一种谷氨酸脱羧酶的保存液的制作方法
【专利摘要】本发明公布了一种谷氨酸脱羧酶的保存液，该保存液包括：50mM磷酸盐缓冲液，pH6.0，甘油50％，聚乙二醇辛基苯基醚0.1％-1％，聚山梨酯0.1％-0.2％，NaCl 50-100mM，乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二钠盐1-2mM，山梨醇5-10％，蔗糖和或海藻糖，其中蔗糖10％-20％，海藻糖5％-10％；还包括0.01％-0.05％叠氮钠或0.1％-0.2％麝香草酚和蛋白酶抑制剂为抗痛素和或抑肽酶。利用本发明公布的保存液4℃保存谷氨酸脱羧酶保存1-2个月活性基本不丢失，60℃孵育2小时保留活性为60％。
【专利说明】-种谷氨酸脱錢酶的保存液
【技术领域】
[0001] 本发明涉及酶的保存领域，尤其涉及一种谷氨酸脱駿酶的保存液，属于生物工程 领域。
【背景技术】
[0002] Y-氨基下酸（GABA)存在于哺乳动物脑、脊髓中，是一种抑制性神经传递物质，由 谷氨酸脱駿酶（谷氨酸脱駿酶）催化谷氨酸得到。GABA具有调节血压与也律、营养神经细 胞、促进精神安定、促进脑部供血、促进长期记忆、促进激素分泌、肾功能活化等作用。
[0003] Y -氨基下酸的生产基本采用化学合成、植物富集法和生物合成法。其中生物合成 法利用谷氨酸脱駿酶催化谷氨酸底物生成Y-氨基下酸，可用于生产Y-氨基下酸。
[0004] 谷氨酸脱駿酶可W利用生物工程的方法获得高表达谷氨酸脱駿酶的工程菌、扩大 培养，然后通过下游分离纯化技术获得高纯度高比活的谷氨酸脱駿酶产品。但是谷氨酸脱 駿酶作为蛋白质，室温条件下容易变性失活，无法长期保存。因此，如何采用有效的手段延 长其在室温条件下的保存期限是获得谷氨酸脱駿酶后需要解决的技术问题。
[0005] 目前，常采用酶的固定化将谷氨酸脱駿酶固定于特定载体W增加其耐热性和耐酸 碱性等稳定性能。固定化酶主要为催化剂采用填充床反应器或其他方式连续制备Y-氨基 下酸。作为制备固定化酶催化剂的前体，液体谷氨酸脱駿酶仍存在长期保存的问题，待解 决。
【发明内容】
[0006] 为解决上述问题，本发明提供一种谷氨酸脱駿酶的保存液，在本发明公布的保存 液配方中，谷氨酸脱駿酶可在4C保存1-2个月活性基本不丢失。
[0007] 本发明所采用的技术方案如下：
[0008] -种谷氨酸脱駿酶的保存液，该保存液的成分和重量百分比或摩尔浓度为：
[0009] 50mM磯酸盐缓冲液，P册.0
[0010] 甘油 50%
[0011] 己二胺四己酸0. 1%-1%
[0012] 聚山梨醋 0. 1%-0. 2%
[0013] NaCl SO-IOOmM
[0014] 己二胺四己酸或己二胺四己酸二轴盐l-2mM [00巧]山梨醇5%-10%
[0016] 藏糖和或海藻糖，其中藏糖10% -20%，海藻糖5% -10%
[0017] 优选的，本发明公布的保存液中己二胺四己酸的含量为0. 1%。
[0018] 优选的，本发明公布的保存液中聚山梨醋的含量为0. 1%。
[0019] 优选的，本发明公布的保存液中山梨醇的含量为7. 5%。
[0020] 优选的，本发明公布的保存液中藏糖的含量为15%。
[0021] 优选的，本发明公布的保存液中还包括0.01 % -0.05%叠氮轴或0. 1% -0.2%麾 香草酷。
[0022] 优选的，本发明公布的保存液中还包括蛋白酶抑制剂。
[0023] 优选的，本发明公布的保存液中蛋白酶抑制剂为抗痛素和或抑肤酶。
[0024] 优选的，本发明公布的保存液中抗痛素的浓度为50 U g/mL。
[0025] 优选的，本发明公布的保存液中抑肤酶的浓度为1-2 U g/mL。
[0026] 本发明的有益效果是；1、保存液中含有对谷氨酸脱駿酶有特别保护效果的藏糖和 海藻糖，有效提高了谷氨酸脱駿酶的热稳定性；2、谷氨酸脱駿酶长期保存中活力的丢失的 一个主要原因是由微生物污染引起的，在保存液中增加抑菌剂或防腐剂，能有效避免保存 液中或酶液中存在的微量微生物因从长期保存带来的活力丢失问题；3、藏糖、海藻糖和山 梨醇亦能稳定液体环境中的谷氨酸脱駿酶，减缓或预防其发生有害的蛋白聚集；4、酶液中 蛋白酶的存在是另一个引起酶活力丢失的原因，适当添加蛋白酶抑制剂能避免或延缓该一 过程的发生；5、同时，在50%甘油中添加的藏糖、海藻糖、山梨醇W及氯化轴，能有效降低 保存液冰点，避免因低温保存环境中温度的骤升骤降带来的活力损伤。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限如此。
[0028] 实施例一
[0029] 本实施例中保存液配方如下：
[0030] 50mM磯酸盐缓冲液，P册.0,甘油50%，己二胺四己酸0. 1%，聚山梨醋0. 1%，化Cl 50mM，己二胺四己酸二轴盐ImM,山梨醇5 %，藏糖10 %，海藻糖10 %，叠氮轴0. 05 %，抗痛素 50 U 咨/mL。
[0031] 配置方法；按比例称量磯酸轴和磯酸氨二轴，甘油，己二胺四己酸，聚山梨醋， 化Cl,己二胺四己酸二轴盐，山梨醇，藏糖，海藻糖，叠氮轴，混合均匀后肥1调抑至6. 0， 12rc灭菌30min ;冷却至室温后加入抗痛素，混合均匀后4C保存备用。整个配液过程无菌 操作。
[0032] 实施例二
[0033] 本实施例中保存液配方如下：
[0034] 50mM磯酸盐缓冲液，P册.0,甘油50%，己二胺四己酸0. 5%，聚山梨醋0. 1 %，化Cl IOOmM,己二胺四己酸二轴盐2mM，山梨醇10%，海藻糖10%,0.2%麾香草酷。
[00巧]配置方法如实施例一所述。麾香草酷常温配置。
[003引 实施例S
[0037] 本实施例中保存液配方如下：
[003引 50mM磯酸盐缓冲液，P册.0,甘油50%，己二胺四己酸0. 5%，聚山梨醋0. 1 %，化Cl IOOmM,己二胺四己酸二轴盐2mM，山梨醇10%，海藻糖10%，0. 2%麾香草酷，抗痛素50 y g/ 血，抑肤酶2 y g/血。
[0039] 配置方法如实施例一所述。麾香草酷常温配置，抑肤酶配置方法同抗痛素。
[0040] 实施例四
[0041] 本实施例中保存液配方如下：
[004引 50mM磯酸盐缓冲液，P册.0、甘油50 %，己二胺四己酸0. 5 %，聚山梨醋0. I %，化Cl IOOmM,己二胺四己酸二轴盐2mM，山梨醇5%，海藻糖10%、0. 2%麾香草酷、抗痛素50 y g/ 血、抑肤酶2 y g/血。
[0043] 配置方法如实施例一所述。麾香草酷常温配置，抑肤酶配置方法同抗痛素。
[0044] 实施例五
[0045] 本实施例中保存液配方如下：
[0046] 50mM磯酸盐缓冲液，P册.0,甘油50%，己二胺四己酸0. 1%，聚山梨醋0. 1%，化Cl IOOmM,己二胺四己酸二轴盐2mM，山梨醇7. 5%，藏糖7. 5%，海藻糖10%，0. 2%麾香草酷， 抗痛素50 y g/mU抑肤酶2 y g/mL。
[0047] 配置方法如实施例一所述。麾香草酷常温配置，抑肤酶配置方法同抗痛素。
[004引实施例六
[0049] 大肠杆菌谷氨酸脱駿酶在保存液中稳定性测试
[0050] 大肠杆菌谷氨酸脱駿酶酶液；比活为150U/mg，蛋白浓度为0. 5mg/mL。
[0051] 比色法测定固定化谷氨酸脱駿酶活力。1个谷氨酸脱駿酶活力单位扣）定义为： 在37C，P册.5条件下，每分钟每毫升酶液中催化谷氨酸脱駿酶发生脱駿反应生成1 U mol 的GABA所需酶量。
[0052] 实验方法1 ;将大肠杆菌谷氨酸脱駿酶液与实施例5中的保存液W-定比例混合， 超滤或10倍体积透析浓缩，使其蛋白浓度不低于0. 5mg/mL。将所得浓缩酶液室温6(TC赔 育2小时，对照组为谷氨酸脱駿酶酶液（比活为150U/mg，蛋白浓度为0. 5mg/mL)6(TC赔育 2小时；检测样品谷氨酸脱駿酶保留活性。
[0053] 实验方法2 ;将大肠杆菌谷氨酸脱駿酶液与实施例5中的保存液W-定比例混合， 超滤或10倍体积透析浓缩，使其蛋白浓度不低于0. 5mg/mL。将所得浓缩酶液室温4C保存 半年，对照组为谷氨酸脱駿酶酶液（比活为150U/mg，蛋白浓度为0. 5mg/mL)4°C保存半年； 每月检测一次样品谷氨酸脱駿酶保留活性。
[0054] 测得保存液组谷氨酸脱駿酶6(TC赔育2小时保留活性为60%，对照样品的保留活 性为21%。
[00巧]测得谷氨酸脱駿酶4C保存保留活性如下表
[0056]
【权利要求】
1. 一种谷氨酸脱羧酶的保存液，其特征在于，该保存液的成分和重量百分比或摩尔浓 度为： 50mM磷酸盐缓冲液，pH6. 0 甘油50% 乙二胺四乙酸0. 1% -1% 聚山梨酯〇. 1% _〇. 2% NaCl 50-100mM 乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二钠盐l-2mM 山梨醇5% -10% 蔗糖和或海藻糖，其中蔗糖10%-20%，海藻糖5%-10%。
2. 根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述保存液中乙二胺四乙酸的含量为 0? 1%。
3. 根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述保存液中聚山梨酯的含量为 0? 1%。
4. 根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述保存液中山梨醇的含量为7. 5%。
5. 根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述保存液中蔗糖的含量为15%。
6. 根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述保存液还包括0.01%-0.05%叠氮 钠或0. 1% -0. 2%麝香草酚。
7. 根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述保存液还包括蛋白酶抑制剂。
8. 根据权利要求7所述的保存液，其特征在于，所述蛋白酶抑制剂为抗痛素和或抑肽 酶。
9. 根据权利要求8所述的保存液，其特征在于，所述蛋白酶抑制剂抗痛素的浓度为 50 y g/mL〇
10. 根据权利要求8所述的保存液，其特征在于，所述蛋白酶抑制剂抑肽酶的浓度为 1-2 y g/mL〇
【文档编号】C12N9/88GK104357432SQ201410707603
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月27日 优先权日:2014年11月27日
【发明者】金京勋 申请人:苏州嘉禧萝生物科技有限公司