一种细胞保存液及其用途和保存细胞的方法
【专利摘要】本发明提供一种细胞保存液及其用途，另外提供一种细胞保存方法。本发明的细胞保存液以0.5g/ml至1.5g/ml的氯化钠水溶液为主要成分，其中还包含在细胞保存条件下存在的负氢离子类物质。本发明的效果在于能够使细胞例如干细胞在运输等过程中长期保持高活性率，减少细胞聚集。
【专利说明】
-种细胞保存液及其用途和保存细胞的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种保存细胞的技术，特别地涉及一种细胞保存液及其用途和保存细 胞的方法，该技术能够使细胞在运输等过程中长期保持高活性率，减少细胞聚团。
【背景技术】
[0002] 各种类型的细胞，特别是干细胞在生命科学研究、药物筛选测试、组织器官修复研 究等各领域中具有极其重要的用途。例如，间充质干细胞（MSC，Mesenchymal stem Cell) 因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益 受到人们的关注。
[0003] 然而，目前送些细胞，特别是干细胞，例如间充质干细胞在科研、工业和临床上的 应用还存在一些问题，如运输不便、临时储存不便，运输过程中细胞活性下降快，细胞容易 积聚成团等。干细胞在运输过程中需要保持良好活性，并可直接回输给患者，因此干细胞保 存液需要既能保护细胞活性，又能安全的用于人体静脉回输。现有的干细胞保存液W 0.9% 氯化钢注射液为主，另外改进的还有葡萄糖氯化钢注射液等，送些保护液对人体静脉回输 是安全的，但细胞经长时间运输后细胞活率很低，干细胞大量死亡，直接影响临床效果。
【发明内容】
[0004] 发明要解决的问颤
[0005] 本发明的目的在于提供一种细胞保存液及其用途和保存细胞的方法，W便解决现 有技术中存在的细胞经长时间运输后细胞活率低、大量死亡等技术问题。防止在运输过程 中因温度、pH、震荡等因素，细胞活性及活率将会下降。
[0006] 巧于解决问颤的方案
[0007] 为了达到上述目的，本发明的发明人意外发现：当在包含0. 5g/ml至1. 5g/ml的氯 化钢水溶液中含有负氨离子类物质时，能够使细胞，特别是干细胞在运输过程中保持高存 活率，减少细胞聚团。从而完成了本发明。
[000引具体地，本发明的一方面，提供一种细胞保存液，其包含0. 5g/ml至1. 5g/ml的氯 化钢水溶液，另外还含有负氨离子类物质。
[0009] 优选地，细胞保存液进一步包含待保存的细胞。
[0010] 在优选实施方案中，氯化钢水溶液的浓度为0. 9g/ml。
[0011] 在另外的优选实施方案中，负氨离子类物质的浓度为2(K)ppb H-至6(K)ppb H-之 间。
[001引在进一步优选的实施方案中，细胞保存液中细胞的浓度为2.0Xl05/ml至 2. 0X10*Vml 之间。
[0013] 在此外的优选实施方案中，细胞保存液中的细胞选自间充质干细胞、单个核细胞、 树突状细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞、造血干细胞、肝干细胞和脂肪干细胞组成的组中的 至少之一。特别优选选自间充质干细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞组成的组中的至少之 ο
[0014] 本发明的另一方面提供一种保存细胞的方法，其中使用本发明所述的细胞保存 液。
[0015] 本发明的其它方面提供细胞保存液在保存细胞中的用途。
[0016] 发明的效果
[0017] 本发明的细胞保存液能使细胞，例如人间充质干细胞在运输过程中保持高存活 率，有效清除自由基，减少了细胞之间及细胞与容器之间的黏附，减少临床输注人间充质干 细胞时血管内出现细胞团栓塞的可能性。本发明的细胞保存液可使细胞，例如人间充质干 细胞在4°C~1(TC时在24小时内保持高活性及减少细胞聚团，本细胞保存液将有效扩大干 细胞配送区域范围，增加临床使用人间充质干细胞的范围，所用的成分为符合临床使用的 成分，可满足临床使用人间充质干细胞及细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK)的需求。
【附图说明】
[0018] 图1为人为设定判断MSC聚集情况的标准，根据聚集程度的轻重分为四级；-、+、 ++Λ +++〇
[0019] 图2为间充质干细跑的免疫表型分析的流式结果。
[0020] 图3为CIK细跑的免疫表型分析的流式结果。
[0021] 图4间充质干细胞活性在不同保存液中细胞活性随时间的变化情况。
[0022] 图5MSC细胞在不同保存液中其数量随时间的变化。
[002引图6MSC细胞在不同保存液中其活性随时间的变化。
[0024] 图7CIK细胞在不同保存液中细胞数量随时间的变化。
[0025] 图8CIK细胞在不同保存液中细胞活性随时间的变化。
【具体实施方式】
[0026] 本申请中所述的细胞保存液W氯化钢水溶液为主要成分，同时在氯化钢水溶液中 含有负氨离子类物质。关于本发明的细胞保存液能够使细胞，特别是干细胞在运输过程中 保持高存活率，减少细胞聚团的原因，发明人认为可能在于负氨离子类物质有超强抗氧化 能力，能有效清除细胞内的自由基，从而能长时间保持细胞的高存活率，降低细胞功能衰 竭，防止细胞聚团。
[0027] 具体地，本发明的细胞保存液能够长时间保持细胞高存活率的原因可能在于，在 细胞内有多种产生自由基的途径。线粒体是内源产生自由基的主要场所，是自由基浓度最 高的细胞器，例如，在线粒体氧化磯酸化生成ATP的过程中，大约有1 %~4%的氧转化为 活性氧（reactive 0巧gen species R0巧。自由基，特别是郝些游离存在的自由基，因含有 1个或1个W上不配对电子的分子、离子、原子或原子团，在细胞内有很强的氧化反应能力， 易对蛋白质、脂质和核酸等产生伤害，从而引起细胞及机体的损伤。
[0028] 例如，生物膜易受自由基攻击而发生过氧化连锁反应，从而造成生物膜的脂质过 氧化损伤。氧自由基是机体内的主要自由基，其可引起肝细胞膜、线粒体膜、微粒体膜和溶 酶体膜发生脂质过氧化，产生LP0及其降解产物（醒类及姪类）可加重生物膜的损伤，破坏 膜的稳定性和完整性，使其通透性增加，最终导致肝细胞的坏死。此外，红细胞膜发生脂质 过氧化损伤后，通透性增加，细胞变脆，易发生溶血；当有化2\化+等存在时，线粒体膜在其 作用下，邻近的&化会分解为0H，使膜肿胀甚至消失。
[0029] 本发明的细胞保存液中除了包含能够使细胞保持最佳状态的氯化钢水溶 液外，还含有负氨离子类物质，其激活细胞内的自由基清除系统，例如大分子酶促自 由基清除系统，例如包含SOD、过氧化氨酶（catalase, CAT)、谷光甘肤过氧化物酶 (glutathioneperoxides，GSH-Px)等的自由基清除系统。另外，负氨离子类物质本身在细 胞内还可能具有与小分子抗氧化剂等非酶类清除剂相似的功能，送些小分子抗氧化剂包括 维生素 A和E、抗坏血酸、目-胡萝h素、尿酸、次氯酸、微量元素化、Se、Mn、化、化等。当脂 质过氧化反应链遇到S0D，维生素 A、E等抗氧化物后就会终止，从而能够实现长时间保持细 胞活性，防止其功能下降的目的。
[0030] 如本文中所使用的术语"氯化钢水溶液"，是指氯化钢在去离子水中溶解后得到的 水溶液。本发明中可使用任何浓度的氯化钢水溶液，只要能够保持细胞的所需的活性或功 能即可。优选地，所述浓度可为0. 5g/ml至1. 5g/ml，优选0. 6g/ml至1. Og/ml，从保持细 胞与周围环境等渗性的观点，在人细胞的情况下特别优选氯化钢水溶液的浓度为0. 9g/ml。 本文中，本领域内已知氯化钢的浓度单位g/ml也可表示为％，在本文中两种单位可互换使 用，而没有任何区别。另外，需要说明的是0. 9g/ml氯化钢水溶液在本领域内通常还称作生 理盐水。
[0031] 如本文中所使用的术语"负氨离子类物质"，是指负氨离子W及能够在细胞保存条 件下，例如0至4°C温度下产生负氨离子的任何物质。负氨离子也可表示为H-，是指形成带 一个单位负电荷的阴离子氨，也称为氨负离子或氨化物离子。本发明可使用任何形式的负 氨离子类物质，例如商购可得的含有负氨离子类物质的水溶液或通过已知设备例如中国专 利申请号为CN201320780513. X中所述的装置，依据其说明书制备的负氨离子类物质。
[0032] 另外，本发明的细胞保存液中负氨离子的浓度没有任何限定，然而，从细胞保存效 果方面考虑，优选lOOppb H-至lOOOppb H-，特别优选150ppb H-至SOOppb H-，最优选 2(K)ppb H-至6(K)ppb H-。本发明中的负氨离子的浓度可通过本领域内公知的测量手段测 得。例如通过已知设备例如"便携式溶存水素计"（一夕溶存水素计化NH-1000,根 据其说明书记载的标准操作步骤测得。
[0033] 如本文所使用的术语"细胞"，具有本领域内公知的含义，包含任何类型或来源的 细胞。本文中优选动物细胞，例如，鸟类细胞、哺乳动物细胞，特别优选人细胞，特别优选人 干细胞，例如，人间充质干细胞、人单个核细胞、人树突状细胞、人细胞因子诱导的杀伤细 胞、人造血干细胞、人肝干细胞和人脂肪干细胞，最优选人间充质干细胞和细胞因子诱导的 杀伤细胞。另外，本发明的细胞可W是直接来源于组织、器官等的天然细胞，也可W是培养 细胞，例如，在培养基条件下培养的细胞。此外，还可W是人工处理的细胞，例如杂交瘤细胞 等。
[0034] 如本文所使用的术语"细胞活性"是指细胞发挥其正常功能所需的性质、性能等， 并且可通过测量或观察而确定。本发明的细胞保存液中可使用上述细胞中的任一种或多种 的组合。
[0035] 另外，本发明的细胞保存液中的细胞浓度不特别限定，然而如果细胞浓度过低，贝U 会不利地影响保存效率，浪费保存液。另一方面，如果细胞浓度过高，则会可能会影响到细 胞的实际使用，在细胞使用时引起额外的操作步骤。从保存液中保存的细胞直接使用，例 女口，直接输回体内，例如活体内的观点，所述细胞浓度可为1. 0 X l〇3/ml至1. 0 X 1〇1%1， 优选1. 0X l〇4/ml至1. 0X lOVml，在直接输回人体的情况下，特别优选1. 0X l〇5/ml至 1. 0 X lOVml，最优选2. 0 X lOVml至2. 0 X lOVml。关于细胞浓度单位，除非另有说明，则否 指个/ml。例如1.0Xl〇3时，指每ml液体中细胞的个数为1.0Xl〇3个。
[0036] 关于细胞浓度的测定方法，可使用例如Countess自动细胞计数仪通过台盼藍对 死细胞进行染色，结合图像分析技术，测量细胞存活率和细胞计数。具体操作可参见其使用 说明书，包括将细胞样本与台盼藍混合，滴加于Countess细胞计数板内。相机将采集细胞 计数板上的细胞图像，图像分析软件则自动对其进行分析，通过台盼藍染料检测细胞数量 和存活率。另外，本计数仪还可提供下列数据：活细胞浓度/mU死细胞浓度/1^，总的细胞 浓度/mU存活率（活细胞数与全部细胞数的百分比），平均直径，细胞图像图示数据。
[0037] 下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不作为对本发明的 限制。另外，需要说明的是，除非另作说明，否则本文中使用的实验材料、试剂、仪器、计数方 法等一般方法均在本领域内通常使用的手段。
[003引实验例1本发明的细胞保存液的配制 [00測试验步骤
[0040] 1. 0. 9 %含负Η离子生理盐水配制；无菌环境下取100ml 3 %化C1，用适宜量负Η 离子水（本实验室根据说明书中所述装置自制）稀释至0.9%，定容。
[0041] 2.将定容好的含负Η离子水进行革兰氏检测，内毒素检测，无菌、支原体检测，确 认没有内毒素、无菌和支原体污染。
[0042] 实验例2细胞保存液中负氨离子浓度的选择化OOppb H-，400ppb H-，200ppb Η-)
[0043] 1.根据上述实验例1中所述的方法，分别配制负氨离子浓度分别为6(K)ppb Η-， 400ppb H-，200ppb Η-的细胞保存液。
[0044] 2.MSC、CIK细胞的制备
[0045] 本实验中使用的MSC、CIK(本实验室由厮带组织制备的间充质干细胞、厮血来源 的细胞因子诱导的杀伤性T细胞）。另外，本文中PBS具有本领域内的通常的含义，本实验 例中 PBS 的组成优选为 KC10. 2g/L ;皿2口〇4〇. 2g/L ;NaC18g/L ;胞2册〇41. 15g/L ;化7. 2-7. 4 ; 渗透压275+15。
[0046] 1)收集培养的MSCXIK细胞，调整细胞密度至IXlOVml。吸出培养液，往培养瓶 内加入5ml PBS液，轻轻晃动，弃PBS。
[0047] 2)加入膜酶（迈晨科技，货号；CC012)2ml，37°C 3min，或者室温，显微镜观察细胞 全部悬浮，加入F002(国产血清来自Solarbio,货号；f8260,）0. 5ml，终止消化。
[0048] 3)吸取细胞悬液放入15ml离必管，加入7. 5ml PBS洗涂培养瓶，收集洗涂液至 15ml离必管中，离必1000;rpm5min。
[004引 4)离必后，弃上清，加入PBS液10ml，重悬细胞，1000巧m5min洗涂细胞。
[0050] 5)离必后，弃上清，加入PBS液10ml，重悬细胞，100化pm5min洗涂细胞。
[0051] 6)离必后，弃上清，加入PBS液10ml，重悬细胞吸取一滴细胞计数，离必1000巧m 5min洗涂细胞。
[0052] 7)弃PBS液，加入上述配制的负氨离子浓度为-600, -400, -200的细胞保存液，W 使MSC、CIK的细胞浓度和活性率相同。
[0053] 8)将上述制备的细胞置于4°C冷藏箱保存。分别在比、2}1、地、6}1、化后计数活细胞 的数量（Countes细胞计数仪，型号；C10281，测出细胞数量值），并检测细胞活性（Countes 细胞计数仪，型号；C10281，测出细胞活性）。
[0054] 不同保存液中活细胞的变化情况如下表1所示。
[00巧]表1.负氨离子浓度的选择
[0056]
[005引 表1 (续）
[0060]
[0061] 注；每次样本的活性检测都是取少量样本在计数板上再上机检测，检测时只计算 该次样本的活细胞浓度与总细胞浓度，再然后获得细胞活性等数据，所W每次测量时都只 和该次样本本身比较，得出相应数据。
[0062] 如表1所示，在负氨离子浓度为200ppb H-、400ppb H-和eOOppb H-的情况下，活 细胞的存活率W及细胞活性均表现良好。
[0063] 实验例3本发明的细胞水溶液对不同浓度的厮带间充质干细胞及CIK细胞活性的 影响。
[0064] 选用负氨离子浓度为6(K)ppb H-的生理盐水作为本实验中使用的细胞保存液，并 选用不含负氨离子的生理盐水作为对照，分析本发明的细胞保存液对不同细胞浓度的影 响。具体结果如下表2所示。
[0065] 表2.细胞保存液对不同细胞浓度的影响。
[0066]
[006引 表2 (续） [0070]
[0071] 如表2所示，细胞保存液无论是对不同浓度的CIK还是对不同浓度的MSC细胞均 显示出优异的存活率。而当与相同条件下但不含负氨离子的生理盐水相比较时，本发明的 细胞保存液显示出明显更加优异的存活率。
[0072] 实验例4负氨离子生理盐水对厮带间充质干细胞及CIK细胞聚集的影响。
[0073] 具体实验步骤如下：
[0074] 1.含细胞的保存液的制备
[00巧]1)收集MSCXIK细胞，调整细胞密度至lOVml。吸出培养液，往培养瓶内加入5ml PBS液，轻轻晃动，弃PBS。
[0076] 2)加入膜酶（迈晨科技，货号；CC012)2ml，37°C 3min，或者室温，显微镜观察细胞 全部悬浮，加入F002(Solarbio,货号；f8260)0. 5ml，终止消化。
[0077] 3)吸取细胞悬液放入15ml离必管，加入7. 5ml PBS洗涂培养瓶，收集洗涂液至 15ml离必管中，离必lOOOrpm 5min〇
[0078] 4)离必后，弃上清，加入PBS液10ml，重悬细胞，100化pm 5min洗涂细胞。
[0079] 5)离必后，弃上清，加入PBS液10ml，重悬细胞，100化pm 5min洗涂细胞。
[0080] 6)离必后，弃上清，加入PBS液10ml，重悬细胞吸取一滴细胞计数，离必1000巧m 5min洗涂细胞。
[0081] 7)弃PBS液，根据所需细胞浓度加入适量实验例1中制备的细胞保存液，PBS溶液 或0. 9 %生理盐水，并轻轻混匀。
[0082] 2.细胞聚集情况的观察
[0083] 将上述1中制备的细胞置于4°C冷藏箱保存。分别在比、211、地、6}1、化和12}1后观 测细胞聚集情况。
[0084] 细胞聚集情况的分析基于W下标准，即当在放大X40倍的显微镜（奧林己斯，货 号CKX-41)下观察时，在10 μ mX 10 μ m视野中计数出现5个W上的细胞连接到一起的聚集 情况，其中：
[0085] 表示没有观察到细胞聚集成团。
[008引 +;表示观察到1个W上至2个W下的细胞聚团。
[0087] ++;表示观察到3个W上至5个W下的细胞聚集成团。
[0088] +++;表示观察到大于5个细胞聚集成团。
[0089] 结果如下表3所示。
[0090] 表3.细胞聚集情况
[0091]
[0092] 由表3可W看出当使用不含负氨离子的生理盐水时，随着时间的推移，细胞出现 聚集情况，MSC细胞甚至当两小时时开始出现较为严重的聚集。另一方面，在本发明的细胞 保存液的情况中，无论是CIK细胞还是MSC细胞甚至在12小时后也未出现细胞聚集现象。 上述结果表明，本发明的细胞保存液具有优异的抑制细胞聚集的效果。
[0093] 实验例5细胞表型流式分析
[0094] 为了分析本发明的细胞保存液对细胞功能的影响，本实验采用表型流式分析来验 证细胞特异性的标记，进而说明细胞是否具有良好的成熟度，是否可W发挥相关的功能。
[0095] 具体步骤如下：
[0096] 1.人厮带间充质干细胞的分离、培养及表型鉴定。
[0097] (1)在体外，将人厮带用磯酸缓冲液（PB巧反复冲洗，去除残留的血液，剪碎至约 1mm3的小块，加入原料重量0. 1 %的胶原酶（sigma, USA)，37°C消化45分钟；
[009引 似加入原料重量0. 125 %的膜酶（Sigma, USA) 37°C消化45分钟，在消化过程中 用转子揽拌，加入适量的血清终止膜酶的作用；
[009引 做消化液用筛网过滤，先后用100目及200目的滤网过滤，去除未消化的组织；
[0100] (4)将过滤后的消化液用磯酸缓冲液稀释，消化液与磯酸缓冲液比例为1 : 10 ;
[0101] (5)离必，获得细胞，离必机的转速为1500rpm/min离必20min，获得细胞；
[0102] (6)细胞按1~2Xl〇3cm2接种于培养瓶中，用含DMEM-LG/F12培养基（Sigma， 肥八)，5%胎牛血清（。〔5)佑比(3〇6化，肥4)的培养基，置371：，5%0)2培养箱培养，4-5天 后换液，弃去非贴壁细胞，W后每3-4天半量换液。待细胞80 %融合，0. 25 %膜酶消化，按 1 : 3传代。
[0103] (7)贴壁细胞常规消化后W FITC标记的CD14、CD34、CD44、CD45和HLA DR，阳标 记的〔019、〔090、〔073、〔0105，抗体及其相应同型对照标记细胞，流式细胞仪（。4〔4 0曰1比11' 型，USA)检测。W上英光标记抗体均购自抓公司扣SA)。
[0104] 2.间充质干细胞及CIK细胞在保存液中保存24小时后免疫表型分析。具体步骤 如下：
[0105] 1)每管加入一定量抗体（如抗体带有英光标记，则需避光操作），对照管内加同型 对照抗体。4°c，赔育30min，此步开始避光操作。
[0106] 2)每管加1血磯酸缓冲液（PB巧洗涂2遍，每次离必；100化pm, 5min。
[0107] 5)加流式固定液重悬细胞，200ul/管。4°C避光可W保存1周。
[010引 6)测试前转移到流式检测管内（避光保存）。
[0109] 5)上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）。
[0110] 6)报告结果。
[0111] 3.实验结果：
[0112] 结果如图3所示。厮带间充质干细胞的流式免疫表型检测结果显示；厮带间充质 干细胞高表达 CD90、CD44、CD73 和 CD105,不表达 CD14、D：M、CD：M、CD19 和 HLA-DR。而 CD90、 CD44、CD73和CD105表明细胞具有高的成熟度。
[0113] 另外，根据图4也可明显看出CIK细胞也具有高成熟度。
[0114] 实验例6细胞保存液对细胞活性和活细胞保持率的影响
[0115] 为了分析本发明的细胞保存液对细胞活性和活细胞保持率的影响，而进行了本实 验。
[0116] 实验步骤：具体操作和实验设计参见上述实验例1-至3。实验条件如图4-8中的 表格所示。
[0117] 实验结果：
[0118] 如图4-8的所示。由图4-8可W看出，本发明的细胞保存液与PBS或不含负氨离 子的生理盐水相比均表现出显著优异的细胞活性和细胞存活率。
[0119] 实验例7本发明的细胞保存液与其它保存液（PBS/生理盐水等）的保存细胞的效 果比较
[0120] 具体操作步骤如实验例1-3所示。
[0121] 具体实验条件及实验结果如下表4和5所示。
[0122] 表4.间充质干细胞的活细胞数量随时间的变化情况
[0123]
[0124] 表5. CIK细胞活细胞数量随时间的变化情况
[0125]
[0126] 尽管参考其具体实施方案已详细描述本发明，但是对于本领域熟练技术人员来 说，其中在不偏离本发明的精神和范围的情况下进行各种改变和改进将是显而易见的。
【主权项】
1. 一种细胞保存液，其包含0. 5g/ml至I. 5g/ml的氯化钠水溶液，其特征在于还包含在 细胞保存条件下存在的负氢离子类物质。2. 根据权利要求1所述的细胞保存液，其中所述细胞保存液进一步包含要保存的细 胞。3. 根据权利要求1或2所述的细胞保存液，其中所述氯化钠水溶液的浓度为0. 9g/ml。4. 根据权利要求1或2所述的细胞保存液，其中所述负氢离子类物质的浓度为200ppb H-至 600ppb H-之间。5. 根据权利要求2或3所述的细胞保存液，其中所述细胞保存液中细胞的浓度为 2. 0 X 105/ml 至 2. 0 X IOfVml 之间。6. 根据权利要求2或3所述的细胞保存液，其中所述细胞保存液中的细胞选自间充质 干细胞、单个核细胞、树突状细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞、造血干细胞、肝干细胞和脂肪 干细胞组成的组中的至少之一。7. 根据权利要求2或3所述的细胞保存液，其中所述细胞保存液中的细胞选自间充质 干细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞组成的组中的至少之一。8. -种保存细胞的方法，其中使用权利要求1至7中任一项所述的细胞保存液。9. 根据权利要求1至7任一项所述的细胞保存液在保存细胞中的用途。
【文档编号】A01N1/02GK105875588SQ201410587471
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年10月29日
【发明人】王亚军, 杜静, 冯志磊, 吴瑜瑜, 田利明
【申请人】达国际生物科技(北京)有限公司, 一达国际生物科技(北京)有限公司