一种早期检测肝癌发生或转移的hsa-mir-135a、hsa-mir-302d和hsa-mir-10b联合检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及医学生物检测【技术领域】，本发明提供了一种用于检测血浆或血清中的hsa-mir-135a、hsa-mir-302d及hsa-mir-10b的含量，来预测肝癌发生或转移的试剂或试剂盒、及其相应的检测方法。本发明为早期诊断肝癌的发生、预测肝癌的转移提供了新的手段，以便尽早进行临床干预，防止病情进展，改善患者预后。
【专利说明】-种早期检测肝癌发生或转移的hsa-mi r-135a、 hsa-m i r-302d和hsa-m i r-1 Ob联合检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学生物检测【技术领域】，是一种用于检测血浆或血清中的 hsa-mir-135a、hsa-mir-302d及hsa-mir-10b的含量，来预测肝癌发生及转移的试剂盒、及 其检测方法。
【背景技术】
[0002] 肝癌严重威胁是我国人民生活健康的疾病之一，其致死率位居第三位。全世界每 年因肝癌死亡的患者中，约有40%来自中国。随着治疗方法和影像检测技术水平的提高，早 期肝癌根治切除术后的五年生存率已大大提高。然而，由于大部分的肝癌患者在确诊的时 候已经处于晚期，肝癌患者的整体治疗效果及病人预后都比较差。
[0003] 另外，在肝癌的治疗过程中，癌症的复发和转移是比较常见问题。大约90%的肝癌 死亡患者跟癌症的转移和复发有关。目前临床应用多种治疗手段（手术切除、放疗，化疗及 联合治疗方法），仍无法彻底解决肿瘤治疗中存在的复发和转移的问题。秉承早发现早治疗 的原则，及早发现肝癌的发生和转移，对于改善患者预后，提高临床治疗效果至关重要。
[0004] 目前对于肝癌的诊断主要依靠影像学检查、病理活检结合甲胎蛋白（AFP)等分子 指标检测能够反应早期肝癌发生和转移的检测指标还未有临床应用。
[0005] microRNA (miRNA)是一类长度约21?25碱基的非编码小分子RNA，广泛存在于 多细胞生物和病毒体内。目前越来越多的研究显示，miRNA广泛参与了生物体多种生理 过程，其表达改变及功能失调能够导致肿瘤发生、白血病以及病毒感染等多种病理现象。 由于在血浆和血清中稳定性好且表达具有组织特异性（Calin G A, Croce M C. MicroRNA signatures in human cancers. Nat Rev Cancer, 2006, 6 (11) :857-866)，miRNA 在疾病的 血清学检测应用方便的到广泛的关注。
[0006] 目前，诸多报道患者血清中miRNA能够患者疾病诊断及预后分析的标志分子。 Zhang ZQ等人报道肝癌患者外周血清中miR-143和miR-215能够作为肝炎及肝癌的诊 断标志物（Zhang ZQ，Meng H，Wang N，Liang LN，Liu LN, et al. Serum microRNA 143and microRNA 215as potential biomarkers for the diagnosis of chronic hepatitis and hepatocellular carcinoma. Diagn Pathol. 2014. 9:135)。Shen J 等人报道患者血清 中miR_148b和miR-133能够作为乳腺癌的诊断标志物（Shen J，Hu Q，Schrauder M，Yan Lj Wang D，et al. Circulating miR_148b and miR_133a as biomarkers for breast cancer detection. Oncotarget 2014. 5:5284-5294)。另外，在前列腺癌、肺癌及结肠癌等 癌症中都有不同的血清miRNA可以作为检测标记物（Cheng G. Circulating miRNAs:Roles in cancer diagnosis,prognosis and therapy.Adv Drug Deliv Rev 2014Sepl6. pii:S0169-409X(14) 00199-9)。说明血清miRNA作为肿瘤检测标志物的广泛性。
[0007] 目前研究报道 miR-135a(Mature sequence MIMT0000428)参与了前列腺癌， 乳腺癌和胃癌等多种肿瘤的发生和转移。KiOiss A等报道miR-135a通过抑制R0CK1 和R0CK2的表达调控前列腺癌细胞的转移（Kroiss A，Vincent S，Decaussin_Petrucci M，Meugnier E，Viallet J，et al. Androgen-regulated microRNA_135a decreases prostate cancer cell migration and invasion through downregulating ROCKland R0CK2. Oncogene. 2014)。Chen Y等报道miR-135a通过调控H0XA10促进乳腺癌细胞转 移（Chen Yj Zhang Jj Wang Hj Zhao J，Xu C，et al. miRNA-135a promotes breast cancer cell migration and invasion by targeting HOXA10. BMC Cancer 2012.12:111)。发 明人早期研究发现miR-135a通过调控MTSSl促进肝癌细胞的转移（Liu S，Guo W，Shi J，Li N，Yu X，et al. MicroRNA-135a contributes to the development of portal vein tumor thrombus by promoting metastasis in hepatocellular carcinoma. J Hepatol 2012.56:389-396.)〇
[0008] miR-302d (Mature sequence MIMT 0000718)主要在胚胎干细胞中 表达(Li SSj Yu SL，Kao LPj Tsai ZY，Singh S，et al. Target identification of microRNAs expressed highly in human embryonic stem cells.J Cell Biochem. 2009. 106:1020-1030.)，能够通过抑制 CDKNlA and CCL5 的表达促进 间充质干细胞增殖、抑制其凋亡（Kim JY，Shin KK，Lee AL, Kim YS，Park HJ，et al. MicroRNA-302induces proliferation and inhibits oxidant-induced cell death in human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Cell Death Dis. 2014. 5:el385)。
[0009] miR-lOb (Mature sequence MIMT 0000254)调控不同的下游祀基因能够促进卵 巢癌细胞（Nakayama I，Shibazaki M，Yashima-Abo A，Miura F，Sugiyama T，et al. Loss of HOXDIOexpression induced by upregulation of miR-10b accelerates the migration and invasion activities of ovarian cancer cells. Int J Oncol. 2013. 43:63-71)和胶 质瘤细胞转移（Liu S，Sun J，Lan Q. TGF-beta-induced miRlOa/b expression promotes human glioma cell migration by targeting PTEN. Mol Med Rep 2013.8:1741-1746)。
[0010] 目前尚未见miR-302d与癌症的发生或转移相关的文献报道，更未见应用 miR-135a、miR-302d和miR-lOb联合检测来预测肝癌发生及转移的相关文献报道。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的在于寻找到能够有效用于肝癌发生诊断、肝癌预后判断的一组特异 性分子标记物。
[0012] 本发明的另一目的在于提供一种特异性和敏感性都极好的早期检测肝癌发生或 转移的检测试剂或试剂盒。
[0013] 本发明的第三目的在于提供一种早期检测肝癌发生或转移的检测方法。
[0014] 本发明的主要技术方案是：
[0015] 本发明通过健康人群与肝癌患者血清中hsa-mir_135a、hsa-mir_302d 和hsa-mir-10b的含量比较；肝癌无癌栓患者与肝癌伴癌栓患者血中 hsa-mir_135a、hsa-mir_302d和hsa-mir-lOb的含量比较，发现肝癌患者血清中 hsa-mil'-lSSa/SOSd/lOb三条miRNA分子的含量明显高于健康人群，肝癌伴癌栓患者血清 中hsa-mir-135a/302d/10b三条miRNA分子的含量高于肝癌无癌栓患者。本发明首次发现 了 miR-302d与肝癌的发生或转移相关。
[0016] 进一步地，本发明同时运用 hsa-mir_135a、hsa-mir_302d、hsa-mir-lOb 这三条 miRNA分子单独检测肝癌发生或转移，以及联检测肝癌发生或转移，结果显示单独采用三个 分子的检测肝癌发生敏感性分别为0. 65、0. 59、0. 63,单独检测肝癌转移即癌栓发生的敏感 性分别为0. 58、0. 68、0. 66。hsa-mir-135a/302d/10b三条miRNA分子联合检测肝癌发生的 敏感性为0. 81，检测肝癌转移发生的敏感性为0. 85,均高于单个分子检测。
[0017] 本发明的实验结果还显示外周血hsa-mir_135a/302d/10b三条miRNA分子的含量 在健康人群、肝癌患者、肝癌伴癌栓患者中呈现依次升高的趋势。三个miRNA在外周血中含 量可以作为肝癌发生及转移的早期检测手段，三个分子一致升高作为联合检测指标，能够 增加该试剂盒检测的特异性。单独miRNA分析检测敏感性较低，容易导致阳性患者漏诊，三 个分子联合检测敏感性较高，减少了漏诊患者。
[0018] 本发明的第一方面，提供了一种早期检测肝癌发生或转移的分子标记物，该分子 标记物为 hsa-mir-135a、hsa-mir-302d 和 hsa-mir-10b。
[0019] hsa-mir-135a 成熟体序列：UAUGGCUUUUUAUUCCUAUGUG(SEQ ID N0:1)
[0020] hsa-mir-302d 成熟体序列：UAAGUGCUUCCAUGUUUGAGUGU(SEQ ID N0:2)
[0021] hsa-mir-10b 成熟体序列：UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG(SEQ ID NO :3)
[0022] 即，本发明提供了 hsa-mir_135a、hsa-mir_302d 和 hsa-mir-lOb 在制备检测肝癌 发生或转移的检测试剂或试剂盒中的应用。
[0023] 所述的检测试剂，为检测生物样品中hsa-mir_135a含量、hsa-mir_302d含量，和 hsa-mir-10b含量的试剂的组合。
[0024] 所述的试剂盒，包含了检测生物样品中hsa-mir_135a含量的试剂、hsa-mir_302d 含量的试剂，和hsa-mir-10b含量的试剂。
[0025] 所述的检测生物样品中hsa-mir_135a含量的试剂，选自：对hsa-mir_135a具有检 测特异性的PCR引物等。
[0026] 所述的检测生物样品中hsa-mir_302d含量的试剂，选自：对hsa-mir_135a具有检 测特异性的PCR引物等。
[0027] 所述的检测生物样品中hsa-mir-10b含量的试剂，选自：对hsa-mir_135a具有检 测特异性的PCR引物等。
[0028] 所述的生物样品选自：获自对象的新鲜组织或细胞、福尔马林固定或石蜡包埋组 织或细胞、血液或体液。较佳地，为血浆或血清。
[0029] 本发明的第二方面，提供了一种早期检测肝癌发生或转移的hsa-mir-135a、 hsa-mir_302d和hsa-mir-lOb联合检测试剂盒。
[0030] 本发明的试剂盒也称为hsa-mir_135a/302d/10b联合检测试剂盒，该试剂盒是通 过检测血楽或血清中hsa-mir_135a、hsa-mir_302d和hsa-mir-10b的含量的变化，检测早 期肝癌发生及转移，以便尽早采取干预措施或药物治疗，防止肝癌的进一步发展。
[0031] 本发明的早期检测肝癌发生或转移的hsa-mir-135a/302d/10b联合检测试剂盒， 是由反转录系统、引物系统和扩增系统组成。
[0032] 所述的引物系统由通用的反转录引物及通用实时定量PCR引物和三条特异性实 时定量PCR引物组成，在本发明的一个优选实施例中，所述的引物系统具体为：
[0033] 通用的反转录引物序列：TGCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGTTTTTTTTTTT TTTTTTTTT(SEQ ID NO:4)；
[0034] 通用实时定量 PCR 引物：TGCTGTCAACGATACGCTACG(SEQ ID N0:5);
[0035] 三条特异性实时定量PCR引物：
[0036] hsa-mir-l35a 特异实时定量 PCR 引物：TATGGCTTTTTATTCCTATGTG(SEQ ID NO:6)
[0037] hsa-mir_3〇2d特异实时定量PCR 引物：TAAGTGCTTCCATGTTTGAGTGT(SEQ ID NO:7)
[0038] hsa-mir-10b 特异实时定量 PCR 引物：TACCCTGTAGAACCGAATTTGTG(SEQ ID N0:8)。
[0039] 本发明试剂盒的引物是根据已知的生物信息学查得hsa-mir_135a/302d/10b的 成熟体序列而设计的（详见http://microrna. sanger. ac. uk/sequences/)，实时定量PCR 引物均通过Primer 5引物设计软件设计。
[0040] 本发明的试剂盒中，反转录系统、扩增系统可以是本领域的常规选择。
[0041] 所述的反转录系统由反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂组成；
[0042] 所述的扩增系统由SYBR Premix Ex TaqTM试剂组成。
[0043] 在本发明的一个优选实施例中，本发明的试剂盒，具体组成如下：
[0044] A)反转录引物（SEQ ID NO: 4)，1 管，浓度：10 μ M，100 μ 1/ 管；
[0045] Β)实时定量 PCR 通用引物（SEQ ID N0:5)，l 管，浓度：10μΜ，100μ 1/管；
[0046] miR-135a 特异引物（SEQ ID N0:6)，l 管，浓度：10μΜ，100μ 1/管；
[0047] miR-302d 特异引物（SEQ ID N0:7)，l 管，浓度：10μΜ，100μ 1/管；
[0048] miR-lOb特异引物（SEQ ID N0:8)，l 管，浓度：10μΜ，100μ1/管；
[0049] C) Trizol reagent (总 RNA 提取试剂），1 管，2ml/ 管
[0050] D)氯仿 1 管，500 μ 1/管；
[0051] Ε)异丙醇 1 管，I. 500ml/ 管
[0052] F)无水乙醇 1管，7ml/管；
[0053] G)DEPC H20(经焦炭酸乙二酯处理的纯水）1管，Iml/管
[0054] H)dd H20(双蒸水）1 管，2ml/管。
[0055] 本发明还提供了上述hsa-mir-135a/302d/10b检测试剂盒在肝癌发生或转移诊 断中的应用。
[0056] 使用本发明试剂盒检测早期肝癌发生或者转移，检测健康人血清中 hsa-mir-135a/302d/10b的含量作为标准数据。再用相同的方法检测未知患者血清中 hSa-mir-135a/302d/10b含量，对照上述标准数据，即可初步确定该患者是否发生肝癌或转 移，以便作进一步检查确诊。
[0057] 本发明的第三方面，提供了利用上述的早期检测肝癌发生或转移的 hsa-mir_135a、hsa-mir_302d和hsa-mir-10b联合检测试剂盒的检测方法。
[0058] 所述的检测方法具体为：按常规抽血取血清或血浆，用总RNA提取试剂处理血 清或血浆，加氯仿离心后取上层水相，经异丙醇沉淀及酒精沉淀富集血清或血浆中的小 RNA ;由反转录系统反转录小RNA成cDNA ;用扩增系统进行Real-time PCR扩增，测定 hsa-mir-135a、hsa-mir-302d 和 hsa-mir-10b 的含量。
[0059] 本发明所述的早期检测，是指在患者镜下微癌栓（但影像学不能检测到）或出现 肉眼癌栓之前。
[0060] 本发明通过临床收集肝癌无癌栓确诊患者（45例）和肝癌伴癌栓确诊患者（35 例）外周血，用上述检测方法检测血清中hsa-mir-135a/302d/10b的含量。统计分析评价 单个分子检测及三个分子联合检测效能。如表1所示，hsa-mir-135a、hsa-mir-302d和 hsa-mir-10b这三个分子联合检测敏感性及特异性均高于单个分子单独检测。
[0061] 本发明通过检测血浆或血清中的hsa-mir_135a/302d/10b含量的变化，检测早期 肝癌发生及转移，以便尽早进行临床干预，防止病情进展，改善患者预后。本发明为早期诊 断肝癌及转移的发生、改善肝癌的预后提供了新的手段。
【专利附图】
【附图说明】
[0062] 图1 :健康人和肝癌确诊患者血清hsa-mir_135a/302d/10b含量检测；
[0063] 图2 :肝癌无癌栓确诊患者和肝癌伴癌栓确诊患者血清hsa-mir_135a/302d/10b 含量检测；
[0064] 图3 :健康人、肝癌无癌栓确诊患者和肝癌伴癌栓确诊患者血清 hsa-mir-135a/302d/10b 含量比较；
[0065] 图4 :疑似肝癌伴癌栓血清hsa-mir_135a/302d/10b含量检测结果。
【具体实施方式】
[0066] 现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0067] 本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或 按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0068] 实施例1 :制备本发明的试剂盒（供一人用）
[0069] 本发明的试剂盒组成如下：
[0070] 1)反转录引物（SEQ ID NO: 4)，1 管，浓度：10 μ M，100 μ 1/ 管；
[0071] 2)实时定量 PCR 通用引物（SEQ ID N0:5)，l 管，浓度：10μΜ，100μ 1/管；
[0072] miR-135a 特异引物（SEQ ID N0:6)，l 管，浓度：10μΜ，100μ 1/管；
[0073] miR-302d 特异引物（SEQ ID N0:7)，l 管，浓度：10μΜ，100μ 1/管；
[0074] miR-lOb特异引物（SEQ ID N0:8)，l 管，浓度：10μΜ，100μ1/管；
[0075] 3) Trizol reagent (总 RNA 提取试剂），1 管，2ml/ 管
[0076] 4)氯仿 1 管，500 μ 1/管；
[0077] 5)异丙醇 1 管，1.500ml/管
[0078] 6)无水乙醇 1管，7ml/管；
[0079] 7)DEPC H20(经焦炭酸乙二酯处理的纯水）1管，Iml/管
[0080] 8)dd H20(双蒸水）1 管，2ml/管。
[0081] 本发明根据已知的生物信息学查得hsa-mir_135a成熟体序 列：UAUGGCUUUUUAUUCCUAUGUG(SEQ ID N0:l);hsa-mir-302d成熟体序 列：UAAGUGCUUCCAUGUUUGAGUGU(SEQ ID N0:2);hsa-mir-10b 成熟体序列： UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG (SEQ ID NO: 3)，反转录引物及实时定量PCR引物均通过Primer 5引物设计软件设计，由美国invitrogen公司负责引物合成。
[0082] 设计的引物序列如下：
[0083] 1)通用反转录引物序列：TGCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGTTTTTTTTTT TTTTTTTTTT(SEQ ID NO:4)
[0084] 2)通用实时定量 PCR 引物：TGCTGTCAACGATACGCTACG(SEQ ID N0:5)
[0085] 3)hsa-mir-135a 特异实时定量 PCR 引物：TATGGCTTTTTATTCCTATGTG(SEQ ID NO :6)
[0086] hsa-mir_3〇2d特异实时定量PCR 引物：TAAGTGCTTCCATGTTTGAGTGT(SEQ ID NO:7)
[0087] hsa-mir-10b 特异实时定量 PCR 引物：TACCCTGTAGAACCGAATTTGTG(SEQ ID N0:8)
[0088] 制备包括下列组成成分的试剂盒：总RNA提取试剂（Invitrogen公司）、氯仿、 异丙醇、无水乙醇、通用反转录引物（100μ 1/管浓度：10μ M)、通用实时定量PCR引物 (1〇〇μ 1/管浓度：10yM)、miRNA特异性引物（100μ 1/管浓度：10yM)、DEPC Η20(1000μ 1/ 管）、ddH20 (2000 μ 1/ 管）
[0089] DEPC H20的配置：用购买的DEPC(焦碳酸二乙酯），纯度>99%，密度为I. 12g/ml， 配置DEPC H20。IOOmlMiliQ纯水中加0. lmlDEPC，放在100ml干烤过的容量瓶中静置4小 时后高压灭菌，制成千分之一浓度的DEPC H20,经检测不含RNase、DNase和proteinase。 用来溶解合成的反转录引物，并作为反转录时的稀释用水。
[0090] dd H20的配置：MiliQ纯水经高压灭菌后，配置成实时定量PCR用的dd H20。
[0091] 通用反转录引物：由美国invitrogen公司负责引物合成，纯度为PAGE级，合成后 的引物用DEPC H20溶解，终浓度为10 μ M。
[0092] 通用实时定量PCR引物：通过Primer 5引物设计软件设计，由美国invitrogen公 司负责引物合成，纯度为PAGE级，合成后的引物用dd H20溶解，终浓度为10μΜ。
[0093] 特异性实时定量PCR引物：通过Primer 5引物设计软件设计，由美国invitrogen 公司负责引物合成，纯度为PAGE级，合成后的引物分别用dd H20溶解，终浓度为10μΜ。
[0094] 实施例2 :实施例1的试剂盒的检测方法
[0095] 一、采集血清样本及样本准备：
[0096] 由于血清具有取材方便、无创伤性、连续检测的优点，从血清中检测肝癌发生或转 移的生物标志物可以及早检测发现肝癌的发生或转移，将肝癌诊断提高到一个新的水平。
[0097] 血浆样本在上海东方肝胆外科医院采集：40例肝癌无癌栓患者、40例肝癌伴癌栓 患者、20例健康志愿者。样品收集：收集约3?6ml病人的外周血放入含360 μ I EDTA的 抗凝管中，颠倒混匀，静置约半小时，离心取上清得到血浆；收集约3?6ml病人的外周血放 入真空促凝管中，颠倒数次以便充分结合，静置约半小时，1600g离心10min，上清转移到新 管。上清二次进行12000g离心10min，取上清，加入新离心管中得到血清。
[0098] 二、采集血浆样本的处理及提取其中的小RNA :
[0099] (1)血清中按照血楽：Trizol reagent = 0· 4:1 比例，加入 Trizol reagent LS(Invitrogen公司购买），剧烈摇晃混勻。
[0100] ⑵样本放置冰上15min，1000g，4°C离心10min，取上清到新的离心管；每管加入 200μ 1氯仿，摇晃混匀，放置冰上10min，12000g、4°C离心15min，取上层水相；加500μ 1异 丙醇，轻轻摇匀5-6次，-20°C放置lh，12000g 4°C离心10min，离心后在管底出现白色沉淀， 弃上清；沉淀加 Iml 75 %乙醇洗漆，7500g 4°C离心5min，弃上清；沉淀室温瞭干，加适量预 温的DEPC水溶解。使用Eppendorf紫外分光光度仪测定RNA的A260值和A260/A280的比 值（1.8-2. 2)，以评估其浓度和质量。符合定量检测要求的样本进行下一步反应。
[0101] 三、miRNA的实时定量
[0102] I. miRNA 加尾及反转录成 cDNA，米用 Takara 公司 One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit 进行。
[0103] I)按照如下体系配制反转录体系：
[0104]
【权利要求】
1. 一种早期检测肝癌发生或转移的分子标记物，其特征在于，该分子标记物为 hsa-mir_135a、hsa-mir_302d 和 hsa-mir-10b〇 2. hsa-mir-135a、hsa-mir-302d和hsa-mir-10b在制备检测肝癌发生或转移的检测试 剂或试剂盒中的应用。
3. 根据权利要求2所述的hsa-mir_135a、hsa-mir_302d和hsa-mir-lOb在制备检测 肝癌发生或转移的检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的检测试剂为检测生物 样品中hsa-mir_135a含量、hsa-mir_302d含量，和hsa-mir-10b含量的试剂的组合。
4. 根据权利要求2所述的hsa-mir_135a、hsa-mir_302d和hsa-mir-lOb在制备检测 肝癌发生或转移的检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的试剂盒包含了检测生 物样品中hsa-mir_135a含量的试剂、hsa-mir_302d含量的试剂，和hsa-mir-10b含量的试 剂。
5. 根据权利要求3或4所述的hsa-mir_135a、hsa-mir_302d和hsa-mir-lOb在制备 检测肝癌发生或转移的检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的检测生物样品中 hsa-mir_135a含量的试剂、hsa-mir_302d含量的试剂，和hsa-mir-10b含量的试剂，选自： 对 hsa-mir_135a、hsa-mir_302d 或 hsa-mir-lOb 具有检测特异性的 PCR 引物。
6. 根据权利要求3或4所述的hsa-mir_135a、hsa-mir_302d和hsa-mir-lOb在制备 检测肝癌发生或转移的检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的生物样品选自：获 自对象的新鲜组织或细胞、福尔马林固定或石蜡包埋组织或细胞、血液或体液。
7. 一种早期检测肝癌发生或转移的hsa-mir-135a、hsa-mir-302d和hsa-mir-lOb联合 检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含了检测血楽或血清中hsa-mir-135a含量的试剂、 hsa-mir_302d含量的试剂，和hsa-mir-10b含量的试剂。
8. 根据权利要求7所述的一种早期检测肝癌发生或转移的hsa-mir-135a、 hsa-mir-302d和hsa-mir-10b联合检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒是由反转录系统、弓丨 物系统和扩增系统组成，所述的引物系统包括： 通用的反转录引物序列如SEQ ID NO:4所示； 通用实时定量PCR引物如SEQ ID NO: 5所示； hsa-mir-135a特异实时定量PCR引物如SEQ ID N0:6所示； 1^31111-302(1特异实时定量？〇?引物如3￡0 10勵:7所示；hsa-mir-10b特异实时定量PCR引物如SEQ ID NO:8所示。
9. 根据权利要求8所述的一种早期检测肝癌发生或转移的hsa-mir-135a、 hsa-mir-302d和hsa-mir-10b联合检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒，包含如下试剂： A) 通用的反转录引物序列（SEQ ID N0:4)，l管，浓度：10^，100111/管； B) 通用实时定量PCR引物（SEQ ID N0:5)，l管，浓度：1〇11]?，10〇111/管；hsa-mir-135a 特异实时定量 PCR 引物（SEQ ID N0:6)，l 管，浓度：10iiM，100ii 1/管； hsa-mir-302d 特异实时定量 PCR 引物（SEQ ID N0:7)，l 管，浓度：10iiM，100iil/管； hsa-mir-10b特异实时定量 PCR引物（SEQ IDN0:8)，1 管，浓度：1〇11]?，10〇111/管； C) 总 RNA 提取试剂 Trizol reagent, 1 管，2ml/ 管； D) 氯仿，1管，500ia/管； E) 异丙醇，1管，1.500ml/管； F) 无水乙醇，1管，7ml/管； G) DEPC H20,1 管，lml/ 管； H) dd H20,1 管，2ml/ 管。
10. -种利用如权利要求7至9任一所述的早期检测肝癌发生或转移的 hsa-mir_135a、hsa-mir_302d和hsa-mir-10b联合检测试剂盒的检测方法，其特征在于， 所述的检测方法为：按常规抽血取血清或血浆，用总RNA提取试剂处理血清或血浆，加氯 仿离心后取上层水相，经异丙醇沉淀及酒精沉淀富集血清或血浆中的小RNA;由反转录 系统反转录小RNA成cDNA ;用扩增系统进行Real-time PCR扩增，测定hsa-mir-135a、 hsa-mir-302d 和 hsa-mir-lOb 的含量。
【文档编号】C12Q1/68GK104404150SQ201410707798
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月28日 优先权日:2014年11月28日
【发明者】刘善荣, 程树群, 刘淑鹏, 王录美, 李明星, 郭卫星, 余喜亚, 徐贵霞 申请人:中国人民解放军第二军医大学