专利名称：一种食甲基菌mp688及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物菌株及其应用，具体地说是一种食甲基菌菌株MP688及其应用。
背景技术：
吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone, PQQ)是一种较新近发现的辅酶和生物 必需营养素，具有刺激某些微生物和动植物生长、，防治肝损伤、ι促进神经生长因子生成、 调节体内自由基水平和调节免疫等多种生理功能，可能用于阿尔茨海默氏症、心血管疾病 和糖尿病等疾病的防治。通过选育新的PQQ高产菌种，确定其与PQQ合成相关的基因，对于 通过代谢工程手段进一步提高PQQ产量，降低PQQ生产成本，推进PQQ实际应用具有重要意 义。化学合成PQQ步骤多，产率低，异构体和副产品的去除需要多步纯化，要用到多种 有毒化学试剂因而污染严重(JACS，Vol 103，pp5599-2600，1981)。新的PQQ化学合成方 法需经过11步反应，5步纯化才能得到纯度在97%左右的PQQ(Davis Paul J, Karliner Joel S, Mousa Shaker A, et al. Pyrroloquinoline quinone drugs and methods ofuse thereof :US，No. US2008/0051428A1. 2008. 2. 28)。一般认为生物学合成方法更有产业化意义。迄今为止，已知能够合成PQQ的微生 物均为革兰氏阴性菌，包括副球菌属(Paracoccus)，精朊杆菌属(ftOtaminobacter)、假单 胞菌属(Pseudomonas),无色杆菌属(Achromobacter),互生平胞菌属(Alteromonas),杆菌 属(Ancylobacter)，丝状细菌属(Hyphomicrobium)，甲烷单胞菌(Methanomonas)，甲基芽 孢杆菌属(Methylobacillus)，甲基单胞菌(Methylomonas)，嗜甲基菌(Methylophilus)， 甲基杆菌(Methylobacterium)，微环菌属(Microcyclus)，枝动菌属(Mycoplana)，原单胞 菌(Protomonas)，硫杆菌(Thiobacillus)以及茁平胞菌(Xanthobacter)。目前，也有采用 菌种发酵的方法生产PQQ，使用的原始菌种PQQ产量在0. 07 7mg/L，发酵时间为2-5天左 右(US I^at4994382和5344768)，因此产量低，成本高，难以实现PQQ的工业规模生产，因而 需要更加高产和经济的PQQ生产菌株。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产吡咯喹啉醌的食甲基菌新菌株及其在生产吡咯喹 啉醌中的应用。本发明的菌株MP688通过⑶H酶法从土壤中分离得到，食甲基菌(Methylovorus sp.)新菌株，已于2010年8月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心(地址北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号 为 CGMCC No. 4096。本发明还提供该菌株的筛选方法，包括如下步骤克隆大肠杆菌葡萄糖脱氢酶(⑶H)基因，并进行原核表达，获得纯化后的⑶H蛋
3白。将采集土样加适当无菌水混悬后静置，取上清加至富集培养基(每升含有硫酸 铵3g、磷酸二氢钾1. 4g、磷酸氢二钠3g、硫酸镁0. 2g、柠檬酸铁30mg、氯化钙30mg、氯化锰 5mg、硫酸锌5mg、硫酸铜0. 5mg，ImL维生素溶液，8mL甲醇，pH调至7. 0。维生素溶液生物 素 2mg、400mg 泛酸钙、400mgVBl、400mgVB6、200mg 对氨基苯甲酸、2mg 叶酸、2g 肌醇、400mg 烟酸、200mg核黄素)，30°C厌氧培养5d，培养物离心取上清。取培养物的上清通过GDH重组酶法快速初筛，筛选出PQQ产量高的培养物。在分 离培养基平板上分离初筛培养物中的单菌落，再接种至含富集培养基的摇瓶，30°C振荡培 养5d，再通过GDH酶法测定精确分析培养物中PQQ含量，筛选PQQ产量高的菌株。再重复 筛选两轮，获得了一株PQQ的高产菌株，命名为MP688。经多次摇瓶培养试验分析，该菌PQQ 产量可达125mg/L。MP688菌株在MPQ平板上划线30°C培养30h，观察菌落形态，为小的边缘整齐的湿 润圆形菌落，菌落隆起于固体培养基并与培养基结合紧密。挑取单菌落进行革兰氏染色观 察，菌体呈红色，为小的杆菌。MP688菌株使用电镜放大24000 X倍观察，菌体为短杆状，顶端有鞭毛。根据已知的几种食甲基菌的16S rDNA保守序列设计并合成引物，以MP688菌基因 组DNA为模板，通过PCR反应扩增该菌的部分16S rDNA序列。连接T载体并送测序，得到 的序列在GenBank中进行BLAST比较，其与多种菌均具有一定同源性，选取与其同源性较高 者根据16S rDNA序列建立系统发育树，其与食甲基菌的同源性最高。综合形态特征与16S rDNA序列鉴定MP688为食甲基菌(Methylovorus sp.)新菌株。本发明还提供一种包含该菌株的菌剂。本发明还提供一种用该菌株生产吡咯喹啉醌的方法，所述方法包括如下步骤将 MP688发酵，发酵液经弱碱性阴离子交换层析柱层析后洗脱，洗脱成分经Cw反向层析柱吸 附后，用甲醇洗脱，洗脱液浓缩并使其自然结晶。本发明提供的食甲基菌菌株在常规培养基和培养条件下，PQQ产量可达125mg/L， 而且菌株生长良好，产量稳定，经菌种选育和培养优化有望进一步提高产量，可以用于工业 化PQQ生产，对促进PQQ的产业化有重要意义。
图1为土壤样品⑶H活性部分初筛结果。图2为PQQ标准工作曲线。图 3 为 GDH 的 PCR产物电泳。其中 1 为 λ _EcoT14 I digest Maker ；2 为⑶H PCR产物。图4为⑶H表达产物的SDS-PAGE分析。其中1为蛋白的Marker ；1为 BL21-pET28a-gdh 总蛋白；2 为 BL21-pEI^8a_gdh 上清液；3 为 BL21 的总蛋白；4 为 BL21-pET28a 总蛋白。 图5纯化后⑶H蛋白的SDS-PAGE分析。图 6 为 MP688 电镜检测(24000 X)。图 7 为 MP68816S rDNA 基因的 PCR 扩增。其中 1 为 DL 2000Marker ；2 为 PCR 产
4物。图8为以16S rDNA序列为基础的系统进化树。图9为PQQ产物柱层析图谱。图10为PQQ产物的针状结晶(100X)。图11为产物的HPLC分析结果。其中A为PQQ标准品；B为PQQ样品。图12为PQQ产物的吸收光谱。其中A为PQQ标准品；B为PQQ样品。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例IPQQ产生菌筛选将从全国各地广泛采集了约3000份土壤样本，主要来源包括北京市内及各区郊、 吉林通化、河北衡水、浙江杭州等地区。以灭菌的1. 5mL离心管采集土样，每管土样加入ImL 无菌水采集土样加适当无菌水混悬后静置，取100 μ 1上清加至5ml富集培养基(每升含有 硫酸铵3g、磷酸二氢钾1. 4g、磷酸氢二钠3g、硫酸镁0. 2g、柠檬酸铁30mg、氯化钙30mg、氯 化锰5mg、硫酸锌5mg、硫酸铜0. 5mg, ImL维生素溶液，8mL甲醇，pH调至7. 0。维生素溶液 生物素^g、400mg泛酸钙、400mgVB 1、400mgVB6、200mg对氨基苯甲酸、2mg叶酸、2g肌醇、 400mg烟酸、200mg核黄素)，30°C厌氧培养5d，培养物离心取上清，用PQQ的⑶H重组酶法 快速初筛，方法如下取20 μ L⑶H重组酶溶液加入96孔板中，再加180 μ L检测反应液(ρΗ6. 8磷酸盐 缓冲溶液50mM，PMS lmmol/L,硫酸镁2mM，葡萄糖10mM，DCIPlOOuM, PQQ标准品溶液5 μ M或 者上清50μ L)开始反应，根据反应液的褪色时间可以快速估测样品中PQQ的含量水平。图1显示了初筛的部分结果。富集培养基平板(富集培养基+1. 6%琼脂粉)上分 离初筛培养物中的单菌落，再接种至含富集培养基的摇瓶，30°C振荡培养5d，通过GDH酶法 测定精确分析培养物中PQQ含量。方法如下取ImL⑶H重组酶溶液加入比色杯中，再加入2mL检测反应液(同上)，通过测定 600nm处溶液吸光度的变化速率定量分析样品中PQQ的含量。检测时以标准品为阳性对照， 以不加PQQ的反应液为空白对照。在相应条件下，梯度稀释PQQ标准品，制作PQQ标准曲线 (图幻。根据测定样品溶液吸光度的变化速率，对照标准曲线，定量分析样品PQQ的含量。 经过数轮初筛和复筛分离PQQ高产菌株。结果从3000余份土样中分离得到一株高产菌，我 们命名为MP688，经多次摇瓶培养试验分析，该菌PQQ产量可达125mg/L。其中，⑶H重组酶按如下方式制备根据E. coli的gdh基因序列设计引物PU P2，序列如SEQ IDNo. 1和2所示，在 5，端和3，端分别引入Nde I和Bam H I酶切位点。以E. coli DH5 α基因组为模板，通过 PCR扩增得大小为2674bp的目的片段(图3)。PCR条件为-MV 4min, 94°C 30s, 55°C 30s， 72°C 3min, 30个循环后于72°C继续延伸5min，用1. 0%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。产 物经测序鉴定正确，经回收并用Nde I和Bam H I酶切，与pET28a表达载体连接，连接产物 转化感受态细胞DH5 α，挑选阳性克隆提取质粒进行酶切鉴定，再测序分析。测序结果表明 扩增得到的序列与文献报道的gdh基因序列完全一致，表明pET28a-GDH质粒构建成功。将构建的表达质粒转化至BL21 (DE3)，挑取阳性克隆的单菌落接至5mL含卡那霉
5素的LB培养基，37°C振荡培养过夜，全部接入500mL含卡那霉素LB培养基中，37°C振荡培 养至OD值为0.6左右，加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，37°C诱导培养4h。于10°C 5000r/ min离心IOmin收集菌体。用20mmol/L pH7. 0的磷酸盐缓冲溶液洗涤菌体2次，悬浮至20mL 同样缓冲液，超声破菌。破菌液经离心，通过DEAE kpharose离子交换柱从上清液中纯化 目的蛋白。层析柱经平衡后以lmol/L的NaCl梯度洗脱并收集各洗脱峰组份。经检测具有 酶活的组分经疏水柱脱盐。SDS-PAGE检测分析，表达产物及纯化蛋白的分子量约为87kDa， 与文献报道一致(图4 5)。实施例2PQQ生产菌MP688的鉴定MP688菌株在MPQ平板上划线30°C培养30h，观察菌落形态，为小的边缘整齐的湿 润圆形菌落，菌落隆起于固体培养基并与培养基结合紧密。挑取单菌落进行革兰氏染色观 察，菌体呈红色，为小的杆菌。MP688菌株使用电镜放大Μ000Χ倍观察，菌体为短杆状， 顶端有鞭毛(图6)。根据已知的几种食甲基菌的16S rDNA保守序列设计并合成引物，以 MP688菌基因组DNA为模板，通过PCR反应扩增该菌的部分16S rDNA序列(图7)。其引物 序列如SEQ ID No. 3和4所示。连接T载体并送测序，其序列如SEQ ID No. 5所示。得到 的序列在GenBank中进行BLAST比较，与食甲基菌属两菌株的16SrDNA序列同源性达99% (图 8)。实施例3PQQ的提取、纯化和鉴定1.MP688 发酵培养将菌种按照5%的比例接入发酵培养基(每升含有酵母粉5g、蛋白胨5g、硫酸 铵3g、磷酸二氢钾1. 4g、磷酸氢二钠3g、硫酸镁0. 2g、柠檬酸铁30mg、氯化钙30mg、氯化锰 5mg、硫酸锌5mg、硫酸铜0. 5mg，ImL维生素溶液，8mL甲醇，pH调至7. 0。维生素溶液生物 素 ang、400mg 泛酸钙、400mg VB1JOOmg VB6、200mg 对氨基苯甲酸、2mg 叶酸、2g 肌醇、400mg 烟酸、200mg核黄素)中，30°C振荡培养5d。发酵罐培养时按照10%接种，培养基浓度为正 常2倍。2. PQQ 的制备将MP688接种至富集培养基，30°C振荡培养5d，培养物10 V 8000r/min离心 IOmin,上清液经弱碱性阴离子交换层析柱AmberlystA21吸附，以20mmol/L的1Tris-HCl (pH 8.0)缓冲溶液平衡，再以lmol/L NaCl进行梯度洗脱。收集的洗脱成分再以kppak Cw反 向层析柱吸附(图9)，以甲醇洗脱，洗脱液浓缩后使其自然结晶，结果浓缩液中长出产物的 针状晶体(图10)。3. PQQ 的分析3.1产物的HPLC分析采用Waters Symmetry 300CW反向色谱柱，以水甲醇磷酸(80 20 0. 1) 为流动相，流速lml/min，通过HPLC分离分析PQQ，采用梯度洗脱方法及254nm波长检测可 以得到较好的色谱分析结果(图U)。结果表明，样品谱峰的保留时间和标准品相同，说明 样品为PQQ。3. 2产物的紫外吸收光谱以Sigma公司生产的PQQ作为对照，利用紫外_可见分光光度作200-400nm波长 扫描可以得到PQQ产物的紫外吸收光谱图(图12)。
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结果表明，样品和标准品的特征吸收峰几乎完全一致。实施例4MP688菌剂的制备1、菌种活化使用富集培养基，将MP688接种于固体富集培养基斜面上，30°C培养3d。2、种子液的培养种子培养用富集培养基，活化好的MP688用无菌生理盐水配制成109CFU/mL的菌 悬液，以5%的接种量接种于液体富集培养基中，30°C摇床震荡培养，转速为200rpm，培养 时间为3d。3、发酵罐发酵发酵罐培养使用发酵培养基。把培养好的种子液以10%的接种量接入发酵罐中， 30°C，搅拌速度为200rpm，通气量为1 0. 8-1. 0(发酵液体积每分钟通气量体积)、罐压 1. 2-1. 8F/cm2。发酵 5d，菌量达至Ij 5-10 X lOtFU/mL，得至Ij MP688 菌株的菌剂。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.食甲基菌(Methylovorussp.)菌株 MP688，其保藏号为 CGMCCNo. 4096。
2.含有权利要求1所述菌株的菌剂。
3.权利要求1所述的菌株在生产吡咯喹啉醌中的应用。
4.利用权利要求1所述菌株生产吡咯喹啉醌的方法。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括如下步骤将MP688发酵，发酵液经 弱碱性阴离子交换层析柱层析后洗脱，洗脱成分经Cw反向层析柱吸附后，用甲醇洗脱，洗 脱液浓缩并使其自然结晶。
全文摘要
本发明公开了一种食甲基菌(Methylovorus sp.)新菌株MP688，其保藏号为CGMCC No.4096，保藏日期为2010年8月20，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心。该菌株用PQQ的GDH重组酶法从土壤中分离得到。本发明提供的食甲基菌菌株在常规培养基和培养条件下，PQQ产量可达125mg/L，可以用于工业化PQQ生产，对促进PQQ的产业化有重要意义。
文档编号C12P17/18GK102061278SQ20101054851
公开日2011年5月18日 申请日期2010年11月17日 优先权日2010年11月17日
发明者周满祥, 崔艳菊, 张惟材, 智静娟, 李月, 李淼鑫, 杜宝华, 杨延新, 杨璐, 汪建华, 熊向华, 王歆, 申云飞, 董方, 魏琳, 魏红玉 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所, 山西康宝生物制品股份有限公司