一种土壤微生物基因组的提取方法
【专利摘要】一种土壤微生物基因组的提取方法，采用Ca(OH)2水溶液、磷酸盐和NaOH溶液对土壤进行预处理使土样分散均匀释放被土质包裹的细胞，用溶菌酶、蛋白酶k和SDS共同作用裂解细胞，氯仿/异戊醇变性蛋白质，乙醇沉淀DNA得到粗提物，再用BaCl2和CaCl2混合液对粗提DNA溶液处理进一步去除腐殖酸等杂质，再用乙醇沉淀得到纯化的基因组DNA。采用本方法得到的DNA纯度和产量均可用于后续PCR等操作中，并且可在4h之内完成，使用常规试剂，不仅大大节约了时间，而且适合在实验室进行。上述提取方法也适用于其他土质如粘性土壤和沙质土壤，也适用于河底污泥等。
【专利说明】一种土壤微生物基因组的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种土壤微生物基因组的提取方法。
【背景技术】
[0002]土壤微生物是土壤生物中的一类非常重要的类群，是气候和土壤环境条件变化的敏感指标，土壤微生物群落多样性和结构及其变化在一定程度上反映了土壤的质量。在20世纪70年代以前，土壤微生物多样性解析技术主要依靠细胞的培养分离和形态分析，即通过人工配制的简单营养基质对土壤中的微生物进行定时定温培养，然后对生长的菌落进行计数、并通过形态构造和生理生化特性来鉴定种属。毕竟这种方法只能培养土壤中0.2-5%的微生物，土壤中微生物的多样性无法得到体现。近年来，分子生物学的快速发展使研宄者可以不再依赖于微生物的分离培养技术，而是在基因组DNA水平上对复杂的微生物系统进行分析研宄。分子生物学研宄的内容有琼脂糖凝胶电泳、核酸凝胶电泳、核酸分子杂交、核苷酸序列分析、基因扩增等，这些技术都是基于DNA水平上的，对基因的纯度要求较高。由于来自环境的样品含有极其复杂的成分，如腐殖酸类物质连同被吸附的有机分子一起与DNA共同被萃取，还有土壤中的重金属离子等对后续的PCR(聚合酶链反应)和杂交、凝胶电泳和细菌转化产生很大的影响。在大多数宏基因组研宄中，分离出不含有腐殖酸类物质的宏基因组DNA的技术还有待改进。
[0003]目前许多土壤微生物总DNA的提取方法已经报道了很多，大致可分为直接法和间接法提取。两种方法各有优缺点，间接法虽说提取的DNA纯度较高，但它得到的细菌只占菌落的少部分；而直接法是直接从土壤中裂解细胞，提取的DNA超过细菌总DNA的70%，但目前传统方法(TSA I Y L，OLSON B H.Rapid method for diceet extract1nof DNA from soil and sediments[J].Applied and Environment Microb1logy，1991，57 (4): 1070-1074.)操作步骤太多，导致DNA产量低，且最后得到的DNA性能不稳定。
【发明内容】
[0004]为克服现有技术中的问题，本发明的目的是提供一种土壤微生物基因组的提取方法，提取的DNA产量高，并且性能稳定，可直接用于后续PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳。
[0005]为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案:
[0006]一种土壤微生物基因组的提取方法，包括以下步骤:
[0007](I)将土壤加入到离心管中，并加入氢氧化钙水溶液，振荡使土样分散，得到土壤混合液；其中，土壤与氢氧化妈水溶液中氢氧化妈的比为(5-10) g: (10-20)mmol ；
[0008](2)向土壤混合液中加入磷酸盐溶液和氢氧化钠溶液，振荡使土壤中的细胞释放，然后进行离心，收集沉淀；其中，土壤与磷酸盐溶液中磷酸盐、氢氧化钠溶液中氢氧化钠的比为(5-10) g: (0.1-0.25) mmol: (0.1-0.25) mmol ；
[0009](3)向沉淀中加入DNA提取液、溶菌酶溶液和蛋白酶k溶液，然后于60-70°C下加热后得到溶液A ;其中，沉淀、DNA提取液、溶菌酶溶液和蛋白酶k溶液的加入量比为(0.5-1.5) g: (500-1500) μ L: (30-90) μ L: (20-60) μ L ；
[0010](4)向溶液A中加入氯仿与异戊醇的混合物，震荡至溶液变成乳浊液后进行离心，吸取上清液；其中，氯仿与异戊醇的混合物的体积是溶液A体积的0.8-1.2倍；
[0011](5)向上清液中加入乙醇水溶液并进行离心，将所得沉淀晾干或烘干，得到DNA粗提物，将DNA粗提物进行纯化，得到基因组DNA。
[0012]所述将DNA粗提物进行纯化的具体过程为:将DNA粗提物溶解于无菌水中，然后加入洗涤液并进行离心，吸取上清液A ;向上清液A中加入氯仿与异戊醇的混合物，震荡混匀，并于4°C下离心，吸取上清液B，向上清液B中加入乙醇溶液，并于4°C下离心，所得沉淀即为基因组DNA ;其中，氯仿与异戊醇的混合物的体积为上清液体积的0.8-1.2倍；氯仿与异戊醇的混合物中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。
[0013]所述洗涤液为BaCljP CaCl 2的水溶液，且水溶液中BaCl 2与CaCl 2的总浓度为
0.5-lmol/L，且 BaCl2i^ CaCl 2的摩尔比为 1:1、2:1 或 1:2。
[0014]所述步骤(I)中Ca(OH)JK溶液的浓度为l_2mol/L ;振荡的时间为2_5min。
[0015]所述步骤⑵中磷酸盐水溶液和氢氧化钠溶液的浓度均为0.1-0.2mol/L ;磷酸盐为磷酸钠或磷酸钾；步骤(I)中振荡的时间为5-10min。
[0016]所述步骤(3)中DNA 提取液包括 10mmol/L pH 值为 7.5 的 Tris-HCl，1mmoI/LEDTA, 10mmoI/L NaCl，质量分数为5%的SDS ;溶菌酶溶液的浓度为40_60mg/mL，蛋白酶k溶液的浓度为20-30mg/mL。
[0017]所述步骤(3)中加热时间为0.5-lh。
[0018]所述步骤(4)中氯仿与异戊醇的混合物中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。
[0019]所述步骤(5)中乙醇水溶液的质量分数为70% ;乙醇水溶液的体积为上清液体积的1-2倍，离心的温度为4°C，离心速率为12000-16000g，离心时间为lOmin。
[0020]所述步骤(5)中烘干的温度为70-100°C，烘干时间为20-30min。
[0021]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
[0022]1.本发明采用Ca (OH)2溶液、磷酸盐和NaOH溶液对土壤进行预处理使土样分散均匀并释放被土质包裹的细胞，再用溶菌酶、蛋白酶k和SDS(十二烷基硫酸钠)共同作用裂解细胞，采用氯仿、异戊醇的混合液变性蛋白质，乙醇沉淀DNA得到粗提物，再用BaCl2*CaCl2混合液对粗提DNA溶液处理，进一步去除腐殖酸等杂质，再用乙醇进行离心得到纯化的基因组DNA。本发明采用为直接提取法，采用试剂种类少并且步骤较少，可减少多次操作中DNA的溶解，提高了产量，本发明提取的基因组DNA产量可达90 μ g/g，并且整个过程耗时4h左右，节约了时间。
[0023]2.本发明采用氢氧化钙溶液对土壤样品进行预处理，降低了土壤中腐殖质对基因提取的影响，进一步对提取的基因组进行纯化处理，使基因纯化，用分光光度计测得的0D260/0D280值接近于标准值，说明提取的基因组DNA中没有RNA污染也没有蛋白质污染，本发明提取的基因纯度高，性能稳定，可直接用于PCR和琼脂糖凝胶电泳等实验。本发明的提取方法同样适用于粘性土壤和沙质土壤，也适用于河底污泥等。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为不同方法提取土壤微生物总DNA的电泳图谱。泳道1、2、3分别是对比例1、实施例1和实施例2的方法提取的基因组DNA。
[0025]图2为不同方法提取土壤微生物总DNA扩增其16Sr RNA序列的电泳图谱。泳道
1、2、3分别是对比例1、实施例1和实施例2的基因组DNA扩增16Sr RNA序列的图谱。
【具体实施方式】
[0026]下面结合具体实施例来对本方法进行详细说明。
[0027]材料:选取陕西科技大学花园土作为土样。
[0028]对比例I
[0029]采用现有技术中文献中的方法进行提纯DNA(文献如下:TSA I Y L，OLSON BH.Rapid method for diceet extract1n of DNA from soil and sediments[J].Appliedand Environment Microb1logy，1991，57 (4): 1070-1074.)，具体过程如下:
[0030](I)取Ig经研磨的土壤粉末，置于1mL离心管中，然后加入2mL磷酸钠缓冲液(0.12mol/L，pH值为8.0)，混合均勾后放于30°C摇床上，再转速为150r/min下摇动15min。
[0031](2)将离心管在转速为8000r/min下进行离心lOmin，得到沉淀A。
[0032](3)向沉淀A中加入2mL磷酸钠缓冲液(0.12mol/L，pH值为8.0)，混合均匀后放于30°C摇床上，再转速为150r/min下摇动15min，然后在转速为8000r/min下进行离心lOmin，得到沉淀B ；
[0033](4)向沉淀 B 中加入裂解液 I (0.15mol/L NaCl, 0.lmol/L EDTA，pH值 8.0) 1.5mL和50mg/L的溶菌酶溶液0.5mL，混勾后在37°C下水浴加热2h，加热过程中每20min摇一下。
[0034](5)然后加入裂解液 II (0.lmol/L NaCl,0.5mol/L Tris-HCl, ρΗ8.0，10 %SDS)2mL，反复冻融3次后在转速为8000r/min下进行离心15min，得到上清液A。
[0035](6)将上清液A与等体积酚试剂(体积比，苯酚:氯:仿异戊醇=25:24:1)混合后，在转速为8000r/min下进行离心lOmin，取上清液B。
[0036](7)将上清液B与等体积酚试剂(体积比，苯酚:氯:仿异戊醇=25:24:1)混合后，在转速为8000r/min下进行离心lOmin，取上层水相A。
[0037](8)将上层水相A与等体积氯仿、异戊醇的混合液混合，8000r/min,离心lOmin，取上层水相B。其中，氯仿、异戊醇的混合液中氯仿与异戊醇的体积为24:1 ;
[0038](9)向上层水相B中加0.6倍体积异丙醇，于_20°C下在冰箱中过夜放置会在转速为10000r/min下进行离心20min，弃上清液，得到沉淀。
[0039](10)用质量分数为70%的乙醇洗涤沉淀后收集沉淀，沉淀即为基因组DNA，将沉淀溶解于PH值为8.0的TE缓冲液，使终体积为100 μ Lo
[0040](11)以步骤(10)得到的DNA为模板，建立25 μ L PCR反应体系，10 X GCbuffer，10 yL ；ddH20,9.8 yL ；上下游引物各 I μ L ;dNTP (2.5mM each)，2 μ L ;DNA 模板，I yL(50ng/yL) ;rTaq(5U/μ L)，0.2 μ L。PCR 反应条件为:94 °C 预变性 2min ;94°C 变性608，54°〇退火408，72°〇延伸408，35个循环；72°〇延伸5111丨11。以16Sr RNA引物27F 5，AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3，和 1492R 5，TACGGCTACCTTGTTACGACTT3’为引物扩增出土壤 16SrRNA并进行电泳检测。本方法提取的DNA条带不清晰，也未扩增出16Sr RNA序列，详见图1，图1中I对应的为本对比例的DNA条带。
[0041]用分光光度计测得的0D260/0D280值为1.46。
[0042]实施例1
[0043](I)取土壤样品5g于50mL离心管中，加入2mol/L Ca (OH) 2水溶液5mL，振荡2min使土样分散混匀，得到土壤混合液；
[0044](2)向土壤混合液中加入0.2mol/L磷酸钠溶液5mL和0.2mol/L NaOH溶液5mL，旋涡振荡5min，使土壤中的细胞充分释放出来，然后在转速为1000g下离心5min，收集沉淀。
[0045]⑶将沉淀0.5g放入试管中，再向试管中加入500 yL DNA提取液(10mmol/LTris-HCl, ρΗ7.5，10mmol/L EDTA，10mmoI/L NaCl,5% SDS)，再加入 30 μ L 溶菌酶溶液(50mg/mL)和20 μ L蛋白酶k溶液(20mg/mL)，然后在70°C下水浴加入30min使细胞破壁，将DNA释放，得到溶液A。
[0046](4)向溶液A中加入与溶液A等体积的氯仿与异戊醇的混合溶液(氯仿与异戊醇的体积比为24:1)，上下颠倒至溶液变成乳浊液，然后于4°C、转速12000g下离心lOmin，吸取上清液。
[0047](5)向步骤(4)的上清液中加入与上清液等体积的氯仿与异戊醇的混合溶液(氯仿与异戊醇的体积比为24:1)，上下颠倒至溶液变成乳浊液，于4°C、转速12000g下离心1min,吸取上清液。
[0048](6)向步骤(5)的上清液中加入与上清液等体积的质量分数为70%的乙醇溶液，然后于4°C、转速12000g下离心lOmin，沉淀DNA，倒掉乙醇溶液，于烘箱中90°C下干燥20min使乙醇完全挥发，得到DNA的粗提物。
[0049](7)将步骤(6)得到的DNA粗提物溶解于100 μ L无菌水中，然后加入700 μ Llmol/L的BaClJP CaCl 2的混合液，于4°C、转速12000g下离心lOmin，吸取上清液。
[0050](8)向步骤(7)中得到的上清液中加入与上清液等体积的氯仿与异戊醇的混合液(氯仿与异戊醇的体积比为24:1)，颠倒混匀，于4°C、转速12000g下离心lOmin，吸取上清液。
[0051](9)向步骤⑶中得到的上清液中加入与上清液等体积的质量分数为70%的乙醇溶液，然后于4°C、转速12000g下离心lOmin，后倒掉上层液，室温放置或烘箱烘干直至乙醇完全挥发，得到基因组DNA，基因组DNA的产量为90 μ g/g ;将基因组DNA溶于200 μ L无菌水中。
[0052](10)以步骤(9)得到的DNA为模板，建立25 μ L PCR反应体系，10XGCbuffer，10 yL ；ddH20,9.8 yL ；上下游引物各 I μ L ;dNTP (2.5mM each)，2 μ L ;DNA 模板，I yL(50ng/yL) ;rTaq(5U/μ L)，0.2 μ L。PCR 反应条件为:94 °C 预变性 2min ;94°C 变性608，54°〇退火408，72°〇延伸408，35个循环；72°〇延伸5111丨11。以16Sr RNA引物27F 5，AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’和 1492R 5，TACGGCTACCTTGTTACGACTT3’为引物扩增出土壤 16SrRNA并进行电泳检测。
[0053]用分光光度计测得的0D260/0D280值为1.82。
[0054]实施例2
[0055](I)取土壤样品5g于50mL离心管中，加入2mol/L Ca(OH)2水溶液10mL，振荡2min使土样分散混匀，得到土壤混合液；
[0056](2)向土壤混合液中加入0.2mol/L磷酸钠5mL和0.2mol/L NaOH溶液5mL，旋涡振荡5min，使土壤中的细胞充分释放出来，然后在转速为8000g离心5min，收集沉淀。
[0057]⑶将沉淀0.5g加入到试管中，再向试管中加入750 yL DNA提取液(lOmmol/L Tris-HCl，pH7.5，10mmol/L EDTA，10mmoI/L NaCl，5% SDS)，再加入 30 μ L 溶菌酶溶液(50mg/mL)和20 μ L蛋白酶溶液k (20mg/mL)，然后在70°C水浴35min，使细胞破壁，将DNA释放，得到溶液A。
[0058](4)向溶液A中加入与溶液A等体积的氯仿与异戊醇的混合液(氯仿与异戊醇的混合液中氯仿与异戊醇的体积比为24:1)，上下颠倒至溶液变成乳浊液，然后于4°C下13000g离心lOmin，吸取上清液。
[0059](5)重复步骤⑷。
[0060](6)向上清中加入与上清液1.5倍体积的质量分数为70%的乙醇溶液，然后于4°C,13000g下离心lOmin，沉淀DNA，倒掉乙醇，在烘箱中于90°C下干燥20min使酒精完全挥发，得到DNA的粗提物。
[0061](7)将步骤(6)得到的DNA粗提物溶解于100 μ L无菌水中，然后加入700 μ Llmol/L的BaCl#Pl CaCl 2的混合液，于4°C，转速为13000g下离心lOmin，吸取上清。
[0062](8)向步骤(7)中得到的上清中加入与上清液等体积氯仿与异戊醇的混合液(氯仿与异戊醇的体积比为24:1)，颠倒混匀，然后在4°C下，13000g转速下离心lOmin，吸取上清液。
[0063](9)向步骤⑶中得到的上清中加入与上清液等体积的质量分数为70%的乙醇溶液，然后于4°C、转速为13000g离心lOmin，后倒掉上层液，室温放置或烘箱烘干直至酒精完全挥发，得到基因组DNA，基因组DNA的产量为92 μ g/g ;将得到的基因组DNA溶于200 μ L无囷水中。
[0064](10)以步骤(9)得到的DNA为模板，建立25 μ L PCR反应体系，10XGCbuffer，10 yL ；ddH20,9.8 yL ；上下游引物各 I μ L ;dNTP (2.5mM each)，2 μ L ;DNA 模板，I yL(50ng/yL) ;rTaq(5U/μ L)，0.2 μ L。PCR 反应条件为:94 °C 预变性 2min ;94°C 变性608，54°〇退火408，72°〇延伸408，35个循环；72°〇延伸5111丨11。以16Sr RNA引物27F 5，AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3，和 1492R 5，TACGGCTACCTTGTTACGACTT3，为引物扩增出土壤 16SrRNA并进行电泳检测。
[0065]用分光光度计测得的0D260/0D280值为1.81。(标准值为1.8，> 1.9表明有RNA污染，< 1.6表明有蛋白质污染)
[0066]参见图1，图1中泳道I为对比例I的电泳图，泳道2为实施例1的电泳图，泳道3为实施例2的电泳图，基金片段大小为23kb，从图1可以看出，泳道2、3基因条带比泳道I条带清晰，从图2可以看出，泳道I未扩增到16S rRNA序列，泳道2、3扩增出的条带非常清晰，说明基因组DNA纯度较高，可以用于后续分子操作。
[0067]实施例3
[0068](I)将土壤加入到离心管中，并加入浓度为lmol/L的氢氧化钙水溶液，振荡1min使土样分散，得到土壤混合液；其中，土壤与氢氧化钙水溶液中氢氧化钙的比为5g:20mmol ；
[0069](2)向土壤混合液中加入0.lmol/L磷酸钠溶液和0.2mol/L氢氧化钠溶液，振荡5min使土壤中的细胞释放，然后进行离心，收集沉淀；其中，土壤与磷酸盐溶液中磷酸盐、氢氧化钠溶液中氢氧化钠的比为5g:0.lmmol:0.1mmol ；
[0070](3)向沉淀中加入DNA提取液、溶菌酶溶液和蛋白酶k溶液，然后于60°C下加热Ih，得到溶液A ;其中，沉淀、DNA提取液、溶菌酶溶液和蛋白酶k溶液的比为0.5g: 1500 μ L:30 μ L:60 μ L ；DNA 提取液包括 10mmol/L pH 值为 7.5 的 Tris-HCl，1mmoI/L EDTA,10mmoI/L NaCl，质量分数为5%的SDS和水；溶菌酶溶液的浓度为40mg/mL，蛋白酶k溶液的浓度为20mg/mL。
[0071](4)向溶液A中加入氯仿与异戊醇的混合物，震荡至溶液变成乳浊液后进行离心，吸取上清液；其中，氯仿与异戊醇的混合物的体积是溶液A体积的0.8倍；其中，氯仿与异戊醇的混合物中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。
[0072](5)向上清液中加入上清液体积2倍的质量分数为70%的乙醇水溶液并在温度为4°C，离心速率为16000g下进行离心lOmin，将所得沉淀晾干或在70°C下干燥30min，得到DNA粗提物，将粗提物进行纯化，得到基因组DNA。纯化的具体过程为:将DNA粗提物溶解于无菌水中，然后加入洗涤液并进行离心，吸取上清液A ;向上清液A中加入氯仿与异戊醇的混合物，震荡混匀，并于4°C下离心，吸取上清液B，向上清液B中加入乙醇溶液，并于4°C下、转速为12000g下离心，所得沉淀即为基因组DNA ;其中，所述洗涤液为BaCljP CaCl 2的水溶液，且水溶液中BaClg CaCl 2的总浓度为0.5mol/L，且BaCl 2与CaCl 2的摩尔比为1:1。氯仿与异戊醇的混合物的体积为上清液体积的I倍；氯仿与异戊醇的混合物中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。
[0073]实施例4
[0074](I)将土壤加入到离心管中，并加入浓度为1.5mol/L的氢氧化钙水溶液，振荡8min使土样分散，得到土壤混合液；其中，土壤与氢氧化钙水溶液中氢氧化钙的比为5g:1mmol ；
[0075](2)向土壤混合液中加入0.2mol/L磷酸钠溶液和0.lmol/L氢氧化钠溶液，振荡5min使土壤中的细胞释放，然后进行离心，收集沉淀；其中，土壤与磷酸盐溶液中磷酸盐、氢氧化钠溶液中氢氧化钠的比为5g:0.25mmol:0.lmmol ；
[0076](3)向沉淀中加入DNA提取液、溶菌酶溶液和蛋白酶k溶液，然后于70°C下加热0.5h，得到溶液A ;其中，沉淀、DNA提取液、溶菌酶溶液和蛋白酶k溶液的比为1.5g:500 μ L:90 μ L:20 μ L ;DNA提取液包括 1mmoI/L pH值为 7.5 的 Tris-HCl，10mmol/L EDTA,10mmoI/L NaCl，质量分数为5%的SDS和水；溶菌酶溶液的浓度为60mg/mL，蛋白酶k溶液的浓度为30mg/mL。
[0077](4)向溶液A中加入氯仿与异戊醇的混合物，震荡至溶液变成乳浊液后进行离心，吸取上清液；其中，氯仿与异戊醇的混合物的体积是溶液A体积的1.2倍；其中，氯仿与异戊醇的混合物中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。
[0078](5)向上清液中加入上清液体积2倍的质量分数为70%的乙醇水溶液并在温度为4°C，离心速率为13000g下进行离心lOmin，将所得沉淀晾干或在100°C下干燥20min，得到DNA粗提物，将粗提物进行纯化，得到基因组DNA。纯化的具体过程为:将DNA粗提物溶解于无菌水中，然后加入洗涤液并进行离心，吸取上清液A ;向上清液A中加入氯仿与异戊醇的混合物，震荡混匀，并于4°C下、转速为16000g下离心，吸取上清液B，向上清液B中加入乙醇溶液，并于4°C下离心，所得沉淀即为基因组DNA ;其中，所述洗涤液为BaCljP CaCl 2的水溶液，且水溶液中8&(:12与CaCl 2的总浓度为lmol/L，且BaCl 2与CaCl 2的摩尔比为2:1。氯仿与异戊醇的混合物的体积为上清液体积的0.8倍；氯仿与异戊醇的混合物中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。
[0079]实施例5
[0080](I)将土壤加入到离心管中，并加入浓度为2mol/L的氢氧化钙水溶液，振荡5min使土样分散，得到土壤混合液；其中，土壤与氢氧化钙水溶液中氢氧化钙的比为1g:1mmol ；
[0081](2)向土壤混合液中加入0.lmol/L磷酸钾溶液和0.lmol/L氢氧化钠溶液，振荡5min使土壤中的细胞释放，然后进行离心，收集沉淀；其中，土壤与磷酸盐溶液中磷酸盐、氢氧化钠溶液中氢氧化钠的比为1g:0.2mmol:0.25mmol ；
[0082](3)向沉淀中加入DNA提取液、溶菌酶溶液和蛋白酶k溶液，然后于65°C下加热0.6h，得到溶液A ;其中，沉淀、DNA提取液、溶菌酶溶液和蛋白酶k溶液的比为Ig:800 μ L:40 μ L:30 μ L ；DNA 提取液包括 10mmol/L pH 值为 7.5 的 Tris-HCl，1mmoI/L EDTA,10mmoI/L NaCl，质量分数为5%的SDS和水；溶菌酶溶液的浓度为50mg/mL，蛋白酶k溶液的浓度为25mg/mL。
[0083](4)向溶液A中加入氯仿与异戊醇的混合物，震荡至溶液变成乳浊液后进行离心，吸取上清液；其中，氯仿与异戊醇的混合物的体积是溶液A体积的I倍；其中，氯仿与异戊醇的混合物中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。
[0084](5)向上清液中加入上清液体积2倍的质量分数为70%的乙醇水溶液并在温度为4°C，离心速率为16000g下进行离心lOmin，将所得沉淀晾干或在80°C下干燥20min，得到DNA粗提物，将粗提物进行纯化，得到基因组DNA。纯化的具体过程为:将DNA粗提物溶解于无菌水中，然后加入洗涤液并进行离心，吸取上清液A ;向上清液A中加入氯仿与异戊醇的混合物，震荡混匀，并于4°C下离心，吸取上清液B，向上清液B中加入乙醇溶液，并于4°C下、转速为15000g下离心，所得沉淀即为基因组DNA ;其中，所述洗涤液为BaCljP CaCl 2的水溶液，且水溶液中8&(:12与CaCl 2的总浓度为0.6mol/L，且BaCl 2与CaCl 2的摩尔比为1: 2。氯仿与异戊醇的混合物的体积为上清液体积的1.2倍；氯仿与异戊醇的混合物中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。
[0085]实施例6
[0086](I)将土壤加入到离心管中，并加入浓度为2mol/L的氢氧化钙水溶液，振荡7min使土样分散，得到土壤混合液；其中，土壤与氢氧化钙水溶液中氢氧化钙的比为8g:14mmol ；
[0087](2)向土壤混合液中加入0.2mol/L磷酸钾溶液和0.2mol/L氢氧化钠溶液，振荡5min使土壤中的细胞释放，然后进行离心，收集沉淀；其中，土壤与磷酸盐溶液中磷酸盐、氢氧化钠溶液中氢氧化钠的比为1g:0.lmmol:0.15mmol ；
[0088](3)向沉淀中加入DNA提取液、溶菌酶溶液和蛋白酶k溶液，然后于70°C下加热Ih，得到溶液A ;其中，沉淀、DNA提取液、溶菌酶溶液和蛋白酶k溶液的比为1.2g: 1200 μ L:750 μ L:50 μ L ；DNA 提取液包括 10mmol/L pH 值为 7.5 的 Tris-HCl，1mmoI/L EDTA,10mmoI/L NaCl，质量分数为5%的SDS和水；溶菌酶溶液的浓度为40mg/mL，蛋白酶k溶液的浓度为27mg/mL。
[0089](4)向溶液A中加入氯仿与异戊醇的混合物，震荡至溶液变成乳浊液后进行离心，吸取上清液；其中，氯仿与异戊醇的混合物的体积是溶液A体积的0.9倍；其中，氯仿与异戊醇的混合物中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。
[0090](5)向上清液中加入上清液体积2倍的质量分数为70%的乙醇水溶液并在温度为4°C，离心速率为14000g下进行离心lOmin，将所得沉淀晾干或在90°C下干燥22min，得到DNA粗提物，将粗提物进行纯化，得到基因组DNA。纯化的具体过程为:将DNA粗提物溶解于无菌水中，然后加入洗涤液并进行离心，吸取上清液A ;向上清液A中加入氯仿与异戊醇的混合物，震荡混匀，并于4°C下离心，吸取上清液B，向上清液B中加入乙醇溶液，并于4°C下、转速为14000g下离心，所得沉淀即为基因组DNA ;其中，所述洗涤液为BaCljP CaCl 2的水溶液，且水溶液中BaClg CaCl 2的总浓度为0.6mol/L，且BaCl 2与CaCl 2的摩尔比为1:1。氯仿与异戊醇的混合物的体积为上清液体积的1.2倍；氯仿与异戊醇的混合物中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。
[0091 ] 本发明采用了 Ca (OH) 2溶液、磷酸盐和NaOH溶液对土壤进行预处理使土样分散均匀释放被土质包裹的细胞，采用溶菌酶、蛋白酶k和SDS共同作用裂解细胞，通过氯仿与异戊醇的混合液变性蛋白质，通过BaClJP CaCl 2混合液对粗提DNA溶液处理进一步去除腐殖酸等杂质，最终得到纯度和产率都较高的基因组DNA，采用本方法采用的均为常规试剂，并可在4h之内完成，得到的基因组DNA可用于后续PCR等操作中，本发明不仅大大节约了时间，而且适合常规实验室操作。本发明的提取方法也适用于其他土质如粘性土壤和沙质土壤，也适用于河底污泥等。
【权利要求】
1.一种土壤微生物基因组的提取方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将土壤加入到离心管中，并加入氢氧化钙水溶液，振荡使土样分散，得到土壤混合液；其中，土壤与氢氧化妈水溶液中氢氧化妈的比为(5-10) g: (10-20)mmol ； (2)向土壤混合液中加入磷酸盐溶液和氢氧化钠溶液，振荡使土壤中的细胞释放，然后进行离心，收集沉淀；其中，土壤与磷酸盐溶液中磷酸盐、氢氧化钠溶液中氢氧化钠的比为(5-10) g: (0.1-0.25) mmol: (0.1-0.25) mmol ； (3)向沉淀中加入DNA提取液、溶菌酶溶液和蛋白酶k溶液，然后于60-70°C下加热后得到溶液A ;其中，沉淀、DNA提取液、溶菌酶溶液和蛋白酶k溶液的加入量比为(0.5-1.5)g: (500-1500) μ L: (30-90) μ L: (20-60) μ L ； (4)向溶液A中加入氯仿与异戊醇的混合物，震荡至溶液变成乳浊液后进行离心，吸取上清液；其中，氯仿与异戊醇的混合物的体积是溶液A体积的0.8-1.2倍； (5)向上清液中加入乙醇水溶液并进行离心，将所得沉淀晾干或烘干，得到DNA粗提物，将DNA粗提物进行纯化，得到基因组DNA。
2.根据权利要求书所述的一种土壤微生物基因组的提取方法，其特征在于，所述将DNA粗提物进行纯化的具体过程为:将DNA粗提物溶解于无菌水中，然后加入洗涤液并进行离心，吸取上清液A ;向上清液A中加入氯仿与异戊醇的混合物，震荡混匀，并于4°C下离心，吸取上清液B，向上清液B中加入乙醇溶液，并于4°C下离心，所得沉淀即为基因组DNA ;其中，氯仿与异戊醇的混合物的体积为上清液体积的0.8-1.2倍；氯仿与异戊醇的混合物中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。
3.根据权利要求2所述的一种土壤微生物基因组的提取方法，其特征在于，所述洗涤液为BaCljP CaCl 2的水溶液，且水溶液中BaCl 2与CaCl 2的总浓度为0.5-lmol/L，且BaCl 2与CaCl2的摩尔比为1:1,2:1或1:2。
4.根据权利要求1所述的一种土壤微生物基因组的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中Ca(OH)JK溶液的浓度为l_2mol/L;振荡的时间为2_5min。
5.根据权利要求1所述的一种土壤微生物基因组的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中磷酸盐水溶液和氢氧化钠溶液的浓度均为0.1-0.2mol/L ;磷酸盐为磷酸钠或磷酸钾；步骤(I)中振荡的时间为5-10min。
6.根据权利要求1所述的一种土壤微生物基因组的提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中DNA提取液包括 1mmoI/L ?抑直为7.5的1^8-!1(:1，1011111101/1 EDTA，10mmoI/L NaCl,质量分数为5%的SDS ;溶菌酶溶液的浓度为40-60mg/mL，蛋白酶k溶液的浓度为20_30mg/mLo
7.根据权利要求1所述的一种土壤微生物基因组的提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中加热时间为0.5-lh。
8.根据权利要求1所述的一种土壤微生物基因组的提取方法，其特征在于，所述步骤(4)中氯仿与异戊醇的混合物中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。
9.根据权利要求1所述的一种土壤微生物基因组的提取方法，其特征在于，所述步骤(5)中乙醇水溶液的质量分数为70%;乙醇水溶液的体积为上清液体积的1-2倍，离心的温度为4°C，离心速率为12000-16000g，离心时间为lOmin。
10.根据权利要求1所述的一种土壤微生物基因组的提取方法，其特征在于，所述步骤 (5)中烘干的温度为70-100°C，烘干时间为20-30min。
【文档编号】C12N15/10GK104480103SQ201410708098
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月27日 优先权日:2014年11月27日
【发明者】龚国利, 张甜 申请人:陕西科技大学