常4吏用的重组4支术而改良这些市售载体系统。在另一个具体实施方式
中，才艮据本发明所述的载体可以进一步 包括恰当的可选々奪标记物。该载体可以进一步包括复制起始点，而 且可以是穿梭载体，其既可以在原核细胞又可以在真核细J包中繁 殖，或者该载体可以经构建促进其在选拷^鼓生物基因组内整合。在 其他具体实施方式
中，该载体可以为例如质粒、杆粒、噬菌if立、粘 粒、噬菌体、病毒或人工染色体。在另一个具体实施方式
中，本发 明冲是供包含本发明所述核酸和载体的脂质体。用于制备这种脂质体
的方法在本领域中是7^知的，正如在例如WO 96/18372、 WO 93/24640 、 Mannino 和 Gould-Fogerite(1988)BioTechniques 6(7):682-691、 Rose美国专利第5,279,833号;WO 91/06309,以及 Feigner et al.(1987)Proc. Natl. Acid. Sci. USA 84:7413-7414)中所描述的。
在另一个具体实施方式
中，本发明提供分离的多肽，包含 TMEM27蛋白的分泌形式，其中所述多肽大小约25 kDa,且包含 对应于或同源于下述序列的N末端片革殳
QIDNO:16)。在一个具体实施方式
中，该分泌形式包含142个氨基 酸。在另一个具体实施方式
中该分泌形式包含N末端的100个氨基 酸，或者在另一个具体实施方式
中包含N末端的105个氨基酸，或 者在另一个具体实施方式
中包含N末端的110个氨基酸，或者在另 一个具体实施方式
中包含N末端的115个氨基酸，或者在另一个具 体实施方式中包含N末端的120个氨基酸，或者在另一个具体实施 方式中包含N末端的125个氨基酸，或者在另一个具体实施方式
中 包含N末端的130个氨基酸，或者在另一个具体实施方式
中包含N 末端的135个氨基酸，或者在另一个具体实施方式
中包含N末端的140个氨基酸，或者在另一个具体实施方式
中包含N末端的122个 氨基酸，或者在另一个具体实施方式
中包含N末端的127个氨基酸， 或者在另一个具体实施方式
中包含N末端的117个氨基酸，或者在 另一个具体实施方式
中包含N末端的108个氨基酸。
在一个具体实施方式
中，TMEM27蛋白具有的序列对应于或同 源于一个NCBI，s Entrez蛋白质数据库中4皮露的序列，具有下列登 陆号NP—065651、 AAH50606、 AAH15099、 XP_416821、 AAH49912 或者AAH14317。在一个具体实施方式
中，本发明所述的多肽包含 的氨基酸对应于TMEM27蛋白1-142位置的氨基酸，或者在另一个具体实施方式
中对应于其N末端片H或者在另一个具体实施方式
中，对应于其同系物。
在一个具体实施方式
中，任何情况下，术语"同源性"、"同系 物"或"同源的"均表示所-提到的序列，无论是氨基酸序列还是核 酸序列，均表现出与指定序列至少70%的一致性。在另一个具体实 施方式中，所述氨基酸序列或核酸序列表现出与指定序列至少72% 的一致性。在另一个具体实施方式
中，所述氨基酸序列或核酸序列 表现出与指定序列至少75%的一致性。在另一个具体实施方式
中， 所述氨基酸序列或核酸序列表现出与指定序列至少77%的 一致性。 在另 一个具体实施方式
中，所述氨基酸序列或核酸序列表现出与指 定序列至少80%的一至丈性。在另一个具体实施方式
中，所述氨基酸 序列或核酸序列表现出与指定序列至少82%的一致性。在另一个具 体实施方式中，所述氨基酸序列或核酸序列表现出与指定序列至少 85%的一致性。在另一个具体实施方式
中，所述氨基酸序列或核酸 序列表现出与指定序列至少87%的一致性。在另一个具体实施方式
中，所述氨基酸序列或核酸序列表现出与指定序列至少90%的一致 性。在另一个具体实施方式
中，所述氨基酸序列或核酸序列表现出 与指定序列至少92%的一致性。在另一个具体实施方式
中，所述氨基酸序列或核酸序列表现出与指定序列至少95%的一致性。在另一 个具体实施方式
中，所述氨基酸序列或核酸序列表现出与指定序列
95%-100%的一致性。类似地，如在本文中4吏用的，才是到与一个特 定序列的 一致性既包括直接对应，也包括与该序列的同源性，如在 本文中所定义的。
在一个具体实施方式
中，术语"多肽"指的是蛋白，在另一个具体实施方式
中指的是蛋白片段，或者在另一个具体实施方式
中指 的是一串氨基酸。在一个具体实施方式
中，在提到本发明的任何多 肽时，提到"肽"或"多肽，，，其意思既包括天然肽(降解产物、 合成肽或重组肽)以及拟肽(通常是合成肽)，例如类肽和半类肽， 其为肽类似物，可能含有(例如)修饰使得所述肽在体内更加稳定 或者更易于渗入细胞内。这种修饰包括但不限于N末端、C末端或 肽键修饰，后者包括但不限于主链修饰和残基修饰，每一种均代表 本发明 一个另外的具体实施方式
。用于制备拟肽化合物的方法是本 4贞；或中公岁口， 且在侈'H口 Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd.， Chapter 17.2， F. Choplin Pergamon Press(1992)中进4亍了 i,纟田i兌明。
应该理解，通过任何途径得到的天然或合成的任何氨基酸序 列，只要表现出与本文中所描述多肽的序列、结构或功能同源性， 均i人为是本发明的 一部分。
在一个具体实施方式
中，在l是到^f壬何核酸序列时，术语"同源 性"均表示候选序列中的核苷酸与相应的天然核酸序列核苷酸一致 的百分比。
同源性可以利用本领域中详细描述的方法通过用于序列比对 的计算才几算法来确定。例如，核酉殳或氨基酉吏序列同源'l"生的计算才几算 法分析可以包括利用任何数量的可用软件包，如BLAST 、 DOMAIN、BEAUTY (BLAST Enhanced Alignment Utility), GENPEPT和 TREMBL包。
另 一种确定核酸同源性的方法是通过确定候选序列的杂交作 用，其方法在本领域中已经详细描述过(见例如"Nucleic Acid Hybridization" Hames， B.D., and Higgins S ., Eds.(1985); Sambrook et al., 1989， Molecular Cloning, A Laboratory Manual,(Volumesl-3)Cold Spring Harbor Press, N.Y.; 以及 Ausubel et al" 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.)。例如，对编码天然半月光天冬酶肽的DNA的互补 物，杂交方法可以在中度到严4各条件下实施。杂交条件为例如在一 种溶液中42。C孵育过^艾，该溶液中含有10-20%甲酰胺、5xSSC
(150 mM NaCl、 15 mM枸片缘酸钠)、50 mM石粦酸钠(PH 7.6)、 5xDenhardt，s液、10%碌u酸葡聚糖以及20 |ig/ml变性的剪切鲑精 DNA。
在另一个具体实施方式
中，本发明冲是供特异性识别本发明所述 多肽的抗体。这样一种抗体的生产在本领域中是公知的，可以包括 如Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988中描述的方法。在一个具体实施 方式中，这种抗体可以包含功能片段，其为本领域中技术人员所熟 知，且可以通过抗体的蛋白水解或者通过编码该片,殳的DNA在 E.coli或哺乳动物细胞(例如中华仓鼠卵巢细胞培养物或其他蛋白 表达系统)内表达而制备。
在另一个具体实施方式
中，本发明提供包含本发明所述细胞、 多肽、抗体、核g臾和载体的组合物。特定组合物制剂的有效剂量和 纟合药方法可以才艮才居净争定应用而不同。剂量可以作为(例如)所采用 载体类型和纟合药途径的函凄t而变动。在另一个具体实施方式
中，本发明提供包含本发明所述核酸、 载体或多肽的细胞。在一个具体实施方式
中，该细胞为原核细胞， 或在另一个具体实施方式
中，所述细胞为真核细胞。细胞可以为任 何能够表达本发明所述分离的核酸和/或载体的细胞，如本领域中技 术人员已知的。在一个具体实施方式
中，细胞可以过表达本发明所 述的多月太。
在另一个具体实施方式
中，细胞响应本发明所述的多肽。在一
个具体实施方式
中，所述细胞是胰腺(3细胞或可能分化为胰腺(3细 胞的细胞。在一个具体实施方式
中，所述细胞一旦暴露于TMEM27 (在一个具体实施方式
中，其为全长蛋白，或者在另一个具体实施
方式中，其为已切割的分泌形式)就出现增殖，或者在另一个具体 实施方式中分泌月夷岛素，或者在另一个具体实施方式
中，既增殖又 分泌月夷岛素。在一个具体实施方式
中，所述细月包是终末分化的，或 者在另一个具体实施方式
中为不分裂的。在另一个具体实施方式
中，所述细胞是分裂的。
在一个具体实施方式
中，本发明^是供核酸、载体、多肽、细月包 以及包含上述物质的组合物，在另一个具体实施方式
中，其可能经 配制用于口月l给药，在另一个具体实施方式
中经配制用于局部给 药，例如通过气雾剂、肌内或经皮肤给药或者通过肠胃外应用。根 据纟会药方法的不同，组合物可以以多种单^f立剂量形式乡会药。恰当的 单位剂量形式包括但不限于粉剂、片剂、丸剂、胶嚢、锭剂、栓剂 等。经皮肤给药可以通过应用能够允许活性化合物渗入皮肤的膏状 物、沖洗剂、凝胶等而实现。肠胃外给药途径包括但不限于电注射 或直接注射例如直接注射入中枢静脉输血导管、静脉内、肌内、腹 月莫内、皮内或皮下注射。
本文中i正实TMEM27在新生儿和成人月爽&，的月夷岛(3细月包内表 达(图2 ),且发现TMEM27蛋白的N末端切割产物被分泌(图4 )。卩细胞系响应于TMEM27而增殖(图6)，由于所述转基因的表达， 过表达该蛋白的转基因小鼠表现为P细胞质量增加(图7 )。
在一个具体实施方式
中，本发明^是供一种增加"夷〗漆(3细胞质量 的方法，其中所述方法包4舌用TMEM27多肽4妻触细月包。才艮据本发 明所述的这个方面，且在一个具体实施方式
中，所述细胞是"夷&泉(3 纟田月包，或者所述细月包可以经i秀导变成月夷&， |3纟田月包，并才是供利于P细 月包增殖的条件。
在一个具体实施方式
中，术语"接触细胞"指的是细胞暴露于 本发明所述的肽、核酸或组合物。细胞可以与本发明所述的化合物 和组合物直接接触，或者通过本领域中已详细描述的方法间接暴 露。例如，在体外培养基中生长的细胞，其中所述培养基用本发明 所述的多肽、核酸、载体或组合物加以补充，为一种4妾触细力包方法 的实例，且认为是本发明的一部分。在另一个具体实施方式
中，接 触细胞可以包括任何对患者的给药途径，例如将本发明所述的肽、 核酸、载体或组合物通过口服或肠胃外给予患者，其中给药4吏得体 内特定部位中的体内细月包暴露于这些物质。
在一个具体实施方式
中，所述^^接触细月包是原^i咅养物。在一 个具体实施方式
中，"原代培养物"表示允许从组织中分离的多种
不同细胞类型相互作用的混合细胞群。例如，胰腺导管细胞的原代 培养物可以允许间充质细胞和上皮细胞之间的相互作用。
在另 一个具体实施方式
中，原^培养物可以为,人组织中分离的 纯化细胞群。在一个具体实施方式
中，所述原代培养物可以对一种 特殊(细胞)群进行富集。在一个具体实施方式
中，富集可以包括 通过本领i或中7>知的方式进4亍细月包分选，例如荧光〖敫活细月包分类术 (FACS),用于例如表达特定细胞表面标记物的细胞群，或者在另 一个具体实施方式
中，用于无特定标记物的细胞表面表达的细月包群。在另一个具体实施方式
中，可以采用磁分离法，或者在另一个具体实施方式
中，可采用密度离心法如聚蔗糖-泛影葡胺或蔗糖梯度 分离法。
在一个具体实施方式
中，根据本发明方法所述的被接触细胞是
干细月包或-且细月包。术i吾"一且细月包"作为"干细月包"的同义词4吏用， 在一些具体实施方式
中指的是能够增殖并产生更多^且细月包的未分 化细胞，所述祖细胞具有产生大量母细胞的能力，母细胞又能产生 分化的或可分化的子细月包。在一个具体实施方式
中，术语-且细月包或 干细胞指的是无显著特点的母细胞，其后代(子代)常常可以通过
在胚胎细胞和组织的渐进性多样化中所发生的。细胞分化是一种复 杂过程，通常通过多次细胞分裂而发生。分化的细胞可以起源于多 潜能细胞，其本身来自多潜能细月包，等等。应该理解任何这种细胞 均可用于本发明所述的方法，或者包含本发明所述的细胞。这种能 力可以是天生的，或者可以在用多种因子治疗后人工i秀导，两种方 案之一均可认为是所述细胞的具体实施方式
，其可才艮据本发明所述 的方法而使用，或者包含本发明所述的细胞。
在一个具体实施方式
中，本发明所述的细胞以及用于本发明所 述方法的细胞来源于胰腺，或者可分化为胰腺细胞。在一个具体实 施方式中，术语"胰腺"通常指的是横向位于胃后、脾和十二指肠 之间的大、伸长、总状分枝的腺体。在一个具体实施方式
中，才艮据 本发明所述的细胞可以包括组织切片或整个组织，其包括本文中所 述的多肽、核酸、载体或组合物。在另一个具体实施方式
中，才艮才居 本发明所述的方法包括器官培养物，或者在另一个具体实施方式
中，包括组织切片或组织片段，其包含感兴趣细胞群。在一个具体 实施方式中，使用胰岛作为该细胞并用于本发明的方法中。在一个具体实施方式
中，所述细胞是卩细胞，可构成胰岛细胞的60-80%,
和/或可用于本发明所述的方法中。
在一个具体实施方式
中，所述细胞是胰腺祖细胞。在一个具体
实施方式中，术语"胰腺祖细胞"指的是可以分化为胰腺i普系细胞 的细月包，例如能产生通常由胰腺细胞产生的激素或酶的细胞。例如， 可以引起胰腺祖细胞至少部分分化为a、 p、 y或5胰岛细胞或者具 外分泌命运的纟田月包。本发明所述的胰腺祖细胞也可以在给予患者前 在能够促进细胞增殖和分化的条件下培养。这些条件包括培养细胞 允许体外增殖和融合，这时，所述细胞可以经制备形成々U夷岛状聚
集体或簇，并分泌胰岛素、胰高血糖素和/或生长抑素。
在一个具体实施方式
中，本发明所述的细胞以及用于本发明所 述方法的细胞，可以为基本纯化的细胞群。在一个具体实施方式
中， 术语"基本纯化的"指的是一群细胞，相对于整个细胞群，其至少 约65%,或者在另一个具体实施方式
中至少约70%,或者在另一个具体实施方式
中至少约75%，或者在另一个具体实施方式
中至少约 85%,或者在另一个具体实施方式
中至少约90%,或者在另一个具 体实施方式中至少约95%为纯4匕的。
可以采用多种技术从组织获得细胞(分化和未分化的)悬浮液， 构成本发明所述细胞和/或用于本发明所述方法。在一些具体实施方 式中，分离操作是那些尽可能少地引起细胞死亡的操作。例如，所 述细月包可以通过积4成方式,人分离块才羊品中耳又出，例如用移'液管积4成 剥离。在其他情况下，可能从整个分离块或其一部分解离祖细胞， 例如通过酶消化该分离块，随后冲艮据特定细月包标i己物分离激活的对且 细胞群，例如利用亲和力分离4支术或荧光激活细胞术(FACS)。细 月包可以通过离心乂人'液体才羊品例^口血、液中获《寻。通常，所述组织可利用<壬4可恰当方法制备，例如通过轻柔湘匕拨 离体组织或通过用胶原酶(例如胶原酶A)消化离体组织，借助于 (为了阐明)通过导管渗透或例如将剥离组织在含有恰当pH和张 力强度的緩沖液的胶原酶中的简单孵育。可选地，随后所述制备的 组织可以利用恰当的方法和材冲牛浓缩，例如通过聚蔗糖梯度离心来 浓缩(或者部分纯化)。浓缩的组织随后重悬于任何恰当的容器中， 例如3皮璃或塑料组织培养器皿中。在某些具体实施方式
中，所述样
品月夷&i组织可允许形成融合的单层培养物，NACs可形成自该培养 物。在其他优选的具体实施方式
中，所述细胞悬浮液置于非黏附的 培养容器中，且形成祖细胞球。
在一个具体实施方式
中，所述细月包起源的纟且织可以为成人《且织 或胎儿组织或任何发育阶段的组织。而且，所述方法可以用相对小 量的初始材料实施。因此，无需处死或严重伤害供体，即可获得供 体的小组织样品。本发明的祖细胞可以扩增，且随后从组织冲羊品分离。
在某些具体实施方式
中，可以用生长因子或包含生长因子(例 如有丝分裂生长因子)的组合物接触培养物，例如，所述生长因子 选自由IGF-1、 IGF-II、 LIF、 TGFa、 TGF(3、 bFGF、 aFGF、 HGF 或Hedgehog组成的组。在其4也具体实施方式
中，所述生长因子是 TGFP超家族的成员。在一些具体实施方式
中，才艮据本发明所述的 方法包含如本文所述将组合物给予患者，其中所述组合物可以包含 本发明的细胞、多肽、核酸和/或载体，还包括本文所述的任何添加 剂，包含例如糖尿病疗法、生长因子、cAMP增强剂等。
在一些具体实施方式
中，所述细月包或i咅养物中的细月包用cAMP 增强剂(或者包含cAMP增强剂的组合物)接触，例如8-(4-氯苯 石克代)-阿冲唐腺普-3，:5，-环-一石粦酸(盐)(CPT-cAMP)(参见例如Koike Prog. Neuro-Psychopharmacol, and Biol. Psychiat.16 95-106(1992》、CPT-cAMP、福斯高林、丁酸钠、3-异丁基-l-曱基黄嘌呤(IBMX)和 霍舌L毒素(见Martinetal.J. Neurobiol.23 1205-1220(1992))以及8-溴-cAMP、 二丁酰cAMP和二辛酰cAMP(例力口，见Rydel et al. PNAS 85:1257(1988))。
在一些具体实施方式
中，所述细胞或培养物中的细胞用类固醇 或皮质类固醇(或者包含类固醇或皮质类固醇的组合物)4妄触，例
如氢^^可的枉\脱氧氢^b可的+乂氟氢可的杠\ 去氢氢^b可的+〉、 曱基去氢氢化可的松、去氢可的松、氟羟泼尼松龙、地塞米松、倍
他米松和对氟米松。 一般参见，The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed.,pp.l239-1267和2497-2506, Berkow et al" eds., Rahway N丄，1987)。
现在存在多种组织培养基适于培养来自动物包括人的组织。在 一些具体实施方式
中，组织培养基可以为简单培养基，例如 Dulbecco，s必需基本培养基(DMEM )。在另一个具体实施方式
中， 纟田月包、组织等在含有5% FBS的Isobecco，s改良MEM细月包i咅养基 中培养。在另一个具体实施方式
中，纟田月包、组织等在无血清的情况 下长期维持。在本发明的一些具体实施方式
中，所述生长因子或其 他有丝分裂剂未包括在用于体外维持培养物的原代培养基中，但随 后可用来引起不同细胞(例如祖细胞)群增殖。
在另一个具体实施方式
中，干细胞由于其在缺乏对培养表面的 黏附时仍能够生长的能力，因而可以直4妻或间4妻富集。在一些具体 实施方式中，干细胞在悬浮液中自由浮动，而不与培养容器表面或 相4妄触的其他细月包或材诗牛形成固定或半固定4妻触。
在一个具体实施方式
中，4艮据本发明所述的细月包用于(且本发 明所述方法4是供可移植细胞源)其分化子代的祖细胞群形式中，或 者在另 一个具体实施方式
中，受体细胞可用来产生胰腺细胞培养物以4寻到并纯4匕分泌因子，例如TMEM27的分泌形式。在另一个具 体实施方式中，培养的细胞可以作为胰岛素源而提供。
在另一个具体实施方式
中，本发明4是供一种增加膽J泉p细月包质 量的方法，所述方法包含用编石马TMEM27多肽的冲亥S臾，接触细月包， 所述细胞是胰腺(3细胞或者可以经诱导变成胰腺p细胞的细胞，以 及冲是供有利于所述核酸表达的条件。
在一个具体实施方式
中，p细月包质量增力口通过增力口 p细月包增殖 而实现。在一个具体实施方式
中，卩细月包质量增加是由于^且细月包分 化成(3细胞系增力口。在一个具体实施方式
中，(3细胞质量增加指的 是细胞转换或死亡减少。在另一个具体实施方式
中，p细胞质量增 加指的是上述具体实施方式
的^H可组合。
细胞增殖可以通过本领域中公知的任何数量的方法来确定，如 本文中所例示的，例力口通过测定吸4t标i己的底物，例力口氚标i己胸普, 正如本领域中才支术人员已知的。
在另 一个具体实施方式
中，本发明4是供一种改变患者体内新陈 代谢的方法，所述方法包括用TMEM27多肽或编码所述TMEM27
月夷&泉(3纟田月包的纟田月包。
在一个具体实施方式
中，改变新陈代i射指的是增加新陈代i射， 而在另一个具体实施方式
中，其指的是减少新陈代谢。在一个具体 实施方式中，葡萄糖代"i射,皮改变。在一个具体实施方式
中，所述细 胞在体外或离体进行接触。在另一个具体实施方式
中，所述细胞在 体内接触。在另一个具体实施方式
中，所述细胞是干细胞或祖细胞。 在另 一个具体实施方式
中，所述细胞从患糖尿病或易患糖尿病的患
者中分离。在一个具体实施方式
中，所述方法包括将接触过的细胞给予所 述患者的步骤，例如离体细胞治疗。在一个具体实施方式
中，给予 患者的细胞相对所述患者是自体同源的，或者在另 一个具体实施方 式中，相对所述患者是同种异体的。
在一个具体实施方式
中，所述细月包用TMEM27多肽进4亍冲妻触， 所述多肽包括全长蛋白或其片段。在一个具体实施方式
中，所述片 段包含TMEM27蛋白的分泌形式。在另一个具体实施方式
中，所 述分泌形式大小约25 kDa，包含TMEM27蛋白的氨基酸1-142，或
其片革殳，或其同源的序列。
在一个具体实施方式
中，所述细胞还可以用蛋白酶抑制剂进行 4妄触。在一个具体实施方式
中，蛋白酶抑制剂是遏制、防止、减少、 延纟爰，或以任何方式改变蛋白酶活性或表达或二者的分子。
在一个具体实施方式
中，所述蛋白酶抑制剂是丝氨酸蛋白酶抑 制剂(Serpin)、金属蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、硫代 蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂、苏氨酸蛋白酶抑制剂、门冬氨酸 蛋白酶抑制剂或其组合。
在 一 个具体实施方式
中，蛋白酶抑制剂是 (HONH-COCH2CH2CO-FA-NH2) 、 (OA-Hy;顺式-9-油酸酰基-N-羟 酰胺；油酰-N-氢化环酰胺),、(N-[[(4,5-二氢-5-碌u代-l，3,4-噻二唑-2-基)氨基]羰基]-L-苯丙氨酸曱酯)、U-[[[4，5-二氢-5-硫代-l,3,4-噻二 唑-2-基)氨基]羰基]氨基]-((2-吡啶基)哌嗪基-(S)-苯丙烷酰胺)、 { (2R)-2-[(4-二苯磺酰)氨基]-3-苯丙酸}、 { (2R)-[(4-二苯磺酰)氨 基 ]_N- 羟 基 -3- 苯 丙 酰 胺 } 、 H-Cysl-Thr陽Thr-His-Trp-Gly-Phe-Thr-Leu-CyslO-OH 、 (SB-3CT)、 (Ac-RCGVPD-NH2;基质溶解素-1抑制剂)、[N-异丁基-N-(4-甲氧 苯石黄酰)-甘氨酰异羟肟酸;NNGH](N-[[4，5-二氢-5 J克代-1,3,4-p塞二唑-2-基)氨基]羰基]-L-苯丙氨酸}、 (a-[[[4,5-二氢-5-硫代-1，3，4-噻二唑 -2-基)氨基]-羰基]氨基]-N-(环己基甲基)-(S)-苯丙酰胺}、 4-二苯呋喃 -2q>-基-4-肟基-丁酸、[4- (4cp-联苯)-4-肟基-丁酸]、{ ( 3R ) - ( + ) -[2-(4-曱氧基苯磺酰)-1，2,3，4-四氢异喹啉-3-异羟肟酸盐]}、 { (3S) —(_) —[2— (4-曱氧基苯磺酰)-1,2,3,4-四氢异喹啉3-异羟肟酸酯])、 [N-羟基—1- (4-甲氧苯基)磺酰-4- (4-二苯羰基)哌嗪-2-羧酰胺]、 [N-羟基-l— (4-曱氧苯基)磺酰-4千氧羰基哌嗪-2-羧酰胺]、(1,10-二氮菲一水合物)、马马司他、普啉司他、坦诺司他、新伐司他、唑 来膦酸或其组合。
在一个具体实施方式
中，所述抑制剂是al-抗胰蛋白酶、a1-抗 胰凝乳蛋白酶、a2-抗血纤维蛋白酶(在一个具体实施方式
中，其为 纤维蛋白溶解作用的抑制剂)、抗纤维蛋白酶(在一个具体实施方式
中，其为血液凝固抑制剂，特别是因子X、因子IX和凝血酵素)、 补体1抑制剂、神经丝氨酸蛋白酶抑制剂(Neuroserpin，在一个具 体实施方式中，其在一些家族形式的痴呆中发生突变)、纤溶酶原 激活剂抑制剂1和2 (在一个具体实施方式
中，其为纤维蛋白溶解 作用抑制剂)、蛋白Z相关的蛋白酶抑制剂(ZPI,在一个具体实施 方式中是灭活因子Xa和因子XIa)或其组合。
在另一个具体实施方式
中，所述蛋白酶抑制剂是亮肽酶素、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟化氢氯化物(AEBSF)、抑酞酶、抑糜酶素、 抗纤维蛋白酶m、 3,4-二氯异香豆素、L-1-氯-3-[4-曱苯磺酰基-氨 基]-7-氨基-2-庚酮-HCl(TLCK)、 TPCK、氟磷酸异丙酉旨(DIFP)、抗痛 素、4-脒基苯曱基磺酰-氟-HCl(APMSF)、苯甲基磺酰氟化物(PMSF)、 3，4-二氯异香豆素(DCI)、 a-对曱苯碌酰氟、BB94、 a2-巨球蛋白或 其组合。在一个具体实施方式
中，所述蛋白酶抑制剂是EDTA、钒、钼 酸盐、1,10-二氮菲、磷酸阿米酮、抑氨肽酶素、抑氨肽酶素b、放 线酰胺素、抑二肽素、BB94、 a2-巨5束蛋白或其组合。
在一个具体实施方式
中，所述蛋白酶抑制剂是N -己基顺丁烯二 酰亚胺、亮肽酶素、L-反式环氧-琥珀酰-亮氨酰-氨基-(4-胍基)-丁烷 (E-64)、抑糜酶素、抗痛素、a2-巨球蛋白、PMSF、 PEFABLOC或
其组合。
在一个具体实施方式
中，所述蛋白酶抑制剂是胃蛋白酶抑制剂 A、 a2-巨球蛋白、或其组合。在另一个具体实施方式
中，所述蛋白 酶抑制剂是BB94或巴马司他，在一个具体实施方式
中，其为丝氨 酸或金属蛋白酶抑制剂。在一个具体实施方式
中，所述蛋白酶抑制 剂是可逆的，而在另一个具体实施方式
中，所述蛋白酶抑制剂是不 可逆的。
在另一个具体实施方式
中，所述细胞可以用PKC抑制剂进行 接触，在一个具体实施方式
中，其为沙芬戈(L-苏-二氢(神经)鞘氨 醇)、Ro-l、 Ro32-0432 (双吲咮马来酰亚胺4又胺)、UCN-01 ( 7-OH-十字孢石威)、Flavopiridol (L86-8275,—种黄酮类抗癌新药)、苔藓抑 素l(大环内酯)、双吲咮马来酰亚胺I、 InSolutionTM双吲哚马来酰
亚胺i、氢氯^f匕物、乂又吲p呆马来酰亚胺n、 ^又吲。朱马来酰亚胺m、
氢氯化物、双吲。朵马来酰亚胺抑制剂Set、双吲"呆马来酰亚胺IV、双 口引咮马来酰亚胺V、 4丐感光蛋白C、支孢样支孢霉(C/"Jo^o〃'ww c/"A入s7^r/o/We力、心月庄毒素、黑颈目艮4竟虫它(A^/a w'gr/co〃&)、氯4匕 白屈菜红石咸、地J奎氯4妄、逆'没食子酸、二7K4匕物、G6976、 InSolutionTMG6976、 G6983 、 G7874 、氬IU匕物、H-7 、氟安定、Iso-H-7 、 氟安定、HBDDE、 Hispidin、金丝冲兆蒽酮、K-252a、 i若卡(氏)土i裏 菌属0Vo"〃'^7o戸/s w.)、 InSolution K-252a、诺卡(氏)土i裏菌属 (;Vocora7o戸:v平)、K-252b、 诺卡(氏)土壤菌属(iVoc"Wo戸's 5"/ .)、K-252c、 *奪毒素、NGIC-I、才艮皮素、云杉鞣酚、PKCbn/EGFR抑 制剂、星孑包菌素(staurosprorine )、 N-苯甲酰PKCb抑制剂、石克酸多 粘菌素B、蛋白激酶C抑制剂20-28、细胞可渗透的、豆蔻酰化、 蛋白激酶C抑制剂肽19-31、蛋白激酶C抑制剂肽19-36、蛋白激 酶C抑制剂组合、蛋白激酶C抑制剂、EGF-R片段651-658、豆蔻 酰化、蛋白激酶Ce易位抑制剂肽、蛋白激酶Ce易位抑制剂肽、阴 性对照、蛋白激酶Cz假底物抑制剂肽、蛋白激酶C,假底物抑制剂 肽、豆蔻酰化、蛋白激酶Ch假底物抑制剂肽、豆蔻酰化、蛋白激酶
Cq假底物抑制剂肽、蛋白激酶Cq假底物抑制剂肽、豆蔻酰化、假
金丝氺兆素、Ro 31—7549, 固定的，Ro-31—7549、 Ro-31—8220、 InSolutionTMRo-31-8220、 Ro-31-8425、 Ro-32-0432、楸毒素、沙芬 戈、桑吉瓦霉素、Scytonemin (—种色素)、4木氏〉菜(Lj^ gZ^" )、 丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂组合、D-红-神经鞘氨醇、二氢、D-红-神 经鞘氨醇、自由碱基、牛脑、D-红-神经鞘氨醇、自由碱基、高纯度、 D-红—神经鞘氨醇、N,N-二甲基-、星孑包菌素(staurosprorine )、 4连霉 菌属OSfm/〕to",)nv ,v/9.)、枸橼酸他莫昔芬、他莫昔芬、4-羟基-、(Z- )、 TER14687、琥珀酸维生素E或者能够抑制蛋白激酶C表达的反义 核香酸。
在一个具体实施方式
中，所述蛋白酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶 和弹性蛋白酵。在一个具体实施方式
中，半胱氨酸蛋白酶包括木瓜 蛋白酶、4丐蛋白酶和溶酶体组织蛋白酶。在一个具体实施方式
中， 门冬氨酸蛋白酶包括胃蛋白酶和凝乳酶。在一个具体实施方式
中， 金属蛋白酶包括嗜热菌蛋白酶和羧肽酶A。
在一个具体实施方式
中，#4居本发明所述的组合物和/或方法可 以包含4吏用如本文所述抑制剂的4壬何组合。
在另一个具体实施方式
中，还可以用Tcfl蛋白或编码所述Tcfl 蛋白的核酸接触所述细胞。在一个具体实施方式
中，所述Tcfl蛋白可以具有氨基酸序列，
其同源于或就是NCBI，s基因库中列出的序列，登陆号CAI59577、 P15257、 P22361、 P20823、 NP—033353、 NP—036801、 NP—739570 或NP 000536。
在另一个具体实施方式
中，本发明提供了一种增加胰腺f3细胞 质量的方法，该方法包括用丝氨酸或金属蛋白酶抑制剂接触卩细胞 或可经诱导变成胰腺卩细胞的细月包，其中所述细胞表达或经可诱导 表达TMEM27,并提供利于P细胞增殖的条件。
在另一个具体实施方式
中，本发明提供了一种改变患者体内新 陈代谢的方法，所述方法包含用丝氨酸或金属蛋白酶抑制剂接触胰 月泉(3细胞或可经i秀导变成月夷腺(3纟田月包的纟田月包，其中所述细胞表达或 可经i秀导表达TMEM27。
在另一个具体实施方式
中，本发明提供了一种抑制、遏制或治 疗患者#唐尿病的方法，所述方法包4舌用TMEM27多月太或编码所迷 TMEM27多肽的核酸接触细胞，所述细胞是胰腺卩细胞或者所述细 胞可以经诱导变成胰腺(3细月包。
在另一个具体实施方式
中，本发明提供了一种抑制、遏制或治 疗患者糖尿病的方法，所述方法包括用一种蛋白酶抑制剂(用丝氨 酸或金属蛋白酶抑制剂)接触胰腺|3细胞或可经诱导变成胰腺P细 月包的细月包，其中所述细月包表达或可经i秀导表达TMEM27。
在一个具体实施方式
中，"治疗"既指治疗性疗法又指预防性 才晉施，其中目标是预防或减轻如上文中所描述的輩巴病理疾患或病 症。因此，在一个具体实施方式
中，治疗可以包4舌遏制、抑制、预 防、治疗或其组合。因此，在一个具体实施方式
中，"治疗"指的 尤其是增加时间以持续进展、加快緩解、i秀导緩解、促进緩解、加快恢复、增加替代治疗的效果或降低对替代治疗的耐受性，或其组 合。在一个具体实施方式
中，"遏制"或"抑制"指的尤其是延緩 症状出现、预防疾病复发、减少复发发作的次数或频率、延长症状 性发作之间的潜伏期、降低症状的严重程度、降低急性发作的严重 程度、减少症状的数目、减少疾病相关症状的发生率、减少症状潜 伏期、緩解症状、减少继发症状、减少继发感染、延长患者存活期， 或其组合。
在一个具体实施方式
中，症状是原发的，而在另一个具体实施 方式中，症状是继发的。在一个具体实施方式
中，"原发"指的是 作为糖尿病直接结果的症状，而在一个具体实施方式
中，"继发"
实施方式中，用于本发明中的化合物治疗原发或继发症状或者与糖 尿病相关的继发并发症。
在另一个具体实施方式
中，"症状"可以是疾病或病理状态的 任何临床表现，在一个具体实施方式
中，其是糖尿病，包括尿频、 过度口渴、剧烈饥饿、不寻常体重减轻、疲劳加重、易激惹、视力 模糊、低胰岛素水平、高血糖或高尿糖水平，或者其组合。
在一个具体实施方式
中，术语"糖尿病"指的是一种原发性的 哺乳动物患者的疾病，或者在另一个具体实施方式
中是指继发性糖
尿病，或者在另一个具体实施方式
中是指1型NIDDM-暂时，或者 在另一个具体实施方式
中是指1型IDDM,或者在另一个具体实施 方式中是指2型IDDM-暂时，或者在另一个具体实施方式
中是指2 型NIDDM,或者在另一个具体实施方式
中是指2型MODY，其表 i见可能^口在Harrison's Internal Medicine, 14th ed. 1998中所述的。
才艮据本发明的这个方面，且在一个具体实施方式
中，所述患者 是胰岛素抵抗的，或者在另一个具体实施方式
中，所述患者是低胰岛素血症型。在另一个具体实施方式
中，所述患者易患糖尿病。在
另一个具体实施方式
中，所述患者患有青春晚期^f唐尿病(MODY)。
在另一个具体实施方式
中，作为组合治疗的一部分，冲艮据本发 明所述的方法可以进 一 步包括将其他糖尿病药剂纟会予所述患者的 步骤。在一个具体实施方式
中，所述糖尿病药剂可以包括磺酰脲类、
瘦素(leptin,来普汀)、氯茴苯酸、双胍、噢哇烷二酮类、a-糖苷 酶抑制剂或其组合。
在另 一个具体实施方式
中，才艮据本发明所述的方法可以进一步 包括给予患者GLP-1受体拮抗剂，或者在另一个具体实施方式
中， 用GLP-1受体拮抗剂接触患者体内的细胞。在一个具体实施方式
中，所述GLP-1拮抗剂可以包4舌天然存在的肽例如GLP-1 、 exendin-3 和exendin-4(见例如美国专利第5,424,286号;美国专利第5,705,483 号；美国专利第5,977,071号；美国专利第5,670,360号；美国专利第 5,614,492号)、GLP-1类似、物或变异体(见例如美国专利第5,545,618 号和美国专利第5,981,488号)和小分子类似物。GLP-1受体拮抗 剂可以如美国专利第5,981, 488号中所述一企测其活性。
在另一个具体实施方式
中，根据本发明所述的方法可以进一步 包括PDX-1或PYY,或者编码PDX-1或PYY的核酸。
应该理解本文中描述的关于本发明所述细胞、组合物、多肽、 冲亥酸或载体的4壬<可具体实施方式
，均可以用于本发明所述的方法 中，均可认为是本发明的具体实施方式
。
在一个具体实施方式
中，本发明^是供一种估计患者体内月夷岛质 量的方法，所述方法包4舌确定所述患者血清中TMEM27浓度的步 骤以及将该浓度与对照浓度进行比较的步骤。在另一个具体实施方式
中，本发明提供一种用于估计高胰岛素 血症、血内力夷岛素不足、糖尿病或对用于上述病症治疗的疗法的反
应的诊断工具和/或方法。在一个具体实施方式
中，TMEM27作为 生物标记物，其在特定体液(例如在血清、血浆或尿中)中的浓度 是高胰岛素血症、血内胰岛素不足或明显(frank)糖尿病的函凄史。 在一个具体实施方式
中，TMEM27的分泌形式是生物标记物。才艮据 本发明的这个方面，且在一个具体实施方式
中，诊断方法可以是通 过标准;险测法例如ELISA试验确定TMEM27蛋白或其片段、分泌 形式的水平。在一个具体实施方式
中，疾病严重性作为多肽表达的 函凌t而i貪断。在另一个具体实施方式
中，多肽表达的变化，无i仑是 蛋白质还是RNA水平，可以是(在另一个具体实施方式
中)对治 疗(例如本文中提供的治疗方法)反应的函数。在另一个具体实施 方式中，表达的相对变化可以作为本发明所述核酸或载体递送的函 数，其可以代表本发明的一种疗法。在一个具体实施方式
中，本发 明所述的方法可以利用本发明的抗体或抗体片段、或者包含该抗体 或抗体片段的组合物。 一种含有本发明所述抗体、核酸、载体、细 胞和/或组合物的试剂盒也包括在本发明之内。
在另一个具体实施方式
中，本发明提供一种用于鉴定与 TMEM27蛋白或其分泌形式相互作用的蛋白的方法，所述方法包含 一个步骤，即在足以促进所述多肽与所述感兴趣分子之间特异性相 互作用的条件下，用感兴趣分子接触TMEM27多肽一段时间以及 鉴定所述感兴趣分子。
在一个具体实施方式
中，TMEM27可以作为;敫素发4军作用，一 个相互作用蛋白可以包含对激素发生反应的未鉴定受体。在一个具 体实施方式中，所述相互作用蛋白可以包含与患者体内新陈代谢途 径有关的已知受体。在一个具体实施方式
中，这些筛查方法在本々页i或中是/>知的， 且可以包含在用于凝月交电泳的变性和非变性条件下、利用化学交联: 剂或其他分子方法例如利用酵母2杂交系统时，直4妄或间4妻-泮估例 如两种分析之间的相互作用。
应该J里解，确定本发明所述TMEM27蛋白的相互作用蛋白的 4壬何方法均可以实现，JU人为是本发明的一部分，包括鉴定相互作 用蛋白以及在本文描述的条件下鉴定这个相互作用蛋白的作用，例 如积极的新陈代谢效应，例如其对于增强力夷腺(3细月包质量的效应， 或在另一种具体实施方式
中，有害的新陈^^射效应，例如形成高减— 岛素血症。
4妄下来将纟是供材库+、方法和实施例用于举例说明目的，作为实 施本发明的方式，而非出于限制的目的。
实施例
材料和方法
动浙
所有的动物才莫型均在动物研究中心实马全室(Laboratory of Animal Research Center, LARC, Rockefeller大学的一个无病原体 动物实-验室)中饲养。所述动物均维持12小时的明/暗周期并用标 准的啮齿类动物食物飼养。在从3周龄的小鼠分离的DNA上通过 PCR进4亍突变小鼠的基因型测定。
戎氛-
对两种肽抗-Col-3:VQSAIRKNRNRINSAFFLD ( SEQ ID NO: 1 )和抗-Col-4:GIPCDPLDMKGGHINDGFLT ( SEQ ID NO: 2 )进行合成并加工至纯度>90%，轭合于KLH，用于兔的免疫(Betyl实 一验室，得克萨-斤)。将4元血清进4亍亲和力纯4匕并通过western印i己和 免疫组织化进行检测。亲和力纯化抗血清用于所有研究。其他用于 免疫印记和免疫组织化的抗体从下列来源获得抗胰岛素(Linco)、 抗月夷高血沣唐素(Linco)、抗-V5 (Invitrogen )、罗丹明红辄合的驴抗 几内亚猪(Jackson实-验室)、爱力生(Alexa)488驴#元兔(Molecular Probes )。
雄賴
将MIN6细月包用含有25 mM葡萄并唐、15%胎牛血清和5.5 mM 的2-巯基乙醇的DMEM培养基进行培养。INS-1细胞用含有25 mM 葡萄if唐、5%月台牛血清禾口 10 mM Hepes pH7.4的RPMI 1640进4亍i咅 养。将HepG2细胞用含有25 mM葡萄冲唐、10%胎牛血清的DMEM
培养基进行培养。
摔^辟籴一资^素錄为v,
在瞬时4争染中，用于HepG2纟田月包的Fugene i式齐'J ( Roche )以及 用于MIN6纟田月包的Lipofectamine 2000(Invitrogen)才艮才居生产商的冲旨导 而〈吏用。每个35 mm平皿中加入0.5 pg的萤光素酶寺艮告子构建体、 表达载体和CMV-LacZ。通过相应的p半乳糖苷酶活性对萤光素酶 的專争染岁文率进4亍才示〉隹4匕[AlamJ"Cook, J丄.Reporter genes: Application to the study of mammalian gene transcription. Anal. Biochem. 188:245-254,1990]。
为了得到萤光素酶构建体，将815 bp的启动子区域克隆于萤光 素酶启动子的上游，与Tcfl表达载体共表达。TMEM27启动子序列(小鼠)如下
atgtcattgcacccaa[gactttaacgctcagtecttggataccccacatgtgagacggttgtaaccactgtaaggatllgagaaataatcagggagcctagc
tcacagtaagtagttcttagtcattgtlaaatagttgcgctgaacaatgttgtcactagcactgtgtagcaacttaactaaatgacaggUcttagcagttctagc
cccttUaaagggttagcattcatttcU[Xtagtggcaccagga(;agag〔:actg〖tcagggaaggtatcaccatcaccatcaccatcaccatcgtcatcacc
atcaccatcgtcatcacccaatgatcatc:at〔:tccagcgtgaggctUatatcattaatgttgagttUagac;agtagccagatcttagagtttaaccmgccatc
ctctagttgggaattgttaaccaaccaacagtcUggaagLcUgttccctttactctccagaggtgaaaaaggagttataUtgtUcctaagt'd培gtagcctg
lctt[giiatcagattggtt'堪t;ctgiiaagggcacaaagatta^ccaaagaaaactccatgc〖ctccacgtttagcUiiaccaaacaactaciiggaggcagg
tgggaggcUGtgattgtgtcagetcaggaaacaUcUatgaggtagagutgaggaagaaoxaciaacagcttctcaaatagaUUCgtaaataactga
caggggatgg(tcgcttctatggacgmttaaecx^aclga[gggcgumttattaaaccttttagatggtggctcgctgattt (SEQ JD NO: 17),
此外，TMEM27启动子的Tcfl位点选择性突变，分别称为Ml 禾口M2启^力子序列，如下
TMEM27-M1启^力子序歹'J (小鼠)
atgtcattgcacccaatgacUtaacgctcagtccttggataccccacatgigagacggttgtaaccactgtaaggaUtgagaaataatcagggagcctagc tcacagtaagtagttcttagtcattgttaaatagt(:gcgctgaacaatgttgtcactagcactgLgUigcaa(:ttaactaaatgacaggUctl;agcagUctagc cccttUaaagggUagcattcatUcttcctagtggcaccagg:icagagcactgttcagggaaggtatcaccatcaccatcac;catcaccatcgtcatcacc atcacuaLcgtcatcacxcaatgatLiatcaLctccagcgtgaggcUtatatcaUaatgttgagtUtagacagtagccagatcUagagtttaacctagccatc
tctUgaatcagattggttagcctgaaagggcacaaagattatgccatiagaaaactccatgctctcc'dCgUtagctoaccaaacaactiicaggagg"腿 CgggaggcttctgaUgtgtcagctcaggaaacattcUatgaggtagagtUgaggaagaacccactaacctgcttctcaaatagattttcgtaa'jLtaacact gaggggatggttcgcU"'dtggiiegtiau'dtxca'dc:igiUgggcgUaaUauaaaccUUagatggtggctcgctgattt (SEQ R) NO: 18)
TMEM27-M2启动子序列(小鼠)
atgtcaUgcacccaatgactttaacgctcagtccUggataccccacatgtgagacggUgtaaccactgtaaggatttgagaatUaatcagggagccmgc
cccUtmaagggUagcattcaUtc[tcctagtggcaccaggacagagcaclgf.U:agggaaggta[caccatcaccat:caccatcaccatcglcatcacc atcaccatcgtcatcacccaatgatcatcatctceagcgtgaggcutatatcattaatgttgagmtagacagtagccagatcttagagtttaacctagccatc ctctagttgggaattgttaaccaaccaacagtctaggaagtcUgttccctttactctccagaggtgaaaaaggagUatatttgtttcctaagtatggtagcctg tctttgaatcagattggttagcctgaaagggcacaaagaUatgccaaagaaaactccatgctctccacgtttagcttaaccaaacaactecaggaggciigg tgggaggcttGtgattgtgtcagctcaggciaacattcttatgaggt'dgagtttgaggaagaacccaaaiuxtgcUctcaa'cUagauticgtaaataactga caggggatggttcgcttctatggacgta"aacccaaclgatgggccaatattaLLaaaa:ttttagatggtggctcgctga[tt (SEQ ID NO: 19).细應袭席浙中的蛋冷Jt^
当MIN6细月包在6孑L—反中生长至90%融合时，收集MIN6细月包 并重悬于反应緩沖液和试剂中，体积50pl， 4。C孵育2小时。通过 加入50 niM Tris pH 7.4置于冰上10分钟而终止反应。然后用PBS 洗涤细胞，并在蛋白酶抑制剂存在的情况下在RIPA緩沖液中4°C 裂解15分钟。细胞裂解物以10,000 xg离心5分钟，对上清进行还 原和非还原的SDS-PAGE随后进4于免疫印迹。交耳关试剂和緩沖液 BMH( Pierce )〉容解于DMSO中，并在PBS中孵育，而DTBP( Pierce ) 5容角竿于水中，并在0.2M三乙醇胺(pH 8.0)中孵育。
W-4^差化的抻刺^^雄勿
将表达pV5-TMEM27的MIN6细胞用溶解于DMSO的指定浓 度的衣霉素(Sigma)以及单独的DMSO在37。C孵育12小时。随后 细月包裂解物进行SDS-PAGE并用抗V5抗体进行免疫印迹。
用重组酶N耳关聚#唐酶(Prozyme,San Leandro， CA )将完整的N 联聚糖从TMEM27的分泌部分除去。MIN6细胞和胰岛的上清在 20 mM石粦酸钠pH 7.5 、 0.1 %SDS和50 mM的|3-巯基乙醇中通过100 。C加热5分钟而变性。将NP-40加至终浓度0.75%,将反应混合物 与N联聚糖酶37。C孵育3小时。
电泳if移,艾动为N^TEM5^)和染^^"名瘦共沉淀("C7///^
在结合纟爰沖液(20 mM Hepes pH7.9、 150 mM NaCl、 1 mM DTT ) 中，对10 fig总细胞提取物进行EMSA分析。总细胞^是取物与32P 标记的双链寡核香酸探针一起孵育，所述探针在TMEM27启动子 上含有野生型或突变型HNF-1结合位点(序歹'J分别为 5'-GGAGATTTTCGTAAATAACTGACA-3，(SEQIDNO: 3)、5，-GGGCGTTAATTATTAAACCTTTTA-3,(SEQ ID NO:4) 和 5，-GGGCAGAGATTATTAAACCTTTTA-3，(SEQ ID NO:5))。利用抗 Tcf-1抗体(Geneka Biotechnology Inc., Montreal, Canada )实施抗体 月交移动(supershift )。利用来自C57/B6小鼠或MIN6细胞的分离的 原^肝细月包和CMP分才斤试剂盒(Upstate Cell Signaling Solutions, Lake Placid, NY)， 4姿照生产商的流程进4亍ChIP分析。Tcfl与抗 HNF—la 4元体一起;咒;定，且DNA矛j用引4勿x禾口 y (序歹寸 5，-ACAGGAGGCAGGTGGGAGGCTTCT-3， ) (SEQ ID NO:6)和 (5，-CCCGGATTAGGGTATCGGAGAA-3， ) (SEQ ID NO:7)来扩 增。用于apoM的引物是5，-GGGCTCAGCTTTCCTCCTA-3' (SEQ ID NO:8)和5,-CTCCGCCTTAACTGTTCTCTGATG-3' (SEQ ID NO:9)。
,悉细應炎取浙浙备
MIN6纟田月包在150 mm组织i咅养皿中生长至90%融合。将纟田胞 在;水;令却的PBS中;先';条一次，并刮进3 ml PBS中。^!寻纟田月包4000 x g 离心4分钟并重悬于2倍体积的高盐提耳又緩沖液(400 mM KCl、 20 mM Tris pH 7.5 、 20%甘油、2 mM DTT、 1 x完全TM蛋白酶4中制 剂(Boehringer Mannheim )禾口 20 jag/ml 4中敞酵)中。纟田月包裂角罕通过 冻融而实现，通过16,000 xg于4。C离心10分钟而除去细月包石卒片。
浚素辦定
利用酸乙醇(10%冰醋酸溶于无水乙醇中)从胰腺中4是取胰岛 素和胰高血糖素，声波处理10分钟、12,000 x g于4°C离心2次， 每次10分钟。收集上清并储存于-20。C以便通过每文感的胰岛素或胰 高血4唐素RIA试剂盒(Linco Research )测定月夷岛素。應^和及7VJ的》岸
胰岛从6-8周龄的小鼠上分离。我们利用胶原酶消化并通过葡 聚糖梯度进行差速离心。随后利用TRIzol试剂(Gibco-BRL )根据 生产商的il明才是耳又总RNA。污染的基因组DNA才艮据每5 jil的RNA 利用 1 (il无RNA酶的DNase- I (即，月夷脱氧核辟唐核酸酶) (Boehringer )而除去。
腐房形在承y定法
将胰腺在低聚曱醛中固定，并如上所示进行胰岛素和胰高血糖 素的染色。切耳又贯穿整个月夷^ll的切片(7 pm)，每第六张切片用作 形态学分析。利用共聚焦激光扫描显^H竟(Zeiss LSM 510, Germany)扫描至少288张不重叠的图^象H象素尺寸为0.88 pm )。 在本研究中测定的参凄t利用Metamorph衫d牛包(Universal Imaging Corporation,PA )中的整合的形态学测定分析工具进4亍测定。由用胰 岛素或胰高血糖素染色的细胞所覆盖的区域可利用大小大于3倍像 素的着色物体进行整合。
利用TRIZOL试剂(Invitrogen )冲是耳又总RNA,并用5U无RNA 酶的DNase- I ( Ambion )处5里10 |ig的RNA。利用Moloney白血 病病毒逆转录酶，用dNTP和随一几六聚体引物(Invitrogen)合成 cDNA。 如前所述，在[a-32p]dCTP和Taq聚合酶存在的情况下， cDNA 4是供利用特异引物的PCR的才莫4反[Shih DQ, Screenan S， Munoz KN， Philipson L, Pontoglio M， Yaniv M， Polonsky KS， Stoffel M. (2001) Loss of HNF-1 alpha function in mice leads to abnormal expression of genes involved in pancreatic islet development and metabolism. Diabetes 50:2472-80]。A瘦伊迹^k^建iff织^;夢
用SDS-PAGE (4-15%)分离细胞溶质蛋白提耳又物并利用电印 迹将其转移至硝基纤维膜(Schleicher & Schuell)上；用抗CoB和 抗Col4血清(1: 500 ) 4企测TMEM27。将膜与第一抗体于4。C孵 育过夜。含第二抗体的孵育液置于室温1小时。通过从样品緩沖液 中去除DTT而实施非还原的SDS-PAGE。
^夸MIN6细月包铺于涂4隻载i皮片(Nalge Nunc Int.)上，并用4% 的低聚甲醛于4°C固定20分钟。载玻片在含3%正常驴血清的0.01% 急香/PBS中室温孵育30分钟，加入抗Co13和抗Co14 (1: 20 )后，
4。C过夜。加入第二抗体后，置于室温30分钟。
将胰腺于4%低聚甲醛中4。C固定4小时，并在石蜡中包埋。切 取7)am切片，脱蜡后，通过将载玻片在0.01M枸橼酸钠pH6.0进 4亍樣i波处理而暴露抗原。将切片在0.1%Triton-X-100中进4亍透化处 理，并在3。/。正常驴血清/PBS中孵育30分钟。如上，染色完成。
将Min6纟田月包在4%低聚甲醛和0.02。/o戊二醛/0.1M 二砷酸盐緩 冲液pH7.4中固定2小时。所述细胞用PBS进行洗涤并在10%明胶 中包埋，如上再次固定。细胞沉淀利用2.3M蔗糖J容液在PBS中进 行冷冻保护，并将样品储存于液氮中直至4吏用(Tokuyasu, K.T. 1973. J. Cell. Bio. 57-551-565 )。在Reichert-Jung FC-4E ;水冻超薄切片冲几中 利用玻璃刀切耳又冷冻超薄切片。切片在聚乙烯醇缩曱醛-石友 (Formvar-carbon )包谬皮的4臬才各上收集，用1%的BSA-PBS封闭并 用4元Co14 (1: 10稀释'液)孵育。用PBS洗涤2次，每次15分4中 而终止孵育。随后将切片与羊抗兔IgG—起孵育，所述IgG4厄合于 10 nm金颗粒(Amersham Life Science, Arlington Heights, IL )。对所述4臬才各进4亍力口工处玉里并"l要照Griffiths et al. 1983. Methods Enzymol. 96:466-485进行染色。
腐夯渗入^:
将[3H]胸苦摻入在24孑L培养才反(5 x io4纟田月包/孑L )中如下进行 分析。电穿孔后48小时,将细胞在生长抑制培养基(0.5%FCS)中 孵育24小时，随后在正常生长培养基中再孵育24小时。在所述孵 育过程的最后4个小时，加入0.25 pCi/孔的[3H]曱基胸苷(Perkin Elmer )。孵育完成后，将细胞用冰预冷的PBS沖洗2次，并与10% 三氯醋酸(TCA)于)水上孵育20分4中。用10。/oTCA洗涤后，将细 胞在0.2M NaOH/1% SDS中室温溶解10分钟。TCA不溶性物质用 0.2MHC1中和，并用液体闪烁计凄t器确定其反射性。
/ 崩f扰
人工siRNA由Dharmacon Research(Lafayette， CO)合成。siRNA 4十只于小鼠TMEM27 (NM一020626 )、 PCI/3 (NM_013628 )、 PC2 (NM_008792 )、 弗林蛋白酶(NM_011046 )和羧肽酶E (NM—013494 )序列而i殳计。将3 pg每一种siRNA/1 x 106细月包电 穿孑L入MIN6纟田月包内。
銃奸分浙
结果以均值土SD给出。利用学生氏t检验实施统计分析，在 0.05的7jc平才巨纟色零々支i殳。
实施例1:
Tcfl调控一种新蛋白在4^ P细胞中的表达为了鉴定胰腺P细胞中的促有丝分裂因子，利用Affymetrix 寡核苦酸表达试验比较分离的Tcf 1 ;野生型同胞小鼠胰岛中的基因 表达。该试验鉴定出一种编码经膜^争膜蛋白(TMEM27)的基因， 其表现出Tcfr 、鼠的表达水平相比于对照降低了 16倍。该结果在 独立组动物中通过RT-PCR得到了确认(图la)。为了研究Tcfl是 否为TMEM27转录的直4妄激活剂，对TMEM27启动子进4亍了分才斤， 在其调控区鉴定了两种保守的高亲和力结合位点(图lb)。人类上 游调控区(SEQIDNO: 10 )和小鼠上游调控区(SEQ ID NO: 11) 包含Tcf结合位点，起始于在人类和小鼠分别为约-117至约-102 (SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13 )和-62至约-47 ( SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15)。
一夸815 bp的启动子区;或(SEQ ID NO: 17)克隆于萤光素酶启 动子的上游，与Tcfl表达载体共表达。Tcfl与TMEM27启动子的 瞬时共转染引起萤光素酶活性5倍以上的激活(图lc)。如果将
TMEM27启动子中的每一个Tcfl位点选l奪性突变，则转录激活作 用降低70-80%(图lc)。凝胶电泳迁移率变动分析(EMSA)检测DNA/ 蛋白复合物，该分析利用包含Tcf结合位点的双链32P标记的寡核 芬酸和MIN6细胞提取物(图ld)。通过利用未标记寡核苷酸的竟 争性分析以及进一步利用特异性抗Tcfl抗血清变动所述DNA- Tcfl 复合物，而确定结合于这些位点的蛋白的特异性(图ld)。为了确 定Tcfl是否直4姿增加TMEM27的表达，进行了染色质免疫共沉淀 (ChIP )。 Tcfl结合于MIN6细月包的TMEM27启动子中的结合4立点， 但在不表达TMEM27的肝细胞内则无结合(图le)。这些数据确定 了体内Tcfl结合位点的功能性，表明Tcfl对于胰腺p纟田胞中 TMEM27的表达是必需的。
实施例2:
TMEM27表ii^月iM^发育过程中受到调控
4免疫组织化学分析表示了小鼠胰腺发育过程中的TMEM27表 达才莫式。在新生儿和成人月爽&泉中，TMEM27表达限于月夷岛的p细月包。 在胰腺发育过程中，当激素(主要是胰高血糖素阳性细胞)表现出 阳性时，TMEM27在最早期表达。在胚胎期的E11.5和E12.5， TMEM27表达位于表达月夷高血糖素和胰岛素的细l包中。在内分泌细 胞扩充的高峰期(乂人胚月台期13.5-18.5 )， TMEM27主要与月夷高血斗唐 素共存，直至出生前(E18.5 ),此时其在月夷岛素阳性细胞内也可才全 测到。在新生儿和成人胰腺中，在胰岛a细胞内不再能4佥测到 TMEM27,其表达局限于(3细胞(图2 )。
实施例3:
TMEM27是一种N联糖蛋白，在体内形成二聚体
TMEM27包含两种预测的N-糖基化位点，分别在氨基酸残基 76和93。用衣霉素处理MIN6纟田月包，衣霉素抑制N-斗唐基化。细月包 在衣霉素浓度不断增高的条件下孵育，制备蛋白提取物并用 SDS-PAGE和免疫印迹进行分析。用衣霉素处理后，出现两条带的 电泳迁移率增大，而高分子量蛋白消失(图3a)。该结果在体外分 析中利用N-聚糖酶得到确认，N-聚糖酶是一种释力t完整N联聚糖-的酶。用Western印迹分才斤与该酶一起孵育的MIN6细月包才是耳又物， 表现出类似于衣霉素处理的结果(图3b)。
进4亍化学交耳关试-睑，4企测TMEM27蛋白是否以多聚体存在。 MIN6细胞提取物在两种不同交联剂存在的情况下进行孵育BMH (双马来酰亚胺己烷)，其是一种能透过力莫的不可切割的化合物， 以及DTBP (二甲基3-3，二硫代丙酸盐)，其是一种能透过膜、可在 SDS-PAGE分析(在还原和非还原条件下实施)前^皮切割的化合物。 非还原western印迹出i见一条带，正好为还原条4牛下western印迹中 TMEM蛋白分子量的二倍。用BMH处理的细胞拔—取物在还原和非还原印迹中均表现为二聚体蛋白。然而，在DTBP存在时，还原条 件下所述蛋白二聚体消失(图3b)。该结果与内源性表达TMEM27 的MIN6细月包以及由TMEM27表达载体瞬时转染的N2A细月包中的 结果类似(凄t据未示出)。
综上，这些数据表明所述TMEM27蛋白是N-糖基化的，且以 二聚体存在。
实施例4:
TMEM27在月ili^ p细胞中力口工并从其分泌、
人们预测TMEM27是跨膜蛋白，具有N末端细胞外结构域。 分别生成了两种由该蛋白细胞外和细胞内结构域识别肽的抗体 (a陽Col-3和a-Col-4 )。在western印迹"i式马全中，a-Col-4在MIN6纟田 胞的总细胞裂解物中检测到两条带(图4a)。分子量较高的条带对 应于糖基化全长蛋白的预测分子量。较低条带(-25 kD)也是特 异性的，因为其可以在用表达C末端V5 -Tag融合蛋白和抗V5抗 体的载体(p-TMEM27.V5-His )转染后在细月包裂解物中用western 印迹4全测到(图4b)。
为了确定该25 kD条带是否^R表TMEM27切割形式的C末端 部分，以及/或者其是否,皮分泌的，用a-Co1-3抗体对来自不同细月包 系(包括神经元N2A纟田月包、HepG2细月包、Hek293细月包和起源于肾 收集管并表现出TMEM27的内源性表达的M-l细月包)的上清进4亍 了检测。将细胞在无血清培养基中培养48小时，利用a-Col-3通过 western印迹进4亍才全测，在同源(3细月包系MIN6和INS1E中冲全测到 一条对应于-25 kD蛋白的条带(图4c,数据未示出)。在与分离 的d、鼠胰岛 一起孵育的培养基中也检测到公认的切割和分泌蛋白 (图4d)。有趣的是，尽管细胞裂解物中强表达全长蛋白，在用TMEM27表达载体(p-TMEM27)瞬时转染的非p细胞系的培养基 中，却无法在western印迹分片斤中才企测到该条带。
相反，在MIN6和INS1E细月包中过表达TMEM27导致各自i咅 养基中分泌蛋白的量增加。siRNA介导的TMEM27蛋白水平降4氐 与MIN6细胞上清中TMEM27的分泌形式水平下降有关系(图4e )。 最后，为了无可辩驳的i正实TMEM27的N末端部分乂人P细月包切割 并分泌，构建了 一个表达载体(pHA-TMEM27 )，其中在TMEM27 蛋白的氨基酸残基39和40之间插入9个氨基酸的HA-抗原表位标 签，用该载体转染的MIN6细胞分泌一种蛋白，可用抗HA抗体才全 测，大小类似于上清中的蛋白。该蛋白在^t照细月包或在表达未加标 签蛋白的细胞中未被4金测到(图4f)。综上，这些数据表明TMEM27 是一种p细胞特异的、切割的和分泌的^,月莫蛋白。
实施例5:
TMEM27定位于力夷岛素分泌颗津立和细胞膜中
采用抗Col-3和抗Col--4抗体的免疫荧光研究表明TMEM27 定位于胰腺f3细胞中。将MIN6细胞在载玻片上培养、固定、透化 并用第一抗体处理。可在细胞膜上以及核周区室和粒子内4全测到特 异性染色(图5a)。该结果与TMEM27定位于胰岛素分泌粒子内以 及通过这些小嚢泡运输至细胞膜相一致。使用免疫金标记的抗 Col-4抗体的电镜研究表明TMEM27定位于胰岛素分泌颗粒内部 (图5b)。纳米金(nanogold)颗粒与细胞膜相连，与小嚢泡/膜融 合事件相邻(图5c),表明TMEM27是与月夷岛素分泌颗粒共定位的 细胞膜蛋白。实施例6:
Ob/Ob胰岛中TMEM27表达增加以;S^体夕卜0细胞复制增强
评估和aP2-Srebp-lc转基因小鼠的肥大胰岛中的 TMEM27表达，以确定相比于对照的相对表达。分离6-8周龄小鼠 的胰岛，并与其野生型同胞小鼠胰岛的基因表达水平加以比较。在 半定量RT-PCR分冲斤中，发现oZ7/W和aP2-Srebp-1 c胰岛中TMEM27 水平相比于对照值分别增加2.1倍和1.7倍(图6a和6b )。此夕卜， 相比于野生型同胞小鼠的大小匹配的胰岛，来自oM Z)b和 a尸2-^SW^/ -化小鼠的胰岛分泌入培养基中的已切割TMEM27显著增 加(图6c,数据未显示)。为了确定TMEM27是否刺激胰腺(3细胞 复制，评估了 TMEM27表达对MIN6细月包复制的效应。细月包用质 粒pTMEM27或革巴向TMEM27的siRNA进4亍电穿孔。纟田胞复制则 通过细胞计数及电穿孔后48h测定["H]胸苦4参入来评估(图6d-g)。 相比于pcDNA3转染的细月包，用pTMEM27转染的MIN6细月包表现 为约5倍过表达，并在平板接种(plating)后48小时，表现出[3司 月匈芬4参入i曾力口约3 4咅，且纟田月包密度i曾力口(图6e、 g)。 ^目反，在siRNA 处理后，蛋白质表达降低的MIN6细胞表现出["H]胸苷4参入和细胞 密度的显著降低(图6d、 f)。此外，未观察到细胞中的凋亡随 TMEM27表达增高或降低而发生变化(数据未显示)，表明其表达 不影响细月包死亡。这些结果表明TMEM27调节MIN6细月包中的细 月包增殖。
实施例7:
胰岛中表达TMEM27的转基因小鼠表现为胰岛肥大
胰腺(3细胞特异的转基因小鼠通过原核孩i注射载体构建体而产 生，该构建体中，鼠TMEM27 cDNA处于鼠胰岛素启动子的控制之下。RT-PCR和免疫印迹分析表明相比于野生型同胞小鼠，转基因 小鼠中TMEM27的表达增力口 4 4咅(图7A)。通过月夷岛形态测定学 研究8-12周龄转基因动物的胰岛质量。转基因小鼠表现为"臭岛形态 学正常(根据利用胰岛素/胰高血糖素共染色的免疫组织化学)，但 相比于野生型同胞小鼠，胰岛质量增加约2倍(图7B和7C)。所 述胰岛质量的增加通过测定转基因小鼠和野生型小鼠的总胰岛素 含量而进一步确证。在过表达TMEM27的转基因小鼠中，总胰岛 素含量也显著增加(图7D)。空腹和餐后血浆葡萄糖和胰岛素水平 在转基因和对照小鼠中相似，表明转基因小鼠中的胰腺卩细胞在葡 萄糖感应方面并不具有4交大异常(^t据未显示)。综上，这些ft据 表明TMEM27在体内调节胰岛生长。
实施例8:
BB94抑制TMEM27脱落
胰腺(3细胞系MIN6用含有25 mM葡萄糖、15%胎牛血清和 5.5|iM 2-5克基乙醇的DMEM i咅养基进4亍i咅养。将MIN6细月包以50% 融合铺于12孔板中，脬育24小时。用OPTI-MEM (Invitrogen )洗 涤细胞，并用DMSO或蛋白酶抑制剂BB94 ( 1 jaM )在OPTI-MEM 中于37。C孵育15分钟。上述孵育后，用DMSO、 PMA (Sigma P8139 )、 BB94或者PMA+BB94在OPTI-MEM中孵育2小时。每 一种上清均收集30 |il用于SDS-PAGE。用识别TMEM27 N末端(已 切害']部分)的抗TMEM27抗体实施免疫印迹(图8)。利用抗V5 抗体(其识别TMEM27的C末端(细胞内)部分)的免疫印迹用 作对照，表明PMA和BB94不改变TMEM27的表达水平(图8 )。 BB94 (而非PMA )降4氐TMEM27 N末端的表达水平(图8 ), ^旦 不改变TMEM27 C末端的表达水平。因为BB94是一种已知的丝氨 酸蛋白酶和金属蛋白酶的抑制剂，这可以表明TMEM27是一种属 于丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶家族的蛋白酶的底物。尽管本文中已经举例说明并描述了本发明的某些特征，对于本 领域中的普通技术人员来说，还可以进行多种变化、替代、改变和 等同。因此，应该理解附加的^又利要求涵盖所有这些落入本发明真 实精神的改变和变化。
权利要求
1. 一种分离的核酸，包含编码TMEM27蛋白的基因的调控区，其中所述调控区包含至少一个对于Tcf1蛋白的高亲和力结合位点。
2. 才艮据4又利要求1所述的分离核酸，其中所述调控区具有对应于 或同源于SEQIDNO:10或11的冲亥酉臾序列。
3. 根据权利要求1所述的分离核酸，其中所述结合位点包含对应 于或同源于SEQIDNO:12、 13、 14或15的核酸序列。
4. 一种细胞，包含根据权利要求1所述的核酸。
5. 根据权利要求4所述的细胞，其中所述细胞是胰腺卩细胞。
6. —种载体，包含根据权利要求1所述的核酸。
7. —种分离的多肽，包含TMEM27蛋白的分泌形式，其中所述 多月太的大小为约25 kDa,且包含只寸应于或同源于SEQ ID NO: 16 的序列的N末端片,史。
8. —种增加力夷&泉|3细月包质量的方法，所述方法包4舌用TMEM27 多肽接触胰腺p细胞或可经诱导变成胰腺p细胞的细胞，并冲是 供有利于(3细力包增殖的条件。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中在体外或离体接触所述细胞。
10. 根据权利要求8所述的方法，其中在体内接触所述细胞。
11. 才艮据权利要求8所述的方法，其中所述细胞是干细胞或者祖细胞。
12. 根据权利要求8所述的方法，其中所述细胞/人患糖尿病或易患 4唐尿病的患者中分离。
13. 根据权利要求12所述的方法，进一步包括将所述细胞给予所 述患者的步骤。
14. 才艮才居一又利要求13所述的方法，其中所述细月包为所述患者自体 的或同种异体的。
15. 才艮据^又利要求8所述的方法，其中所述TMEM27多肽包含全长蛋白或其片段。
16. 根据权利要求8所述的方法，进一步包括用蛋白酶抑制剂接触 所述细胞的步骤。
17. 根据权利要求16所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是丝氨 酸蛋白酶抑制剂或金属蛋白酶抑制剂。
18. 根据权利要求17所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是BB94。
19. 根据权利要求8所述的方法，进一步包括用Tcfl蛋白或编码所 述Tcfl蛋白的核S菱^妄触所述细胞的步骤。
20. —种增加胰腺(3细胞质量的方法，所述方法包括用编码 TMEM27多肽的核酸接触胰腺卩细胞或可经诱导变成胰腺(3细 月包的细胞，并提供有利于所述核酸表达的条件。
21. 才艮据权利要求20所述的方法，其中在体外或离体接触所述细胞。
22. 才艮据权利要求20所述的方法，其中在体内接触所述细胞。
23. 才艮据权利要求20所述的方法，其中所述细胞是干细胞或祖细胞。
24. 根据权利要求20所述的方法，其中所述细胞从患糖尿病或易 患糖尿病的患者中分离。
25. 根据权利要求24所述的方法，进一步包括将所述细胞给予所述患者的步骤。
26. 根据权利要求25所述的方法，其中所述细胞为所述患者自体 的或同种异体的。
27. 才艮据#又利要求20所述的方法，其中所述核酸编码全长TMEM27 蛋白或其片段。
28. 根据权利要求20所述的方法，进一步包括用蛋白酶抑制剂接 触所述细胞的步骤。
29. 根据权利要求28所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是丝氨 酸蛋白酶抑制剂或金属蛋白酶抑制剂。
30. 才艮据权利要求29所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是BB94。
31. 根据权利要求20所述的方法，进一步包括用Tcfl蛋白或编码所述Tcfl蛋白的核酸接触所述细胞的步骤。
32. —种改变患者体内新陈代谢的方法，所述方法包括用TMEM27 多肽或编码所述TMEM27多肽的核酸4妻触膽J^ (3细月包或可经 i秀导变成月夷&泉(3纟田月包的纟田万包。
33. 才艮据^又利要求32所述的方法，其中在体外或离体4妻触所述细胞。
34. 根据权利要求32所述的方法，其中在体内接触所述细胞。
35. 根据权利要求32所述的方法，其中所述细胞是干细胞或祖细胞。
36. 才艮据4又利要求32所述的方法，其中所述细胞促进所述患者体 内的月夷岛素分泌。
37. 根据权利要求32所述的方法，其中所述细胞从患糖尿病或易 患糖尿病的患者中分离，或给予患糖尿病或易患糖尿病的患 者，或其组合。
38. 根据权利要求37所述的方法，其中所述细胞为所述患者自体 的或同种异体的。
39. 根据权利要求32所述的方法，其中所述TMEM27多肽是全长 TMEM27蛋白或其片4史。
40. 根据权利要求32所述的方法，其中所述核酸编码全长TMEM27 蛋白或其片段。
41. 根据权利要求32所述的方法，进一步包括用蛋白酶抑制剂接 触所述细胞的步骤。
42. 根据权利要求41所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是丝氨酸蛋白酶抑制剂或金属蛋白酶抑制剂。
43. 根据权利要求42所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是BB94。
44. 根据权利要求32所述的方法，进一步包4舌用Tcfl蛋白或编码 所述Tcfl蛋白的核酸接触所述细胞的步骤。
45. 才艮据一又利要求32所迷的方法，其中所述患者为胰岛素4氐抗或 4氐月夷岛素血症患者。
46. 根据权利要求32所述的方法，其中所述患者为糖尿病患者或 易患4唐尿病。
47. 根据权利要求32所述的方法，进一步包括将磺酰脲类、瘦素、 氯茴苯酸、双胍、漆唑烷二酮、a-糖苷酶抑制剂或其组合给予 所述患者的步骤。
48. —种抑制、遏制或治疗患者糖尿病的方法，所述方法包4舌用 TMEM27多肽或编码所述TMEM27多肽的核酸4妄触月夷腺(3细 月包或可经i秀导变成胰腺j3纟田月包的纟田月包。
49. 根据权利要求48所述的方法，其中在体外或离体接触所述细 胞。
50. 才艮据权利要求48所述的方法，其中在体内接触所述细胞。
51. 根据权利要求48所述的方法，其中所述细胞是干细胞或祖细胞。
52. 才艮据权利要求48所述的方法，其中所述细胞从患糖尿病或易 患糖尿病的患者中分离，或将所述细胞给予患糖尿病或易患糖 尿病的患者，或其纟且合。
53. 根据权利要求52所述的方法，其中所述细胞为所述患者自体 的或同种异体的。
54. 根据权利要求48所述的方法，其中所述细胞促进所述患者中 的(3细月包增殖、力夷岛素分泌或其组合。
55. 根据权利要求48所述的方法，其中所述TMEM27多欣是全长 TMEM27蛋白或其片革史。
56. 根据权利要求48所述的方法，其中所述核酸编码全长TMEM27蛋白或其片段。
57. 根据权利要求48所述的方法，进一步包括用蛋白酶抑制剂接 触所述细胞的步骤。
58. 根据权利要求57所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是丝氨 酸蛋白酶抑制剂或金属蛋白酶抑制剂。
59. 根据权利要求58所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是BB94。
60. 根据权利要求48所述的方法，进一步包括用Tcfl蛋白或编码 所述Tcfl蛋白的核酸接触所述细胞的步骤。
61. 根据权利要求48所述的方法，其中所述患者为胰岛素抵抗或 《氐月夷岛素血症患者。
62. 根据权利要求48所述的方法，其中所述患者易患糖尿病。
63. 根据权利要求48所述的方法，其中所述患者患有青春晚期糖 尿病(MODY)。
64. 根据权利要求48所述的方法，进一步包括将磺酰脲类、瘦素、 氯茴苯酸、双胍、噻唑烷二酮、a-糖苷酶抑制剂或其组合给予所述患者的步-骤。
65. —种估计患者体内力夷岛质量的方法，所述方法包括确定所述患 者血清中TMEM27浓度的步骤以及将所述浓度与对照浓度进 行比较的步骤。
66. —种用于鉴定与TMEM27蛋白或其分泌形式相互作用的蛋白 的方法，所述方法包括在足以促进TMEM27多肽与感兴趣分 子之间特异性相互作用的条件下，用所述感兴趣分子4妄触所述 TMEM27多肽一段时间以及鉴定所述感兴趣分子的步骤。
67. —种增加胰爿泉(3细胞质量的方法，所述方法包括用丝氨酸蛋白 酶或金属蛋白酶抑制剂接触胰腺P细胞或可经诱导变成胰腺卩 细月包的纟田胞，其中所述细胞表达或可经诱导表达TMEM27,并 才是供利于P细胞增殖的条件。
68. 根据权利要求67所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是BB94、 (HONH-COCH2CH2CO-FA-NH2) 、 (OA-Hy;顺式-9-油酸酰基 -N-羟酰胺；油酰-N-氢化环酰胺)、{N-[[(4,5-二氬-5-石克代-l，3,4-喀二唑-2-基)氨基]羰基]-L-苯丙氨酸曱酯}、 {a-[[[4，5-二氢-5-硫 代-1,3,4-噻二唑-2-基)氨基]羰基]氨基]-((2-吡啶基)哌嗪基-(S)-苯丙烷酰胺}、 { (2R)-2-[(4-二苯磺酰)氨基]-3-苯丙酸}、{ (2R)-[(4- 二苯磺酰)氨基]-N-羟基-3-苯丙酰胺}、 H-Cys 1 -Thr-Thr-His-Trp-Gly-Phe-Thr-Leu-Cys 10-OH 、 (SB-3CT)、 (Ac-RCGVPD-NH2;基质;容解素-l #卩制剂)、[N-异丁基-N-(冬甲氧苯石黄酰)-甘氨酰异羟肟酸;NNGH] {N-[[+S-二 氢-5-硫代-1，3，4-噻二唑-2-基)氨基]-羰基]-L-苯丙氨酸}、 {a-[[[4,5-二氢-5-硫代-1,3,4-噻二唑-2-基)氨基]-羰基]]氨基]-N-(环己基曱基)-(S)-苯丙酰胺、4-二苯呋喃-2cp-基-4-肟基-丁 酸、[4— (4cp-联苯基)-4-肟基-丁酸]、{(3R) - ( + ) -[2- (4-甲 氧基苯磺酰)-1,2,3,4-四氢异壹啉3-异羟肟酸酯])、{( 3S )-(-) -[2- (4-曱氧基苯磺酰)-1,2,3,4-四氬异唾啉3-异羟肟酸酯])、 [N-羟基-l隱(4-曱氧苯基)石黄酰-4- (4-联苯羰基)哌。秦-2-羧酰 胺]、[N-羟基-l-( 4-曱氧苯基)磺酰-4-苄氧羰基哌嗪-2-羧酰胺]、 (l,lO-二氮菲一水合物)、马马司他、普啉司他、坦诺司他、新 ^f戈司他、。坐来膦酸，或其组合。
69. 根据权利要求68所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是BB94。
70. —种改变患者体内新陈代i射的方法，所述方法包括用丝氨酸或 金属蛋白酶抑制剂的蛋白酶抑制剂接触胰腺卩细胞或可经诱导 变成胰腺p细胞的细胞，其中所述细胞表达或可经诱导表达 TMEM27。
71. 根据权利要求70所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是BB94 、 (HONH-COCH2CH2CO-FA-NH2) 、 (OA-Hy;顺式-9-油酸酰基 -N-羟酰胺；油酰-N-氢化环酰胺)、{N-[[(4，5-二氬-5-碌b代-l，3，4-，塞二唑-2-基)氨基]羰基]-L-苯丙氨酸甲酯}、 U-[[[4,5-二氢-5-硫 代-l,3,4-噻二唑-2-基)氨基]羰基]氨基H(2-吡啶)哌嗪基-(S)-苯 丙烷酰胺}、 {(2R)-2-[(4-二苯磺酰)氨基]-3-苯丙酸}、 {(2R)-[(4-二苯磺酰)氨基]-N-羟基-3-苯丙酰胺}、 H-Cys 1 -Thr-Thr陽His-Trp-Gly -Phe-Thr-Leu-Cys 10-OH 、 (SB-3CT)、 (Ac-RCGVPD-NH2;基质溶解素-1抑制剂)、[N-异 丁基—N-(4-甲氧苯石黄酰)-甘氨酰异羟肟酸;NNGH] {N-[[《5-二氢 -5-硫代-1，3,4-p塞二唑-2-基)氨基]-羰基]-L-苯丙氨酸}、 {a-[[[4,5-二氢-5-硫代-1，3,4-噻二唑-2-基)氨基]-羰基]]氨基]-N-(环己基甲 基)-(S)-苯丙酰胺、4-二苯呋喃-2 cp-基-4-肟基-丁酸、[4- (4cp-联苯基)-4-肟基-丁酸]、{ (3R) - ( + ) -[2- (4-曱氧基苯磺酰) -1,2,3,4-四氢异喹啉3-异羟肟酸酯]}、 { (3S) - (-) -[2- (4-曱 氧基苯磺酰)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-异羟肟酸酯]}、 [N-羟基-l-(4-甲氧苯基)磺酰-4- (4-二苯羰基)哌漆-2-羧酰胺]、[N-羟 基—1— (4-甲氧苯基)磺酰-4苄氧羰基哌嗪-2-羧酰胺]、(l,lO-二 氮菲一水合物)、马马司4也、普啉司^f也、坦i若司^也、#斤4戈司4也、 p坐来膦酸，或其组合。
72. 根据权利要求71所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是BB94。
73. —种抑制、遏制或治疗患者糖尿病的方法，所述方法包4舌用丝 氨酸或金属蛋白酶抑制剂的蛋白酶抑制剂接触胰腺P细胞或可 经诱导变成胰腺(3纟田月包的纟田胞，其中所述细胞表达或可经诱导 表达TMEM27。
74. 根据权利要求73所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是BB94或其组合。
75. 根据权利要求74所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是BB94。
全文摘要
本发明提供一种多肽TMEM27及其分泌形式、编码该多肽的核酸和构建体以及包含该核酸和构建体的细胞。所述TMEM27蛋白在胰腺发育早期阶段的激素阳性细胞和成熟胰腺中的胰腺β细胞内表达，其表达促进胰腺β细胞复制和胰岛质量增加。本申请中还描述了该蛋白在诊断学和治疗学中的应用。
文档编号C07K1/00GK101512336SQ200680020054
公开日2009年8月19日 申请日期2006年6月7日 优先权日2005年6月7日
发明者皮纳尔·阿克珀纳尔, 马库斯·施托费尔 申请人:洛克菲勒大学