专利名称：一种人胰腺癌细胞系及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于细胞系领域，特别涉及一种人胰腺癌细胞系及其应用。
背景技术：
胰腺癌是一种恶性程度很高的疾病，尽管相对发病率较低，一般为9 10/100000，但在西方国家中仍是肿瘤相关死亡率最高的疾病；在我国发病率也呈逐年上升趋势。胰腺癌不易在早期发现，目前尚未发现特异的临床表现和肿瘤标志物，影像学特征亦不典型；而且由于胰腺解剖学和生物学特征，易侵犯周围脏器和发生转移，大多数患者在确诊时，已经是疾病晚期，并转移至肝、肺、脊柱、肾或肾上腺等器官，只能行探查或姑息性手术，但远期效果不理想，患者大多死于肝转移和局部复发；能进行手术切除根治者仅占 5% 30% ；术后复发转移早、发生率高，单一放疗或化疗的治疗效果不理想，预后极差。我国的外科统计资料显示，5年生存率仅在5%左右。有关胰腺癌的发生、发展、转移和耐药的生物学机制目前尚不十分清楚。目前缺少用于胰腺癌发生机理及抗胰腺癌药物开发的接近临床肿瘤生物学特性的实验材料。而运用临床肿瘤组织直接建立细胞系的成功率较低，因此，通过运用临床肿瘤标本先建立动物模型，进而通过原代培养建立的人源肿瘤细胞更接近于肿瘤的临床生物学特性，对药物的耐药性及敏感性将具有更好的预测性。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是针对现有的人胰腺癌细胞系存在的生物多样性低， 与临床上胰腺癌的生物学性状相差较大的不足，提供一种新的人胰腺癌细胞系及其用途。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是一种人胰腺癌细胞，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :C201007。本发明还提供如上所述的人胰腺癌细胞的子代细胞。本发明还提供如上所述的人胰腺癌细胞的用途，用于在哺乳动物中产生胰腺癌。 所述的哺乳动物可以是各种哺乳动物，优选裸小鼠。所述的裸小鼠优选BALC/c裸小鼠。所述的胰腺癌优选胰低分化或中分化腺癌。本发明还提供一种上述人胰腺癌细胞系的建立方法，包括以下步骤，1)获得新鲜的临床胰腺癌手术切除标本，切成20 50mg的小块，皮下穿刺接种哺乳动物；2)穿刺接种70 90天后，将荷瘤动物处死，取出肿瘤组织，进行癌细胞的原代培养和传代培养。其中，所述的哺乳动物、所述的胰腺癌都如上所述。所述的新鲜的临床胰腺癌手术切除标本较佳的用哺乳动物细胞培养液或生理盐水漂洗后再进行接种。较佳的用新鲜的HBSS缓冲液(含500U/ml青霉素G、500 μ g/ml硫酸链霉素和1. 25 μ g/ml两性霉素B)漂洗。
所述的接种的方式可以是皮下穿刺接种，原位接种或者肾囊膜内接种。对于胰腺癌较佳的是进行皮下穿刺接种。所述的原代培养方法可以是常规的哺乳动物细胞的原代培养方法。较佳的包括以下步骤将肿瘤组织剪切成小块，置入培养瓶中，于37°C孵箱5% CO2条件下培养；次日，将培养瓶慢慢翻转平放，向瓶内加入DMEM/F12培养液(含5%胎牛血清，10 μ g/ml重组人胰岛素，6. 7ng/ml亚硒酸钠，5. 5 μ g/ml转铁蛋白，2 μ g/ml乙醇胺，100U/ml青霉素G、100y g/ ml硫酸链霉素和0. 25 μ g/ml两性霉素B)，静置培养；所述的传代培养方法可以是常规哺乳动物细胞的传代培养方法。较佳的包括以下步骤吸弃旧培养液，向瓶中加入新鲜的0.05%胰蛋白酶溶液，待细胞脱落后，加入新鲜的DMEM/F12培养液，仔细吹打，使之脱离瓶壁形成细胞悬液；少量在瓶壁上变圆但没有脱落的细胞，用无菌细胞刮刀轻轻挂擦培养瓶表面，收集全部细胞，离心，分别接种于新的培养瓶；当细胞传代到第五代以后，将培养液更换为RPMI 1640培养液(含10%胎牛血清， 10 μ g/ml重组人胰岛素，100U/ml青霉素G、100 μ g/ml硫酸链霉素和0. 25 μ g/ml两性霉素 B)。本发明还提供一种筛选治疗胰腺癌的候选药物的方法，包括以下步骤将测试化合物施用于动物模型，施用后导致胰腺癌症状改善或治愈的测试化合物就是治疗胰腺癌的候选化合物，其中所述的动物模型具有如上所述的人胰腺癌细胞所导致的胰腺癌肿瘤。具体的，本发明的筛选治疗胰腺癌的候选药物的方法包括以下步骤(1)将所述的胰腺癌细胞或其子代细胞制备成细胞悬液，接种于哺乳动物皮下，进行饲养，获得人胰腺癌动物模型；(2)将测试化合物施用于动物模型，施用后导致胰腺癌症状改善或治愈的测试化合物就是治疗胰腺癌的候选化合物。其中，所述的动物模型优选裸小鼠。所述的裸鼠优选BALB/C裸小鼠。较佳的可采用细胞悬液注射来建立动物模型。在施用步骤中，将测试化合物通过尾静脉注射、口服、腹腔注射或于肿瘤局部用药等方式施用于胰腺癌荷瘤动物。较佳的使用对照实验，一种优选的方式是同时还使用不含测试化合物的溶剂施用于胰腺癌荷瘤动物作为对照。本发明中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。相比于现有技术，本发明的有益效果如下本发明的人胰腺癌细胞性状稳定，可稳定多次传代。为胰腺癌研究提供新的更接近于临床肿瘤生物学特性的实验材料。具有高度成瘤性，可以成功制备胰腺癌动物模型，所制的得动物模型可以用于基础研究及药物筛选。通过与裸小鼠体内传代亲本肿瘤相比较，可用来分析体外、体内药物敏感性及耐药性的相关性，进而可以建立体外、体内两个相关联的抗胰腺癌药物筛选平台。也可用于研究胰腺癌转移的发病机理、胰腺癌的耐药机理，进而可以寻找胰腺癌转移和耐药的特征生物标志物。是人胰腺癌基础研究和临床前期应用的理想细胞系。生物材料的保藏本发明的人胰腺癌细胞，于2010年3月31日保藏在中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)(地址中国.武汉.武汉大学)，培养物名称为人源胰腺癌细胞PAXC-003，保藏编号为 CCTCC NO :C201007。
以下结合
本发明的特征和有益效果。图1. PAXC-003细胞的形态学观察(100 X)。图2. PAXC-003细胞的染色体分析。A. PAXC-003细胞；B.裸小鼠染色体(参照)。图3. PAXC-003细胞免疫组化染色(DAB法)Α·细胞角蛋白Cytokeratin (200Χ)； B. CA19-9(200X) ； C.癌胚抗原 CEA QOO X)。图4. PAXC-003细胞倍增时间曲线。图5. Acumen高内涵细胞筛选仪分析PAXC-003细胞周期。图6. PAXC-003细胞的成瘤性。A. PAXC-003细胞在裸小鼠体内生长曲线(肿瘤体积)；B.终点时肿瘤重量。图7.肿瘤的病理组织切片。A.临床上取得的肿瘤标本(100X) ；B.裸小鼠体内亲本肿瘤(100X) ；C. PAXC-003细胞在裸小鼠体内成瘤(100X)。
具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1PAXC-003细胞的制备裸小鼠5只裸小鼠，雌性，体重16.0 士 l.Og，鼠龄5周，饲养于SPF环境。裸小鼠由上海斯莱克实验动物技术有限公司提供。从上海市长海医院获得新鲜的临床胰腺癌切除标本(男，62岁，原发性胰腺癌，病理诊断结果为(胰钩突)中分化腺癌)，立即浸入预冷的无菌HBSS缓冲液中(含500U/ml 青霉素G、500y g/ml硫酸链霉素和1. 25 μ g/ml两性霉素B)。在生物安全柜中，用新鲜的该无菌HBSS缓冲液冲洗标本，切成20 50mg的小块，穿刺接种裸小鼠腋背部皮下。动物接种后，健康状态良好，行为正常。接种40天后，通过触摸发现在接种部位皮下有肿瘤小结节，小结节于接种50天后开始生长明显，至接种后70天时，肿瘤体积超过300mm3。原代培养皮下穿刺接种人胰腺癌70 90天后，将荷瘤裸小鼠用过量二氧化碳气体麻醉处死，无菌解剖，取出肿瘤组织，进行原代培养，方法如下用HBSS缓冲液(含500U/ ml青霉素G、500 μ g/ml硫酸链霉素和1. 25 μ g/ml两性霉素B)漂洗肿瘤组织快3次，去除结缔组织和坏死组织；用无菌手术刀片将肿瘤组织剪切成约Imm3小块；将剪切好的组织块用接种针送入培养瓶，并均勻摆置，间隔0. 5cm，盖好瓶盖；轻轻翻转培养瓶，使瓶底向上， 于37°C孵箱5% CO2条件下培养；次日，将培养瓶慢慢翻转平放，向瓶内加入IOml DMEM/F12 培养液(含5%胎牛血清，10 μ g/ml重组人胰岛素，6. 7ng/ml亚硒酸钠，5. 5 μ g/ml转铁蛋白，2 μ g/ml乙醇胺，100U/ml青霉素G、100 μ g/ml硫酸链霉素和0. 25 μ g/ml两性霉素B)， 静置培养；原代培养每3天换液一次，去除已漂浮的组织块和残留的血细胞。传代培养当由组织块中长出的细胞布满培养瓶底部后，进行细胞传代，具体步骤如下吸弃旧培养液，向瓶中加入Iml新鲜的0. 05%胰蛋白酶溶液，轻轻润洗贴壁细胞层，吸弃，再加入Iml新鲜的0. 05%胰蛋白酶溶液，于37°C孵箱中孵育，观察到细胞质回缩、 细胞间隙增大，待细胞脱落后，加入3ml新鲜的DMEM/F12培养液，仔细吹打，使之脱离瓶壁形成细胞悬液；少量在瓶壁上变圆但没有脱落的细胞，用无菌细胞刮刀轻轻挂擦培养瓶表面，收集全部细胞，离心，计数，分别接种于新的培养瓶。当细胞传代到第5代以后，将培养液逐步更换为RPMI 1640培养液(含10%胎牛血清，10 μ g/ml重组人胰岛素，100U/ml青霉素G、100y g/ml硫酸链霉素)，细胞生长良好，形态较为均一。传代至50代以上。
在本发明中，来源于肿瘤组织的原代培养及传代培养细胞呈上皮样，细胞形态较为均一，无接触抑制，初期生长速度较为缓慢；随着传代次数的增加，生长速度逐步加快； 将该细胞系命名为PA)(C-003，提交保藏，保藏编号为CCTCC C201007。
实施例2PAXC-003细胞的生物学特性及应用本发明采用含有胎牛血清和胰岛素的RPMI 1640培养液培养PAXC-003细胞，使其能体外长期生长和稳定传代。当细胞传至20代以上，细胞性状逐渐稳定，进行相关的生物学、遗传学和组织来源鉴定，直至第50代都具有相同的稳定的性状。经实验观察与验证， 体外生长的PAXC-003细胞具有典型的上皮样形态，失去接触生长抑制，呈恶性生长。遗传学研究证实该细胞为异倍体，染色体数目和结构畸变严重，符合恶性肿瘤的遗传学特征。该 PAXC-003细胞能在裸小鼠体内形成肿瘤，具有致瘤性。该PAXC-003细胞和其来源的临床胰腺癌肿瘤标本、裸小鼠体内传代亲本肿瘤形成对应关系，可以为研究体外、体内和临床抗癌药物敏感性及耐药性的相关性，以及胰腺癌的发生、发展、转移和生物标志物提供新的试验材料。具体如下a.形态学观察将培养PAXC-003细胞的培养瓶置于倒置显微镜下，在明视野下进行拍照。结果见图1，可见，PAXC-003细胞失去了接触抑制，呈恶性生长，具有重叠生长的特点，贴壁生长部分呈扁平状，以不规则铺路石样为主，符合上皮样细胞的特点。b.染色体的鉴定将培养的PAXC-003细胞置于4 °C 12小时后，加入秋水仙素，使其终浓度为 0. 4 μ g/ml，再于37°C孵箱中继续培养10小时。采集分裂中期的细胞，用固定液进行固定， 然后将细胞悬液滴于预冷的载物片上，用Giemas染色液染色，于显微镜下计数染色体数。 结果见图2，可见，PAXC-003细胞连续传代后，染色体仍保持人源性肿瘤细胞染色体的特征，表现为多倍体，染色体众数(M)集中在40 46之间，占59. 4%，存在多数中央及亚中央着丝粒染色体(图2A)；而裸小鼠的染色体数2n = 40，且均为顶端着丝粒(图2Β)，据此可与人类染色体相区别。可见该PAXC-003细胞为异倍体，染色体数目和结构畸变严重，符合恶性肿瘤的遗传学特征。c.组织来源鉴定将PAXC-003细胞接种在盖玻片上培养，待细胞伸展后，用4%甲醛固定，进行免疫组化染色(DAB显色法)。结果显示，细胞角蛋白(Cytokeratin，图2A)和CA19_9(图2B) 为强阳性，癌胚抗原(CEA，图2C)为弱阳性，结合病理诊断，该细胞为胰腺癌细胞。d.细胞动力学将PAXC-003细胞以2000/孔的密度接种在96孔板中，进行培养，分别在12小时， 24小时，36小时，48小时，72小时和96小时固定细胞，并进行PI染色，用高内涵细胞筛选仪Acumen测量每孔细胞数。细胞动力学研究结果显示，PAXC-003细胞的群体倍增时间为 33. 79小时(图4)。
e.细胞周期检测将PAXC-003细胞以2000/孔的密度接种在96孔板中，培养M小时后，固定细胞， 并进行PI染色，用高内涵细胞筛选仪Acumen测量每孔细胞数和每个细胞的总DNA含量 (每个细胞的总DNA含量和该细胞的总PI荧光强度呈正比)；并根据不同细胞周期时，细胞总DNA含量的变化，计算各个细胞周期的细胞总数。结果显示，PAX-003CL细胞G1期为 45. 92%, S期为19.01%，(VM期为24. 52%，8N期为9. 54%。根据细胞增殖指数公式PI =(G2/M+S) + (Go/Gi+S+G^M+eN) X100%,计算结果:PAXC_003 细胞PI = 48. 66% (图 5)。f.细胞的成瘤性体外大规模培养和收集PAXC-003细胞，皮下接种BALB/C裸小鼠(每只动物接种5. OX IO6个细胞，细胞悬液和Matrigel以1 1混合，共接种5只动物)，每周三次调查动物体重和肿瘤大小。接种约10天后，肿瘤开始形成并生长。绘制肿瘤生长曲线，其中肿瘤体积=(长X宽X宽)+2(见图6A)。在第沈天结束实验处死动物，肿瘤重量为 1. 15g士0. IOg (见图6B)。可见该PAXC-003细胞能在裸小鼠体内形成肿瘤，具有致瘤性。g.肿瘤的病理学鉴定将实施例1的从上海市长海医院获得新鲜的临床胰腺癌切除标本、穿刺接种于裸小鼠背部皮下90天后皮下长出的肿瘤、和上述f步骤中PAXC-003细胞在裸小鼠皮下接种 10天后形成的肿瘤，进行石蜡包埋切片和H&E染色，结果见图7。它们的病理诊断结果见下表1。可见临床标本、裸小鼠体内传代亲本肿瘤和PAXC-003细胞在裸小鼠体内所成肿瘤的结构类似，形成对应关系。表1.各肿瘤标本的病理诊断结果
标本名称病理诊断结果临床手术标本胰钩突中分化腺癌(图m裸小鼠体内传代亲本肿瘤胰中分化腺癌(图7B)PAXC-003细胞在裸小鼠体内所成肿瘤胰中分化腺癌(图7C) 应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种人胰腺癌细胞，其特征在于，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC C201007。
2.如权利要求1所述的人胰腺癌细胞的子代细胞。
3.如权利要求1或2所述的人胰腺癌细胞的用途，其特征在于，用于在哺乳动物中产生胰腺癌。
4.如权利要求3所述的人胰腺癌细胞的用途，其特征在于，所述的哺乳动物是裸小鼠。
5.一种如权利要求1或2所述的人胰腺癌细胞的建立方法，其特征在于，包括以下步骤，1)获得新鲜的临床胰腺癌手术切除标本，切成20 50mg的小块，皮下穿刺接种哺乳动物；2)穿刺接种70 90天后，将荷瘤动物处死，取出肿瘤组织，进行癌细胞的原代培养和传代培养。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的哺乳动物是裸小鼠。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的新鲜的临床胰腺癌手术切除标本用新鲜的HBSS缓冲液(含500U/ml青霉素G、500 μ g/ml硫酸链霉素和1. 25 μ g/ml两性霉素 B)漂洗后，再进行皮下穿刺接种。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的原代培养方法包括以下步骤将肿瘤组织剪切成小块，置入培养瓶中，于37°C孵箱5% CO2条件下培养；次日，将培养瓶慢慢翻转平放，向瓶内加入DMEM/F12培养液(含5%胎牛血清，10 μ g/ml重组人胰岛素，6. 7ng/ml亚硒酸钠，5. 5 μ g/ml转铁蛋白，2 μ g/ml乙醇胺，100U/ml青霉素G、100 μ g/ml硫酸链霉素和 0. 25 μ g/ml两性霉素B)，静置培养；所述的传代培养方法包括以下步骤吸弃旧培养液，向瓶中加入新鲜的0. 05%胰蛋白酶溶液，待细胞脱落后，加入新鲜的DMEM/F12培养液，仔细吹打，使之脱离瓶壁形成细胞悬液；少量在瓶壁上变圆但没有脱落的细胞，用无菌细胞刮刀轻轻挂擦培养瓶表面，收集全部细胞，离心，分别接种于新的培养瓶；当细胞传代到第五代以后，将培养液更换为RPMI 1640培养液(含10%胎牛血清，10 μ g/ml重组人胰岛素，100U/ml青霉素G、100 μ g/ml硫酸链霉素和0. 25 μ g/ml两性霉素B)。
9.一种筛选治疗胰腺癌的候选药物的方法，其特征在于，包括以下步骤将测试化合物施用于动物模型，施用后导致胰腺癌症状改善或治愈的测试化合物就是治疗胰腺癌的候选化合物，其中所述的动物模型具有权利要求1 4任一项所述的人胰腺癌细胞所导致的胰腺癌肿瘤。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的动物模型是裸小鼠。
全文摘要
本发明提供了一种人胰腺癌细胞及其制备方法和应用。该人胰腺癌细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201007。该人胰腺癌细胞可用于在哺乳动物中产生人胰腺癌，制备人胰腺癌模型，可进一步用于筛选治疗人胰腺癌的候选药物。本发明的人胰腺癌细胞系性状稳定，可稳定多次传代。体外传代自第20代至第50代性状保持稳定。本发明的人胰腺癌细胞系具有临床上人胰腺癌的生物学性状，为胰腺癌研究提供新的更接近于临床肿瘤生物学生性的实验材料。通过与裸小鼠体内传代亲本肿瘤相比较，可用来分析体外、体内药物敏感性及耐药性的相关性，进而可以建立体外、体内两个相关联的抗胰腺癌药物筛选平台。
文档编号A61K49/00GK102250840SQ20101017858
公开日2011年11月23日 申请日期2010年5月18日 优先权日2010年5月18日
发明者朱明华, 欧阳可栋, 秦宵然, 胡刚, 谢付波, 闻丹忆 申请人:上海睿智化学研究有限公司, 上海长海医院