液氮直入式细胞程序降温盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种液氮直入式细胞程序降温盒，属于生物医学【技术领域】。该装置包括盒身和盒盖，盒身内设置有多个管槽，盒体外层主体材料采用304不锈钢，盒体内密封件采用硅胶，管槽采用白色高密度聚乙烯材料；管槽内部填充物采用泡沫塑料。具体制作工艺为，盒体外层为不锈钢无尾真空主体，在近1000℃条件下对304不锈钢进行抽真空和封焊而制成，盒身与盒盖通过螺纹密合，并在盒盖上加了硅胶密封圈，防止液氮的渗入。本发明具有三大优势：（1）可以直接降温到-196℃，不用转移细胞，适合长期冻存细胞；（2）无需异丙醇，属于无损耗永久使用品；（3）分层设计，即使短暂取(30min)出都可以保证细胞温度低于-80℃。
【专利说明】液氮直入式细胞程序降温盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种液氮直入式细胞程序降温盒，属于生物医学【技术领域】。
【背景技术】 [0002]在生物【技术领域】，在低于_70°C的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。因此，采取适当的方法将生物材料降至超低温，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。当以适当的方法将冻存的生物材料恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复正常。所谓冷冻保存，就是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度(一般是低于-70°C的超低温条件，_196°C可以长期保存)，并在此温度下对其长期保存的过程。微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当条件下复苏。水在低于零度的条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯水中，随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的降低，细胞外部的水分会首先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏，细胞便发生渗漏，在复温时，大量水分会因此进入细胞内，造成细胞死亡。这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤。当温度进一步下降，细胞内外都结冰，产生冰晶损伤。但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温条件下保存。
[0003]液氮温度(_196°C)是目前最佳的冷冻保存温度。在_196°C时，细胞的生命活动几乎完全停止，但复苏后细胞的结构和功能完好。如果冷冻过程得当，一般生物样品在_196°C下均可保存十年以上。
[0004]冷冻速率是指降温的速度，直接关系到冷冻效果。细胞在冷冻过程中会发生如下变化:当细胞被冷至_5°C时，因溶液中加有冷冻保护剂而降低溶液的冰点，细胞内外溶液仍未结冰；当被冷至-5~_15°C之间时，细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态。细胞内未结冰的水分子会比细胞外部分结冰溶液中的水分子具有更高的化学能。其结果是，细胞内水分子为了和细胞外水分子保持化学能的平衡，会向细胞外流动。冷冻速度不同，细胞内水分向外流动的情况也不相同:如果冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，细胞内溶质浓度增高，细胞内不会发生结冰；如果冷冻速度快，细胞内水分没有足够的时间外渗，结果随着温度的下降而发生细胞内结冰；如果冷冻速度非常快(即超快速冷冻)，则细胞内形成的冰晶非常小或不结冰而呈玻璃状态(玻璃化冷冻)。Luyet (1973)证实液体的凝固可分为两种形式:一种是晶体化，溶液中的分子呈有序排列；另一种情况是非晶体即玻璃化，液体中的分子呈无序状态，保持未凝固前的状态。不同的冷冻速度既然能使细胞内发生不同的生理变化，也可以对细胞产生不同的损伤。当冷冻速度过慢时，细胞脱水严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活性。同时冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶质损伤。当冷冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成较到冰晶，造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤。超快速玻璃化冷冻对细胞存活来说是最为理想的冷冻方法。细胞内外呈玻璃化凝固，无冰晶形成或形成很小的冰晶，对细胞膜和细胞器不致造成损伤，细胞也不会在高浓度的溶质中长时间暴露而受损。
[0005]不同细胞的最适冷冻速率不同。小鼠骨髓干细胞、酵母、人红细胞的最适冷冻速率分别为1.60C min、7°C /min和200°C /min。细胞与细胞之间的最适冷冻速率可在1.6°C~3000C /min，故对一种细胞进行冷冻保存之前，首先需要测定其最适冷冻速率，以保证获得最高的冷冻存活率。
[0006]目前，市场上已有的主流程序降温盒，或称细胞冻存盒或称梯度降温冻存盒，是由美国Nalgene公司生产的5100-0001，属于进口品牌类产品。该程序降温盒或称细胞冻存盒为成功冷冻保存细胞提供精确和良好重复性的冷却率:_1°C /min的冷冻率降温到_80°C。属于耗材类，需要加入药品异丙醇，异丙醇属于挥发耗材。可以冻存18管细胞。且只能冷冻到-80°C，如转移到液氮细胞会有一定影响。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种液氮直入式细胞程序降温盒，以便采用合理的冻存盒材料和特殊的结构，保证合适的降温曲线。
[0008]为了实现上述目的，本发明的技术方案如下。
[0009]一种液氮直入式细胞程序降温盒，包括盒身和盒盖，盒身内设置有多个管槽，其中，盒体外层主体材料采用304不锈钢，盒体内密封件采用硅胶，管槽采用白色高密度聚乙烯材料；管槽内部填充物采用泡沫塑料。
[0010]上述液氮直入式细胞程序降温盒的具体制作工艺为，盒体外层为不锈钢无尾真空主体，在近1000°C条件下对304不锈钢进行抽真空和封焊而制成，盒身与盒盖通过螺纹密合，并在盒盖上加了硅胶密封圈，能有效的防止液氮的渗入。
[0011]该发明的有益效果在于:本发明具有三大优势:(I)可以直接降温到-196°C，不用转移，适合长期冻存细胞；(2)无需异丙醇，属于无损耗永久使用品；(3)分层设计，即使短暂取(30min)出都可以保证细胞温度低于_80°C。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1是本发明实施例中降温盒结构截面图。
[0013]图2是本发明实施例中降温盒结构俯视图。
[0014]图3是本发明实施例中降温盒降温曲线图。
[0015]图4是本发明实施例中使用本发明装置细胞复苏后Ins-1细胞系存活率对比图。
[0016]图5是本发明实施例中使用本发明装置细胞复苏后Cos-7细胞系存活率对比图。
[0017]图中标记说明:1、盒盖；2、盒身；3、盒体外层；4、管槽；5、螺纹。【具体实施方式】[0018]下面结合附图和实施例对本发明的【具体实施方式】进行描述，以便更好的理解本发明。
实施例[0019]如图1、图2所示的液氮直入式细胞程序降温盒，包括盒身2和盒盖1，盒身2内设置有多个管槽4，盒体外层3主体材料采用304不锈钢，盒体内密封件采用硅胶，管槽4采用白色高密度聚乙烯材料；填充物采用泡沫塑料。上述液氮直入式细胞程序降温盒的具体制作工艺为，盒体外层3为不锈钢无尾真空主体，在近1000°C条件下对304不锈钢进行抽真空和封焊而制成，盒身2与盒盖I通过螺纹5密合，并在盒盖I上加了硅胶密封圈，能有效的防止液氮的渗入。管槽4部分材料为白色高密度聚乙烯，内部填充的泡沫塑料质轻保温性较好。[0020]图3是采用本降温盒测试所得的降温曲线(重复了 5次的结果)。除了少数细胞冻存需要超速冷冻，大多数细胞冻存的关键在于细胞在20°C到-80°C下降呈线性关系，并且降温速度在1-10°C /min。本实施例中，细胞在20°C到_80°C下降呈线性关系大约是2.6-2.7°C/min的降温速度。符合多数细胞的冻存要求。采用用液氮低温探头在降温盒子内部测得的在液氮中，从室温能降到液氮温度(_196°C左右)，如图3所示。[0021]下面可以继续举例采用本装置所取得的试验效果，具体试验过程及结果如下:
(一)细胞培养:
1、培养基(4°C保存，使用前在37°C水浴中温育):
INS-1 细胞系:1) RPMI 1640 (含有 IlmM 的 D-glucose) ;2) Fetal Bovine Serum(灭活)+10ml ；3) Sodium Pyruvate (lOOmM,使细胞增加内源性CO2的产生)加入1% ；4)β -Mercaptoethanol (自由基的清除剂)加入0.1% ；
C0S7细胞系:标准的DMEM完全培养基，加入10%血清及1%的青霉素-链霉素双抗；
2、Poly-L-Lydine:0.01mg/ml ；
3、0.25% Trypsin-EDTA (胰酶)(一 20°C保存，使用前在室温自然溶解)；
4、磷酸缓冲盐溶液(PBS)(4°C保存，使用前在37°C水浴中温育)；
137mmol/L NaCl (8g) ；2.7mmol/L KCl (0.2g) ; IOmmo 1/L Na2HPO4 (1.44g)；2mmol/L KH2PO4 (0.24g);在IL三蒸水中加入四种成分，调pH 7.4，渗透压300m0sm,过滤保存。[0022](二)细胞冻存:
1、冻存液:7%DMS0；13% FBS血清；80%培养基；液氮直入式细胞程序降温盒；Nalgene5100-0001程序降温盒:加入250ml异丙醇；
2、材料:
(1)生长良好的培养细胞；
(2)新鲜培养基；
(3)DMSO (Sigma D-2650)；
(4)无菌塑料冷冻保存管(Nalgene5000-0020)；
(5)0.4% w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)；(6)血球计数盘与盖玻片；
(7)等速降温机(KRYO10 Series II)；
3、步骤:
(1)冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。
[0023](2)冻存开始将培养瓶中的原液倒掉，用5mlPBS洗2次。
[0024](3)加入Iml胰酶，放在37°C细胞培养箱里消化细胞，加入5ml细胞培养液终止消化，并将其完全吸入15ml离心管中；
(4) 15ml离心管离心1000rpm.5min.弃上清，加入IOml冷冻保存溶液，使细胞浓度控制为1-5 X 106 cells/ml,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中，I ml/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测。
[0025](5)传统冷冻保存方法:用Nalgene公司生产的5100-0001程序降温盒降温到_80°C，在手动转移到液氮中保存。
[0026](6)本实施例中的冷冻方法(新方法):用液氮直入式细胞程序降温盒直接冻存。
[0027]如图4、图5所示的细胞复苏后Ins-1和Cos-7细胞系存活率对比图(重复了 5次的结果)，本发明所采用的方法比传统的方法更有效率，存活率更高。
[0028]以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种液氮直入式细胞程序降温盒，包括盒身和盒盖，盒身内设置有多个管槽，其特征在于:所述盒体外层主体材料采用304不锈钢，所述盒体内密封件采用硅胶，所述管槽采用白色高密度聚乙烯材料；所述管槽内部填充物采用泡沫塑料。
2.根据权利要求1所述的液氮直入式细胞程序降温盒，其特征在于:所述降温盒的具体制作工艺为，盒体外层为不锈钢无尾真空主体，在近1000°C条件下对304不锈钢进行抽真空和封焊而制成，盒身与盒盖通过螺纹密合，并在盒盖上加了硅胶密封圈，防止液氮的渗入。
【文档编号】A01N1/02GK103548815SQ201310576212
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月18日 优先权日:2013年11月18日
【发明者】王意, 胡丽丹 申请人:王意