专利名称：一种临床用干细胞保存液的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，特别涉及一种临床用干细胞保存液。
背景技术：
近年来，干细胞的研究进展迅速，干细胞的功用正日益受到生命科学的重视，已经 显示出其在生命科学多个领域的广泛应用前景。干细胞疗法也日益广泛的应用于临床治 疗，便应运而生了一种新的医学治疗技术，即干细胞技术；目前干细胞技术已在心血管系统 疾病、神经系统疾病、肌肉骨骼相关疾病、糖尿病等多种疾病的治疗中取得了令人振奋的效 果，展示了广阔的临床应用前景。然而，干细胞不同于普通的生物制品和药品，它是具有生命活性的生命最基本单 位，在干细胞的广泛应用过程中，干细胞活性的保存，简称干细胞的保存是一个重要的挑 战。用生理盐水保存干细胞10小时之内干细胞的活性丧失就达到30%之多。目前的研究 表明，干细胞可以用一种冻存液在零下100多度中长期保存几十年，复苏后仍保持其良好 的活性状态、干细胞特征及功能，该种保存液的主要成分是血清和二甲基亚砜(DMSO)，然而 DMSO具有细胞毒性，与蛋白质疏水集团发生作用，导致蛋白质变性，具有血管毒性和肝肾毒 性，如果低温保存的细胞复苏后直接医用，过多的DMSO对人体具有毒性，并且这种传统的 冻存液要求在超低温下保存，移植前需要复苏等过程，给应用带来很多不便。因此，处于干 细胞移植的安全性及方便性考虑，急需研究出一种新的安全方便的干细胞的保存液，保证 其更能接近细胞的体内生存微环境，包括渗透压、PH值及营养物质等。
发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种维持干细胞活性、无毒副作用的临 床用干细胞保存液。本发明是通过如下技术方案实现的一种临床用干细胞保存液，其特征在于所述保存液主要由人病毒灭活血浆和氨 基酸组成，其中血浆的浓度为50 100%。本发明利用血浆本身蛋白丰富、渗透压及酸碱度接近干细胞体内生存微环境等特 点，将其作为干细胞保存液。人血浆作为血液的重要组成成分，主要由水分、蛋白及无机盐构成，水分占90 92%，血浆中含有多种蛋白，总称为血浆蛋白，是构成血浆的主要溶质成分，以维持血浆胶 体渗透压，组成血液缓冲体系，参与维持血液酸碱平衡，运输营养和代谢物质，血浆蛋白质 为亲水胶体，许多难溶于水的物质与其结合变为易溶于水的物质；血浆蛋白分解产生的氨 基酸可用于合成组织蛋白质或氧化分解供应能量，参与凝血和免疫作用等；血浆的无机盐 主要以离子状态存在，正负离子总量相等，保持电中性，这些离子在维持血浆渗透压、酸碱 平衡以及神经-肌肉的正常兴奋性等方面起着重要作用；血浆就相当于结缔组织的细胞间 质，为体内细胞的存活、增殖及其他的新陈代谢活动提供了一种理想的生存内环境。
本发明的更优方案为所述血浆保存液中添加有氨基酸，氨基酸浓度为1%。氨基酸是构成生物体蛋白质的最基本单位，是生命机体的重要物质基础，每一个 细胞的重要组成部分都有氨基酸的参与，所以氨基酸与生物的生命活动有着密切的关系， 细胞的一切生命活动都需要氨基酸的参与，包括细胞的存活、增殖等等。通过实验表明，随着血浆浓度的升高，细胞活性降低幅度也逐渐减小，所以为了更 长时间的保存细胞活性，所述血浆的浓度为100%。所述保存液在保存干细胞时置于4°C的环境下放置，而无需超低温保存。本发明可直接用于临床，能够较长时间的维持干细胞的活性，无毒副作用，并且无 需超低温保存，适于广泛推广应用。
图1为不同血浆浓度对干细胞活度的影响示意图；图2为氨基酸和碳酸氢钠对干细胞活度的影响示意图。
具体实施例方式实施例1.所需试剂人病毒灭活血浆、复方氨基酸、碳酸氢钠注射液、台盼蓝2.五种血浆浓度的保存液的配制将病毒灭活血浆和生理盐水按体积比，分别配 制成100%血浆保存液、70%血浆保存液(血浆生理盐水=7 3)、50%血浆保存液(血 浆生理盐水=5 5)、20%血浆保存液(血浆生理盐水=2 8)、100%生理盐水。3.临床用干细胞的制备及活度检测选择第三代的干细胞，细胞达到80%汇合时，消化制备成单个细胞，并清洗掉细胞 培养基等非临床用试剂，台盼蓝染色其存活度为96. 0%。4.干细胞的保存按照1 2X107ml的浓度，分别用上述保存液悬浮离心沉淀的 干细胞，混勻制备成悬液储存于无菌保存管内置于4°C保存。5.不同时间段细胞活度的测定分别于保存后1天04小时)、2天、3天、4天、5 天、6天、7天台盼蓝染色检测干细胞活率。6.染色步骤取100 μ 1干细胞悬液移入EP管中，加50 μ 1 0.4%台盼蓝溶液，混 勻，5分钟后，用计数板分别计数活细胞和死细胞数。镜下观察，死细胞被染成蓝色，而活细 胞拒染。根据下式求细胞活力活细胞率(％ )=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)*100重复上述实验3次，结果如下表100%血浆、70%血浆和50%血浆三组对干细胞 活性的保持率远远高于20%血浆组和生理盐水组，特别是随着保存时间的延长，差异更加 显著，生理盐水在1天( 小时)后，干细胞的存活率就已经降到70%以下，已经达不到干 细胞医用要求。100%血浆、70%血浆和50%血浆三组中干细胞的活性持续3天还能保持 85 %的活性，并且比较100 %血浆、70 %血浆和50 %血浆三组干细胞活性随时间变化情况， 结果表明随着血浆浓度的升高细胞活性降低幅度也逐渐减小，所以为了更长时间的保存细 胞活性，应选择高浓度的血浆保存液100%血浆。
7.血浆保存液添加氨基酸或碳酸氢钠对细胞活性的影响分别向100%血浆保存液中添加的氨基酸或的碳酸氢钠，并按同样的细胞 浓度和保存程序保存细胞，按同样的方法检测不同时间段细胞的活性，结果如下表在前4 天内各组保存液中干细胞的存活率类似，从第5天开始添加氨基酸一组(84. 5%)细胞活度 开始高于纯血浆组(82.4%)，并随着时间的延长差异逐渐增大。所以添加氨基酸对于细胞 的长期保存更益。而对于添加碳酸氢钠一组，前4天内各组保存液中干细胞的存活率类似， 从第5天开始，干细胞存活率急剧下降，明显低于其他两组，表明碳酸氢钠对于干细胞的长 期保存不利。所以为了更长期保存干细胞的活性选用添加氨基酸的100%血浆。碳酸氢钠俗称“小苏打”，弱碱，内服后能迅速中和胃酸，其抗酸作用弱而短暂，此 外尚有碱化液的作用，其注射液对于维持血浆晶体渗透压、酸碱平衡起着重要作用，因此， 将其与氨基酸对比应用，比较两者的使用优劣性。
权利要求
1.一种临床用干细胞保存液，其特征在于所述保存液主要由人病毒灭活血浆和氨基 酸按体积比组成，其中血浆的浓度为50 100%。
2.根据权利要求1所述的临床用干细胞保存液，其特征在于所述血浆保存液中添加 有氨基酸，氨基酸浓度为1%。
3.根据权利要求1或2所述的临床用干细胞保存液，其特征在于所述血浆的浓度为 100%。
4.根据权利要求1或2所述的临床用干细胞保存液，其特征在于所述保存液在保存 干细胞时置于4°C的环境下放置。
全文摘要
本发明属于生物医学领域，特别涉及一种临床用干细胞保存液。该临床用干细胞保存液，其特征在于所述保存液主要由人病毒灭活血浆和氨基酸按体积比组成，其中血浆的浓度为50～100％。本发明可直接用于临床，能够较长时间的维持干细胞的活性，无毒副作用，并且无需超低温保存，适于广泛推广应用。
文档编号A01N1/02GK102138553SQ20101061576
公开日2011年8月3日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者刁晓娟, 孙涛, 孙理兰, 张慧慧, 李荣荣, 王泰华 申请人:王泰华