专利名称：一种土壤微生物基因组dna和总rna的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种土壤微生物基因组DNA和总RNA的提取方法，属于生物技术领域。
背景技术：
由于传统微生物学研究方法等因素的限制，作为生命科学研究来源和生物技术创 新基础的微生物资源的开发和利用曾一度陷入高频率重复筛选的僵局，而现代生物技术的 不断发展逐渐克服了这些难题。在现代土壤微生态学研究中，直接提取土壤中微生物基因 组DNA，并在此基础利用目前先进的分子生物学技术，例如扩增片段长度多态性(AFLP)技 术、末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术、单链构型多态性(SSCP)、变性/温度梯度凝 胶电泳(DGGE/TGGE)技术，在一定程度上克服了传统培养方法所造成的土壤微生物信息大 量丢失的弊端，更加全面、精确地揭示出根际土壤微生物群落结构和功能的多样性。但是相对于单纯培养的微生物而言，土壤微生物DNA提取存在一些困难，常规方 法获得的DNA难以满足下游分子操作要求。这主要是由以下两种原因造成
(1) 土壤成分复杂，包含多种PCR的抑制物，例如重金属、多糖类、多酚类、腐殖质 等。其中腐殖质由于具有与DNA类似的性质，因此可以在DNA常规抽提中与DNA共沉淀，腐 殖质极少量的存在就可以强烈地抑制PCR反应。(2) 土壤等环境微生物相对于单纯培养的微生物更难以裂解。将常规纯培养 微生物的DNA提取方法用于土壤等环境微生物DNA提取所获得的微生物细胞裂解率低，因 此所获DNA不能反映原始样品的特种丰度。此外，也造成DNA产量偏低。因此需要研制适用于土壤微生物DNA提取的方便、快捷、实用的方法，解决使用常 规方法所获得的DNA样品存在腐殖质等PCR抑制物以及细胞裂解率低、DNA产量低的问题。此外，有效的提取土壤微生物的总RNA，能够为分析不同环境条件下土壤微生物的 基因表达模式提供重要保证，从而丰富宏基因组学的研究内容。然而，在提取土壤RNA的过 程中，除了与提取土壤DNA存在相同的困难外，无处不在的RNA酶对RNA的稳定存在构成极 大威胁，这也是目前国际国内市场中土壤RNA提取产品不多的原因。据此，开发一种高效 提取土壤基因组DNA和RNA的方法，对于大规模开展土壤宏基因组学研究显得十分必要。
发明内容
本发明提供一种有效提取作物根际土壤微生物基因组DNA和总RNA的方法，利用该方 法提取的核酸纯度较高，且产量较高。本发明的一种土壤微生物基因组DNA和总RNA的提取方法，包括土壤样品杂质的 去除，土壤微生物细胞裂解、核酸游离及沉淀，其特征在于具体步骤如下
(1)土壤样品杂质的去除称取0. 2 1. Og的新鲜作物根际土壤样品于2ml的无菌离 心管中，加入 40 200 μ 1 IM Tris-HCl (ρΗ=5. 5)、\ μ 1 无菌双蒸水(V1=QOO μ I-V2)和 V2 μ 1 0. 2Μ Al2(SO4)3水溶液，其中V2=60 300 μ 1 (由于不同地域或不同种植材料根际土壤 腐殖质等杂质的含量不同，可用梯度％=60，90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300对供试土壤进行试提)，涡旋震荡30s ；然后加入1/3 V2体积4M NaOH溶液，以及V3体积0. IM Tris-HCl (pH=8) (Vs=1300- 4/3 V2- V1)，涡旋震荡 30s，用 4M NaOH 溶液调节土壤溶液的 pH值> 8，3500rpm离心2min，用移液枪移去上清并计算上清体积V4。
(2 ) 土壤微生物细胞裂解在步骤(1)离心得到的沉淀中加入V5体积的0. IM Tris-HCl (pH 8) (V5= V4-650 μ 1)，再加入 0. 5 0. 8g 0. 5mm 玻璃珠，0. 3 0. 5g 0. Imm 玻璃珠和1 2个4mm玻璃珠，然后再加入325 μ 1 10%SDS水溶液(pH=8) ,325 μ 1 EB溶液 (ρΗ=8)，涡旋震荡30s、冰浴lmin，然后再涡旋震荡lmin、冰浴5min，再次涡旋震荡lmin，然 后4°C IlOOOrpm离心lmin，取上清备用。其中EB (pH=8)溶液配制为称取 2. 416g LiCl、1.211g Tris、3. 506g EDTA，加入 双蒸水溶解并用4M NaOH溶液调节pH=8. 0，定容至100ml。(3)核酸游离及沉淀取600 800 μ 1步骤(2)得到的上清至1. 5ml无菌离心管， 加入与上清等体积的酚氯仿异戊醇(体积比=25:24:1)，涡旋震荡，冰浴5min，期间每分 钟震荡1次，最后4°C 16000rpm离心15min。将离心后的上清转移至1. 5ml离心管(离心 管用0. P/oDEPC水浸泡后高压灭菌)，加入与上清等体积的氯仿异戊醇(体积比=24:1)， 涡旋震荡，4°C 16000rpm离心15min，取上清。将上清转移至新的1. 5ml离心管(0. 1%DEPC 水浸泡后高压灭菌)，加入与上清等体积的氯仿异戊醇(体积比=24:1)，涡旋震荡，4°C 16000rpm离心15min，取上清。将上清转移至另一个1. 5ml离心管(0. 1%DEPC水浸泡后 高压灭菌)，加入0. 7倍上清体积的异丙醇、0. 1倍上清体积3M醋酸钠(pH=5. 5)，4°C静置 3h或-20°C沉淀lOmin，然后4°C 18000rpm离心60min。去除上清，沉淀用5ml 75%乙醇 (0. 1%DEPC水配制)洗涤两次，洗涤条件4°C，18000rpm离心5min。去除上清，沉淀于无菌 操作台中吹干并用30 μ 1 0. 1%DEPC水溶解，得到含有DNA和总RNA的溶液，_80°C保存。所述土壤微生物基因组DNA和总RNA的提取方法，优选的步骤如下
(1)土壤样品杂质的去除称取0.5g的新鲜作物根际土壤样品于2ml的无菌离心管中， 加入 100 μ 1 IM ρΗ=5. 5 的 Tris-HCl、V1 μ 1 无菌双蒸水和 V2 μ 1 0. 2Μ Al2 (SO4) 3 水溶液， 其中V1=QOO μ 1-V2、V2=60 300 μ 1，涡旋震荡30s ；然后加入1/3 V2体积4M NaOH溶液，以 及 V3 体积 0. IM pH=8 的 Tris-HCl，其中 Vs=1300- 4/3 V2- V1，涡旋震荡 30s，用 4M NaOH 溶 液调节土壤溶液的PH值> 8，3500rpm离心2min，用移液枪移去上清并计算上清体积V4 ；
(2)土壤微生物细胞裂解在步骤(1)离心得到的沉淀中加入V5体积的0. IM pH=8的 Tris-HCl，其中 V5= V4_650 μ 1，再加入 0. 5g 0. 5mm 玻璃珠，0. 3g 0. Imm 玻璃珠和 1 个 4mm 玻璃珠，然后再加入325 μ 1 10% ρΗ=8的SDS水溶液、325μ 1 ρΗ=8的EB溶液，涡旋震荡 30s、冰浴lmin，然后再涡旋震荡lmin、冰浴5min，再次涡旋震荡lmin，然后4°C IlOOOrpm 离心lmin，取上清备用；
EB溶液的配制为称取2. 416g LiCl、1.211g Tris、3. 506g EDTA，加入双蒸水溶解并用 4M NaOH溶液调节pH=8. 0,定容至IOOml。(3)核酸游离及沉淀取750 μ 1步骤(2)得到的上清至1.5ml无菌离心管，力口 入与上清等体积的酚、氯仿和异戊醇混合液，其中酚氯仿异戊醇体积比=25:24:1，涡旋 震荡，冰浴5min，期间每分钟震荡1次，最后4°C 16000rpm离心15min ；将离心后的上清 转移至1. 5ml离心管，加入与上清等体积的氯仿和异戊醇混合液，其中氯仿异戊醇体积 比=24:1，涡旋震荡，4°C 16000rpm离心15min，取上清；将上清转移至新的1. 5ml离心管，加入与上清等体积的氯仿和异戊醇混合液，其中氯仿异戊醇体积比=24:1，涡旋震荡，40C 16000rpm离心15min，取上清；将上清转移至另一个1. 5ml离心管，加入0. 7倍上清 体积的异丙醇和0. 1倍上清体积3M pH=5. 5的醋酸钠，4°C静置3h或_20°C沉淀lOmin， 然后4°C 18000rpm离心60min ；去除上清，沉淀用5ml 75%乙醇(用0. 1%DEPC水配制)在 4°C温度下洗涤两次，然后ISOOOrpm离心5min ；去除上清，沉淀于无菌操作台中吹干并用 30 μ 1 0. 1%DEPC水溶解，得到含有DNA和总RNA的溶液，_80°C保存。上述1. 5ml离心管先 用0. 1%DEPC水浸泡后高压灭菌。本发明的提取方法先将土壤样品用硫酸铝去除腐殖质等严重干扰核酸提取的杂 质，进一步用玻璃珠破碎土壤微生物细胞，再加入SDS及LiCl溶液裂解细胞、游离核酸，力口 入酚、氯仿和异戊醇混合物萃取后，萃取液用异丙醇及醋酸钠沉淀，最终获得土壤微生物宏 基因组DNA和总RNA。所得的核酸的纯度可达1. 724，浓度达12. 2 μ g/ μ 1。对提取的DNA 和RNA分别进行纯化后，对纯化的DNA进行16srDNA的扩增，对纯化的总RNA进行逆转录 以及16srRNA的半定量PCR和荧光定量PCR分析，结果见图1，证实本发明的方法提取土壤 DNA和总RNA的有效性。反复试验证明，此法提取的土壤基因组DNA和RNA，完整性好，纯度 较高，进一步纯化后可用于下游的基因组文库构建、RT-PCR、northern-blot等。本发明的显著优点
1.适合于不同地区、不同来源的土壤，具有广普适用性。2.所得的DNA和RNA完整性好、纯度较高。3.提取便捷、无需复杂的处理工艺，提取的条件不严格。
图1为根际土壤DNA与RNA分离的图谱；
图2为甘蔗土壤用不同V2体积Al2(SO4)3的提取结果；其中泳道1，2，3，4，5，6，7分别 表示 120、150、180、210、240、270 和 300 μ 1 ；
图3为不同作物根际土壤DNA与RNA提取的电泳检测结果；实线框所包括的部分为 DNA ；虚线框的为RNA ；其中A 烟草，B 太子参，C 甘蔗，D 水稻，E 地黄。
具体实施例实施例1
本发明的土壤微生物基因组DNA和总RNA的提取方法，具体步骤如下
(1)原料新鲜甘蔗根际土壤，来自福建福州(福建农林大学教学农场)；
(2)土壤样品杂质的去除称取0. 5g的新鲜甘蔗根际土壤样品于2ml的无菌离心管 中，加入 100 μ 1 IM Tris-HCl (ρΗ=5. 5)、\ μ 1 无菌双蒸水(V1=QOO μ I-V2)和 V2 μ 1 0. 2Μ Al2(SO4)JjC溶液(V2 梯度取 60，90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300μ1，对供试 土壤分别试提)，涡旋震荡30s ；然后加入1/3 V2体积4M NaOH溶液，以及V3体积0. IM Tris-HCl (pH=8) (Vs=1300- 4/3 V2- V1)，涡旋震荡 30s，用 4M NaOH 溶液调节土壤溶液的 pH值=8，3500rpm离心2min，用移液枪移去上清并计算上清体积V4。(3 ) 土壤微生物细胞裂解在步骤(1)离心得到的沉淀中加入V5体积的0. IM Tris-HCl (pH 8) (V5= V4-650 μ 1)，再加入 0. 5g 0. 5mm 玻璃珠，0. 3g 0. Imm 玻璃珠和 1 个4mm玻璃珠，然后再加入325 μ 1 10%SDS水溶液(pH=8) >325 μ 1 EB溶液(ρΗ=8)，涡旋震荡 30s、冰浴lmin，然后再涡旋震荡lmin、冰浴5min，再次涡旋震荡lmin，然后4°C IlOOOrpm 离心lmin，取上清备用。其中EB (pH=8)溶液配制为称取 2. 416g LiCl、1.211g Tris、3. 506g EDTA，加入 双蒸水溶解并用4M NaOH溶液调节pH=8. 0，定容至100ml。
(3)核酸游离及沉淀取750 μ 1步骤(2)得到的上清至1. 5ml无菌离心管，加入 750μ 1酚氯仿异戊醇(体积比=25:24:1)，涡旋震荡，冰浴5min，期间每分钟震荡1次，最 后4°C 16000rpm离心15min。将离心后的上清转移至1. 5ml离心管(离心管用0. 1%DEPC 水浸泡后高压灭菌)，加入与上清等体积的氯仿异戊醇(体积比=24:1)，涡旋震荡，4°C 16000rpm离心15min，取上清。将上清转移至新的1. 5ml离心管(0. 1%DEPC水浸泡后高 压灭菌)，加入与上清等体积的氯仿异戊醇(体积比=24:1)，涡旋震荡，4°C 16000rpm离 心15min，取上清。将上清转移至另一个1. 5ml离心管(0. 1%DEPC水浸泡后高压灭菌)，加 入0. 7倍上清体积的异丙醇、0. 1倍上清体积3M醋酸钠(pH=5. 5)，4°C静置3h或_20°C沉 淀lOmin，然后4°C 18000rpm离心60min。去除上清，沉淀用5ml 75%乙醇(0. 1%DEPC水配 制)洗涤两次，洗涤条件4°C，ISOOOrpm离心5min。去除上清，沉淀于无菌操作台中吹干并 用30 μ 1 0. 1%DEPC水溶解，得到含有DNA和总RNA的溶液，取5 μ 1 0. 1%DEPC水溶解的含 有DNA和RNA的溶液，于1%琼脂糖凝胶中电泳检测，检测结果见图2，通过比较可见第2泳 道的DNA和RNA的条带最清晰，条带亮度最明显，泳道中的杂质背景淡，说明此加入此体积 Al2(SO4)3的提取效果最佳，即提取新鲜甘蔗根际土壤的最适Al2(SO4)3体积为150μ 1，加入 150 μ 1的Al2 (SO4) 3能够最大程度地去除土壤中的腐殖质，同时又保证DNA和RNA的损失最 少。实施例2
(1) 土壤样品杂质的去除
分别称取0. 5g的新鲜甘蔗(福建福州)、地黄(河南焦作)、太子参(福建柘荣)、烟草 (云南昆明)、水稻(福建福州)的根际土壤样品，置于2ml的无菌离心管中，加入100μ1 IM Tris-HCl (ρΗ=5. 5)，加入 V1 μ 1 无菌双蒸水(V1=^O μ I-V2)，加入 V2 μ 1 0. 2Μ Al2(SO4)3(V2=60 300，由于不同地域或不同种植材料根际土壤腐殖质等杂质的含量不同， 根据实施例1所述步骤验证各供试土壤的最适Al2 (SO4) 3体积，因此本实例中甘蔗土壤加入 的Al2 (SO4)3的体积为150 μ 1，地黄土壤加入75 μ 1，太子参土壤加入120ul，烟草土壤加入 120ul，水稻土壤加入150ul)，涡旋震荡30s ；加入1/3 V2体积4M NaOH,加入V3体积0. IM Tris-HCl (pH=8) (Vs=1300- 4/3 V2- V1)，涡旋震荡30s，调节土壤溶液的pH值到8或以 上，3500 rpm离心2min，用移液枪去除上清并计算上清体积V4 (1050 μ 1)。( 2 ) 土壤微生物细胞裂解
加入 V5 (400 μ 1)体积的 0. IM Tris-HCl (pH=8) (V5= V4-650 μ 1)，加入 0. 5g 0. 5mm 玻璃珠，0. 3g 0. Imm 玻璃珠和 1 个 4mm 玻璃珠，加入 325 μ 1 10%SDS (pH=8)，325 μ 1 EB (ρΗ=8)，涡旋震荡30s，冰浴lmin，涡旋震荡lmin，冰浴5min，涡旋震荡lmin，4°C 11000 rpm 离心lmin。其中EB (pH=8)溶液配制称取 2. 416g LiCl，1.211g Tris,3. 506g EDTA，加入适 当体积的双蒸水溶解并调节pH=8. 0，定容至100ml。
(3)核酸游离及沉淀
取750 μ 1上清至1. 5ml离心管，加入750 μ 1酚氯仿异戊醇(体积比=25:24:1)， 涡旋震荡，冰浴5min，期间每分钟震荡1次，4°C 16000 rpm离心15min。将上清转移至 1. 5ml离心管(0. P/oDEPC浸泡后高压灭菌)，加入等体积的氯仿异戊醇(体积比=24:1)， 涡旋震荡，4°C 16000 rpm离心15min。将上清转移至新的1. 5ml离心管(0. 1%DEPC浸泡 后高压灭菌)，加入等体积的氯仿异戊醇(体积比=24:1)，涡旋震荡，4°C 16000 rpm离 心15min。将上清转移至新的1. 5ml离心管(0. 1%DEPC浸泡后高压灭菌)，加入0. 7倍体 积的异丙醇，0. 1倍体积3M醋酸钠(pH=5. 5)，4°C静置3h，4°C 18000 rpm离心60min。去 除上清，沉淀用5ml 75%乙醇(0. 1%DEPC水配制)洗涤两次，洗涤条件4°C，18000 rpm离 心5min。去除上清，沉淀于无菌操作台中吹干并用30 μ 1 0. 1%DEPC水溶解，取5 μ 1含 有DNA和RNA的水溶液，于1%琼脂糖凝胶中电泳检测。电泳结果见图3，紫外分光光度计 检测不同土壤样品的DNA和RNA水溶液的纯度及浓度，结果如下甘蔗土壤提取的DNA和 RNA水溶液纯度为0D26Q/0D28Q=1. 71，浓度为7. 15 μ g/ μ 1 ；地黄土壤提取的DNA和RNA水 溶液纯度为0D26Q/0D28Q=1. 72，浓度为12. 24 μ g/ μ 1 ；烟草土壤提取的DNA和RNA水溶液 纯度为0D26Q/0D28Q=1. 69，浓度为9. 95 μ g/ μ 1 ；太子参土壤提取的DNA和RNA水溶液纯度 为0D26Q/0D28Q=1. 69，浓度为8. 98 μ g/ μ 1 ；水稻土壤提取的DNA和RNA水溶液纯度为OD26tl/ OD280=L 71，浓度为 11. 35 μ g/μ 1。
权利要求
一种土壤微生物基因组DNA和总RNA的提取方法，包括土壤样品杂质的去除，土壤微生物细胞裂解、核酸游离及沉淀，其特征在于所述方法具体包括以下步骤(1)土壤样品杂质的去除称取0.2～1.0g的新鲜作物根际土壤样品于2ml的无菌离心管中，加入40～200μl 1M pH=5.5的Tris HCl、V1 μl无菌双蒸水和V2 μl 0.2M Al2(SO4)3水溶液，其中V1=900μl V2、V2=60～300μl，涡旋震荡30s；然后加入1/3 V2体积4M NaOH溶液，以及V3体积0.1M pH=8的Tris HCl，其中V3=1300 4/3 V2 V1，涡旋震荡30s，用4M NaOH溶液调节土壤溶液的pH值≥8，3500rpm离心2min，用移液枪移去上清并计算上清体积V4；(2)土壤微生物细胞裂解在步骤(1)离心得到的沉淀中加入V5体积的0.1M pH=8的Tris HCl ，其中V5= V4 650μl，再加入0.5～0.8g 0.5mm玻璃珠，0.3～0.5g 0.1mm玻璃珠和1～2个4mm玻璃珠，然后再加入325μl 10% pH=8的SDS水溶液、325μl pH=8的EB溶液，涡旋震荡30s、冰浴1min，然后再涡旋震荡1min、冰浴5min，再次涡旋震荡1min，然后4℃ 11000rpm 离心1min，取上清备用；(3)核酸游离及沉淀取600～800μl步骤(2)得到的上清至1.5ml无菌离心管，加入与上清等体积的酚、氯仿和异戊醇混合液，其中酚氯仿异戊醇体积比=25:24:1，涡旋震荡，冰浴5min，期间每分钟震荡1次，最后4℃ 16000rpm离心15min；将离心后的上清转移至1.5ml离心管，加入与上清等体积的氯仿和异戊醇混合液，其中氯仿异戊醇体积比=24:1，涡旋震荡，4℃ 16000rpm 离心15min，取上清；将上清转移至新的1.5ml离心管，加入与上清等体积的氯仿和异戊醇混合液，其中氯仿异戊醇体积比=24:1，涡旋震荡，4℃ 16000rpm 离心15min，取上清；将上清转移至另一个1.5ml离心管，加入0.7倍上清体积的异丙醇和0.1倍上清体积3M pH=5.5的醋酸钠，4℃静置3h或 20℃沉淀10min，然后4℃ 18000rpm 离心60min；去除上清，沉淀用5ml 75%乙醇在4℃温度下洗涤两次，然后 18000rpm 离心5min；去除上清，沉淀于无菌操作台中吹干并用30μl 0.1%DEPC水溶解，得到含有DNA和总RNA的溶液， 80℃保存。
2.根据权利要求1所述的土壤微生物基因组DNA和总RNA的提取方法，其特征在于 所述方法具体包括以下步骤(1)土壤样品杂质的去除称取0.5g的新鲜作物根际土壤样品于2ml的无菌离心管中， 加入 100 μ 1 IM ρΗ=5. 5 的 Tris-HCl、V1 μ 1 无菌双蒸水和 V2 μ 1 0. 2Μ Al2 (SO4) 3 水溶液， 其中V1=QOO μ 1-V2、V2=60 300 μ 1，涡旋震荡30s ；然后加入1/3 V2体积4M NaOH溶液，以 及 V3 体积 0. IM pH=8 的 Tris-HCl，其中 Vs=1300- 4/3 V2- V1，涡旋震荡 30s，用 4M NaOH 溶 液调节土壤溶液的PH值> 8，3500rpm离心2min，用移液枪移去上清并计算上清体积V4 ；(2)土壤微生物细胞裂解在步骤(1)离心得到的沉淀中加入V5体积的0. IM pH=8的 Tris-HCl，其中 V5= V4_650 μ 1，再加入 0. 5g 0. 5mm 玻璃珠，0. 3g 0. Imm 玻璃珠和 1 个 4mm 玻璃珠，然后再加入325 μ 1 10% ρΗ=8的SDS水溶液、325μ 1 ρΗ=8的EB溶液，涡旋震荡 30s、冰浴lmin，然后再涡旋震荡lmin、冰浴5min，再次涡旋震荡lmin，然后4°C IlOOOrpm 离心lmin，取上清备用；(3)核酸游离及沉淀取750μ1步骤(2)得到的上清至1. 5ml无菌离心管，加入与上清 等体积的酚、氯仿和异戊醇混合液，其中酚氯仿异戊醇体积比=25:24:1，涡旋震荡，冰浴 5min，期间每分钟震荡1次，最后4°C 16000rpm离心15min ；将离心后的上清转移至1. 5ml离心管，加入与上清等体积的氯仿和异戊醇混合液，其中氯仿异戊醇体积比=24:1，涡旋 震荡，4°C 16000rpm离心15min，取上清；将上清转移至新的1. 5ml离心管，加入与上清等 体积的氯仿和异戊醇混合液，其中氯仿异戊醇体积比=24:1，涡旋震荡，4°C 16000rpm离 心15min，取上清；将上清转移至另一个1.5ml离心管，加入0.7倍上清体积的异丙醇和0. 1 倍上清体积3M pH=5. 5的醋酸钠，4°C静置3h或_20°C沉淀lOmin，然后4°C 18000rpm离心 60min ；去除上清，沉淀用5ml 75%乙醇在4°C温度下洗涤两次，然后18000rpm离心5min ； 去除上清，沉淀于无菌操作台中吹干并用30 μ 1 0. 1%DEPC水溶解，得到含有DNA和总RNA 的溶液，-80°C保存。
3.根据权利要求1或2所述的土壤微生物基因组DNA和总RNA的提取方法，其特征在 于步骤(3)所述1. 5ml离心管先用0. 1%DEPC水浸泡后高压灭菌。
4.根据权利要求1或2所述的土壤微生物基因组DNA和总RNA的提取方法，其特征在 于步骤(2)所述EB溶液的配制为称取2. 416g LiCl、1.211g Tris、3. 506g EDTA，加入双 蒸水溶解并用4M NaOH溶液调节pH=8. 0，定容至100ml。
5.根据权利要求1或2所述的土壤微生物基因组DNA和总RNA的提取方法，其特征在 于步骤(3)所述75%乙醇用0. 1%DEPC水配制。
全文摘要
本发明提供一种有效提取作物根际土壤微生物基因组DNA和总RNA的方法，包括将土壤样品先用硫酸铝去除腐殖质等严重干扰核酸提取的杂质，进一步用玻璃珠破碎土壤微生物细胞，再加入SDS及LiCl溶液裂解细胞、游离核酸，加入酚、氯仿和异戊醇混合物萃取后，萃取液用异丙醇及醋酸钠沉淀，最终获得土壤微生物宏基因组DNA和总RNA。本方法适用于不同地域土壤DNA和总RNA的提取，建立了一种操作流程的简易，制备样品纯度较高的提取技术，能够为土壤宏基因组学研究提供重要基础。
文档编号C12N15/10GK101974513SQ20101054852
公开日2011年2月16日 申请日期2010年11月18日 优先权日2010年11月18日
发明者余彦, 方长旬, 林文雄, 林瑞余, 王清水, 黄力坤 申请人:福建农林大学