启动子BgIosP545、制备方法及应用的制作方法

专利名称：启动子BgIosP545、制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种启动子BgIosPM5，含有该启动子 的核酸构建体、载体、重组细胞、植物愈伤组织，该启动子的制备方法以及利用该启动子来 调控植物中基因表达的方法。
背景技术：
启动子是基因的一个组成部分，通常位于结构基因5’端上游，是RNA聚合酶识别、 结合和开始转录的一段DNA序列。启动子能够指导全酶(holoenzyme)同模板正确结合，活 化RNA聚合酶，启动基因转录，从而控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。在转 基因植物中，启动子是影响转基因表达效率的重要因素之一，选择高效率的启动子是高效 率表达外源基因的关键。根据启动子的转录模式可将其分为3类组成型启动子、组织或器官特异性启动 子和诱导型启动子。所谓组成型启动子是指在组成型启动子调控下，不同组织器官和发育 阶段的基因表达没有明显差异，因而称之组成型启动子。双子叶植物中最常使用的组成型 启动子是花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子。另一种高效的组成型启动子CsVMV是从木薯 叶脉花叶病毒(cassava vein mosaic virus)中分离的。人们高度重视从植物本身克隆组成型启动子。例如肌动蛋白(actin)和泛素 (ubiquitin)等基因的启动子已被克隆。用这些启动子代替CaMV 35S启动子，可以更有效 地在单子叶植物中驱动外源基因的转录。Naomi等分别从拟南芥的色氨酸合酶β亚基基因 和植物光敏色素基因中克隆了相应启动子，用其代替CaMV 35S启动子，在转基因烟草中也 取得了很好的表达效果(Plant biotechnology, 2002,19(1) :19-26)。单子叶植物基因中常见的启动子有山bi启动子(Plant ubiquitin promoter)、Actin 启动子(Plant Actin promoter)禾口 Adh-1 启动子(Maize alcohol dehydrogenaselpromoter)。Ubi启动子以其启动效率高、甲基化程度低、遗传性状稳定等因素而倍受青睐。目 前，已经从很多泛素基因中分离得到启动子序列，包括玉米基因组中的WDi-I启动子、水稻 泛素RUBQ2启动子、拟南芥泛素启动子、向日葵泛素WdBI启动子、烟草泛素Ubi. U4启动子、 马铃薯泛素证丨7启动子、番茄泛素W^il-I启动子，大麦泛素Mubl启动子。玉米泛素W^i-I 启动子已经广泛地应用于玉米、小麦、水稻等单子叶植物中，水稻泛素RUBQ2启动子在水稻 和甘蔗中也有较多的应用。Actin启动子1990年由康奈尔大学的McElroy等首次在水稻中发现，属于强组成 型启动子。Actin启动子在单子叶禾本科中作用显著，但是邻近科属的植物中的基因调控功 能却十分不理想。因此，许多相关研究通过其他单子叶植物寻找Actin启动子，并成功在香 蕉、甜瓜、玉米和拟南芥中陆续发现。Actin启动子由于对基因表达的强调控作用，在单子叶 植物优良性状的转基因中已经得到越来越广泛的应用。Adh-I启动子调控乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase)基因，对植物在缺氧环境下乙醇脱氢酶的表达至关重要。Adh-I启动子对单子叶植物特别是谷类植物如水稻、燕麦 和大麦，和少部分双子叶植物如烟草，基因的调控功能比花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子 提高10-50倍。Adh-I启动子主要应用于单子叶植物，对绝大部分双子叶植物基因表达的调 控效果都很有限。单子叶植物是被子植物的主要类群，单子叶植物中的禾本科、百合科、棕榈科和天 南星等，是非常重要的农业作物。单子叶植物基因的强效启动子，能够调控植物高效率表达 具有特殊性状的外源基因，对优良作物的分子育种研究意义重大。在强效启动子相关研究领域，发现并验证了许多单子叶植物的启动子。此外，双子 叶植物中的一些强效启动子如CsVMV启动子、番茄E8启动子、白藜芦醇合酶基因Vstl启动 子等高效启动子，在单子叶植物中也有很强的基因调控作用。

发明内容
本发明的目的是提供一种新的启动子，能够在植物中调控基因的表达。本发明的另一目的在于提供含有上述启动子的核酸构建体、载体、重组细胞、植物 愈伤组织、植物外植体及植物。本发明的再一目的在于提供一种制备上述启动子的引物、方法，以及一种利用该 启动子来调控植物中基因表达的方法。本发明的再一目的在于提供一种制备转基因植物的方法，以及上述启动子在调控 植物中目的基因表达或植物育种中的用途。为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案本发明公开了一种启动子，所述启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能 的核苷酸序列a、Seq ID No. 1所示的核苷酸序列；以与kq ID No. 1互补的核苷酸序列；C、在高等严紧条件下能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核 苷酸序列；e、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。本发明还公开了一种核酸构建体，包含上述启动子，以及与启动子可操作连接的 基因序列，其中所述启动子与所述基因序列来源相同或者不同。本发明还公开了一种载体，所述载体含有上述启动子或上述核酸构建体，优选的， 所述载体为上述启动子与PMD18-T或p8质粒经重组得到的重组载体。本发明进一步公开了一种重组细胞，所述细胞含有上述启动子、上述核酸构建体 或上述载体，优选的，所述重组细胞为重组大肠杆菌细胞或重组农杆菌细胞。本发明进一步公开了含有上述启动子、核酸构建体、载体或重组细胞的植物愈伤 组织、植物外植体或植物，优选的，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，再优选的，所述植 物为稻属或烟草属，更优选的，所述植物为水稻或烟草，进一步优选的，所述植物为水稻日 本晴(Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare)或烟草 NC89。本发明进一步公开了一组引物对，用于扩增得到上述启动子，所述引物对的两条引物分别含有IDID No :3所示的序列，优选的，所述引物对的两条引物
在5’端还分别连接有限制性酶切位点和/或保护碱基，更优选的，所述引物对的两条引物 分别具有Seq ID No 4和Seq ID No 5所示的序列。本发明还公开了制备SEQ ID No 1所示启动子的方法，包括以水稻日本晴基因 组DNA为模板，使用一对扩增引物进行扩增，所述扩增引物根据SEQ ID NO :1在水稻日本晴 gDNA中的序列分别针对首尾进行设计，优选是上述的引物对。本发明进一步公开了一种调控植物中基因表达的方法，所述方法包括，将上述启 动子、核酸构建体、载体或重组细胞导入植物细胞。优选导入植物愈伤组织。进一步优选的， 启动子或核酸构建体导入植物细胞是利用农杆菌转化植物愈伤组织，所述植物优选为单子 叶植物或双子叶植物，所述植物再优选为稻属或烟草属，所述植物更优选为水稻或烟草，所 述植物进一步优选为水稻日本晴(Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare)或烟草 NC89。本发明还公开了一种制备转基因植物的方法，包括在有效产生植物的条件下培养上 述的重组细胞或植物愈伤组织或植物外植体或植物。本发明还公开了上述启动子、核酸构建体、载体、重组细胞或植物愈伤组织或植物 外植体或植物在调控植物中目的基因表达或植物育种中的用途，优选植物是单子叶植物或 双子叶植物，再优选的植物为稻属或烟草属，更优选植物为水稻或烟草，进一步优选植物为 7jC稻日本晴(Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare)或烟草 NC89。由于采用了以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于本发明提供的新的启动子能够在植物中调控基因表达，并且，在单子叶植物如水 稻和双子叶植物如模式植物-烟草的根和叶中均具有启动子功能，能够调控外源基因的表 达，从而为研究植物(包括单子叶植物和双子叶植物)中目的基因的表达提供了一种新的 工具和选择。保藏信息培养物名称烟草NC89种子保藏日期2010年11月12日保藏单位湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，即中国典型培养物保藏 中心(CCTCC)保藏编号CCTCCNo :P201017


图1为用于构建p8质粒的pCAMBIA-1301质粒示意图。图2为p8质粒示意图。图3为经转化的水稻愈伤组织的GUS染色结果。其中，由带有本发明所述启动子 P545序列的重组根癌农杆菌P8+P545转化的水稻愈伤组织(右)经⑶S染色后呈现蓝色； 不带有本发明启动子序列的重组根癌农杆菌p8质粒的水稻愈伤组织(对照，左)经⑶S染 色后颜色未发生变化。图4和图5分别为经转化的水稻苗根和叶的GUS染色结果。经含有启动子的 P8+P545重组载体的重组根癌农杆菌介导转化的水稻苗的根(图4右)和叶(图5右)经 染色后呈现蓝色，经不含有启动子的P8质粒重组根癌农杆菌介导转化的水稻苗的根(作为
6对照，图4左)和叶(图5左)经⑶S染色后颜色未发生变化。图6和图7分别为经转化的烟草苗根和叶的GUS染色结果(三倍光学显微镜下拍 照)。经含有启动子的P8+P545重组载体的重组根癌农杆菌介导转化的烟草苗的根(图6 右)和叶(图7右)经染色后呈现蓝色，经不含有启动子的p8质粒重组根癌农杆菌介导转 化的烟草苗的根(作为对照，图6左)和叶(图7左)经GUS染色后颜色未发生变化。
具体实施例方式本发明涉及一种能够在植物中调控基因表达的启动子序列，本发明的启动子含有 选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列a、序列表中kq ID No. 1所示的核苷酸序列；以与kq ID No. 1互补的核苷酸序列；C、在高等严紧条件下能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核 苷酸序列；e、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。在本发明一个具体的实施方式中，本发明的启动子优选具有kq ID No. 1所示的 核苷酸序列，并在本发明中被称为启动子BgIosPM5，或者简称为P545启动子。在本发明中，典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分 类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严 紧性”典型地发生在约Tm-5°C (低于探针Tm 5°C )；“高等严紧性”发生在Tm以下约5_10°C ； “中等严紧性”发生在探针Tm以下约10-20°C ；“低严紧性”发生在Tm以下约20_25°C。作 为替代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧 性洗涤为依据。例如，6XSSC =极低严紧性；3XSSC =低至中等严紧性；IXSSC =中等严 紧性；0. 5XSSC =高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严 紧同一或近严紧同一的核酸序列；或采用高等严紧性条件确定与该探针有约80%或更多 序列同一性的核酸序列。对于要求高选择性的应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如 选择相对低的盐和/或高温条件。Sambrook等(Sambr00k，J.等(1989)分子克隆，实验室 手册，Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧性 在内的杂交条件。为了便于说明，用于检测本发明的杂交的合适的中等严紧条件包括用5XSSC、 0.5% SDS、1. OmM EDTA(pH8. 0)溶液预洗；在50-65°C下在5XSSC中杂交过夜；随后用含 0. SDS的2X、0. 5X和0.2XSSC在65°C下各洗涤两次20分钟。本领域技术人员应当 理解，能容易地操作杂交严紧性，如改变杂交溶液的含盐量和/或杂交温度。例如，合适的 高等严紧杂交条件包括上述条件，不同之处在于杂交温度升高到例如60-65°C或65-70°C。在本发明中，所述在高等严紧条件下与^^ ID No. 1所示或与其互补的核苷酸序 列杂交的核苷酸序列，其具有与kq ID No. 1所示核苷酸序列相同或相似的启动子活性。在本发明中，所述对kq ID No. 1或与其互补的核苷酸序列进行一个或多个碱基 的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，是指分别或同时在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和/或序列内部进行例如不超过2-45个，或者不超过3-20个，或者不超过3-20个，或 者不超过4-15个，或者不超过5-10个，或者不超过6-8个的分别用逐个连续整数表示的碱 基的取代、缺失、添加修饰。在本发明中，所述对kq ID No. 1或与其互补的核苷酸序列进行如上述一个或多 个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，具有与kq ID No. 1所示的核苷酸序列相同 或相似的启动子活性。通过一种多核苷酸进行说明，其所具有的核苷酸序列例如与kq ID No. 1的参考 核苷酸序列至少90% “同一性”是指在^^ ID No. 1的参考核苷酸序列之每100个核苷 酸中，该多核苷酸的核苷酸序列除了含有多达10个核苷酸的不同外，该多核苷酸之核苷酸 序列与参考序列相同。换句话说，为了获得核苷酸序列与参考核苷酸序列至少90%相同的 多核苷酸，参考序列中多达10%的核苷酸可以被删除或被另一核苷酸替代；或可将一些核 苷酸插入参考序列中，其中插入的核苷酸可多达参考序列之总核苷酸的10% ；或在一些核 苷酸中，存在删除、插入和替换的组合，其中所述核苷酸多达参考序列之总核苷酸的10%。 参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在这些末端位置之 间的任意地方，它们或单独散在于参考序列的核苷酸中，或以一个或多个相邻的组存在于 参考序列中。在本发明中，用于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法是例如BLAST和 BLAST2. 0 算法，它们分别描述在 Altschul 等(1977) Nucl. Acid. Res. 25 :3389-3402 和 Altschul等(1990)J.Mol.Bio. 215 :403-410。采用例如文献中所述或默认参数，BlAST和 BLAST 2.0可以用于确定本发明的核苷酸序列同一性百分数。执行BLAST分析的软件可以 通过国立生物技术信息中心为公众所获得。在本发明中，所述与SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一 性的核苷酸序列包括与SEQ ID NO :1所公开序列基本同一的多核苷酸序列，例如当采用本 文所述方法(例如采用标准参数的BLAST分析)时，与本发明多核苷酸序列相比含有至少 90%序列同一性、优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的 序列同一性的那些序列。在本发明中，所述与SEQ ID No. 1或其互补的核苷酸序列具有至 少90%的序列同一性的核苷酸序列具有与kq ID No. 1所示的核苷酸序列相同或相似的启 动子活性。本发明还涉及一种核酸构建体，包括基因以及与该基因可操作地连接的上述启动 子。在本发明中，“可操作地连接”是指两个或多个核苷酸区域或核酸序列的功能性的空间 排列。在本发明的核酸构建体中，例如，启动子被置于所述基因的核酸序列的特定位置，例 如启动子位于所述基因核酸序列的上游位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引 导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该基因的核酸序列上。所述基因一般是需要提高 转录水平的任何核酸序列，或者，可设计本发明所述启动子和基因以便下调特定核酸序列。 也就是通过将启动子与反义方向的基因相连来实现。在本发明一个具体的实施方式中，所 述基因优选为GUS基因。本发明还涉及一种含有上述启动子或上述核酸构建体的载体。本发明的载体可 以是通过将上述启动子或上述核酸构建体插入到克隆载体或表达载体而得到的重组载 体。适于构建本发明所述重组载体的克隆载体包括但不限于，例如pUC18、pUC19、pUC118、
8pUC119、pMD19-T、pMD20-T、pMD18-T Simple Vecter、pMD19_T Simple Vecter 等。适于构 建本发明所述重组载体的表达载体包括但不限于，例如pMI121、pl3W4、pGEM等。在本发明 具体的实施方式中，本发明含有所述启动子的载体为上述启动子与PMD18-T或p8质粒经重 组得到的重组载体，优选的，本发明的重组载体为PMD18-T+P545重组载体或者p8+P545重 组载体。本发明的又一方面，还涉及含有本发明所述启动子的重组细胞。本发明的重组 细胞可以通过将上述含有本发明启动子的重组载体转化宿主细胞而得到。适于构建本发 明所述重组细胞的宿主细胞包括但不限于，例如大肠杆菌细胞DH5ci，根癌农杆菌细胞 LBA4404、EHA105、GV3101等。在本发明一个具体的实施方式中，所述重组细胞为重组根癌 农杆菌 EHA105-PM5。本发明的再一方面，还涉及一种植物愈伤组织或植物外植体或植物，所述愈伤组 织、植物外植体或植物含有有本发明的上述启动子。本发明的植物愈伤组织可以是单子叶 植物愈伤组织例如水稻愈伤组织，或者双子叶植物愈伤组织例如烟草愈伤组织。本发明的再一方面，还涉及用于PCR扩增得到本发明所述启动子的一组引物对， 该组引物对含有序列表中kq ID似.2及％(1 No.3所示的序列。为了便于操作，通常优选 在引物的5’端含设计连接有限制性酶切位点和/或保护碱基，在本发明具体的实施方式 中，所述引物对的两条引物分别具有^^ IDID No :5所示的序列。，^,/KfSH^Hf (Oryza sativaL. ssp. japonica cv. Nipponbare) S 因组DNA为模板进行PCR扩增，能够制备得到本发明的启动子。本发明进一步公开了一种调控植物中基因表达的方法，所述方法包括，将上述启 动子导入植物细胞。优选的是通过将同时含有外源基因以及本发明启动子的核酸构建体导 入植物细胞来达到调控基因表达的目的。所述核酸构建体中，外源基因与本发明的启动子 可操作地连接。在本发明优选的实施方式中，可以利用含有目的外源基因与本发明启动子 的重组载体转化农杆菌，再将得到的重组农杆菌转化植物愈伤组织，从而实现将所述外源 基因与本发明启动子一起导入植物细胞的目的。在本发明一个具体的实施方式中，外源基 因优选为GUS基因。本发明的植物可以是单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、小米、甘蔗、高 粱、大麦等，也可以是双子叶植物，例如烟草，大豆，马铃薯、蚕豆、萝卜、花生等。烟草是典型的基因工程模式植物。故本发明选择烟草进行转基因研究，以研究本 发明的启动子在双子叶植物中的效果。实验结果表明，该启动子能在转基因烟草中起作用。在本发明中，可采用植物基因转化技术将目的基因及所述启动子插入到植物基因 组中，包括农杆菌介导转化、病毒介导转化、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电穿孔等。 本领域周知，农杆菌介导的基因转化常被用于单子叶植物和双子叶植物的基因转化，但其 它转化技术也可用于本发明启动子及外源基因的导入。当然，适于本发明的启动子及外源 基因导入的另一种方法是粒子轰击(显微金或钨粒子包覆转化的DNA)胚性愈伤组织或胚 胎开发。另外，还可以采用的转化植物细胞的方法是原生质体转化。基因转化后，采用通用 的方法来筛选和再生整合有表达单元的植株。为实现上述调控基因表达的目的，本发明所述启动子可以以单拷贝和/或多拷贝 的形式应用，可以与现有技术中已知的启动子联用。本发明的启动子以及调控植物中基因表达的方法，可以应用于植物品种的选育。比如，可以用于水稻或烟草的育种。所述水稻可以为日本晴、中花9、中花10、中花11、台北 309、丹江8号、云稻2号、汕优63、汕优608、丰优22、黔优88、II优416、II优107、II优 128,11优718、准两优527、川农1号、杂0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、 皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、 皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101等。在本发明一个具体的实施方式中，所述水 稻为日本晴。所述的烟草可以为K326、K346、K394、NC82、NC89、G140、G28、G80、中烟90、 Cokerl76，以及CV87等。在本发明另一个具体的实施方式中，所述烟草为烟草NC89。本发明的启动子可成为一种新的启动子，作为植物(包括单子叶植物和双子叶植 物，尤其是水稻和烟草)转基因的工具启动子，为开展低表达基因转化苗筛选、植物花器官 败育等分子育种研究提供便利，从而极大地缩短优良品种的选育时间。本发明的启动子可 广泛用于培育水稻、烟草、小麦、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麦、大豆，马铃薯、蚕豆、萝卜、花 生等。在本发明中，术语“单子叶植物”，具体地，可以为禾本科植物，更具体地，可以为稻 属植物例如水稻，包括但不限于日本晴、中花9、中花10、中花11、台北309、丹江8号、云稻2 号、汕优63、汕优608、丰优22、黔优88、II优416、II优107、II优128、II优718、准两优 527、川农1号、杂0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖 稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻 207，以及津原101等。在本发明中，术语“双子叶植物”，具体地，可以为茄科植物，更具体地，可以为烟草 属植物(烟草)，包括但不限于烟草 1(326、1(；346、1(394、^82、^89、6140、628、680、中烟 90、 Cokerl76,以及 CV87 等。下面通过具体实施方式
结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员 将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明 具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等 著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1 :P545启动子片段的PCR扩增和pMD18_T+P545重组载体的构建PCR扩增使用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN新型植物基因组DNA提取试剂盒，目录 号DP320-02)提取水稻日本晴(Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare)(已在申 请号为200910238992. 0、发明名称为“一种启动子BgIosP587、其制备方法及用途”的发明 申请中保藏，并于2010年9月22日公开，保藏编号为CCTCC NO :P200910)的基因组DNA，根 据该启动子在水稻日本晴gDNA中的序列，分别在首尾设计一对PCR特异性扩增引物(上游 引物F1，加限制性酶切位点EcoRl和保护碱基，下游引物R1，加限制性酶切位点SbfI和保 护碱基)。以上述提取的水稻日本晴的gDNA为模板，使用高保真Ex Taq(TaKaRa,DRR100B) 聚合酶进行PCR扩增。如表1所示。表1基因启动子扩增的PCR体系
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权利要求
1.一种启动子，所述启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列a、Seq ID No. 1所示的核苷酸序列；以与kq ID No. 1互补的核苷酸序列；C、在高等严紧条件下能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸 序列；e、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。
2.—种核酸构建体，包含权利要求1所述的启动子，与启动子可操作连接的基因序列， 其中所述启动子与所述基因序列来源相同或者不同。
3.一种载体，其特征在于所述载体含有权利要求1所述的启动子或权利要求2所述 的核酸构建体，优选的，所述载体为权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的核酸构建 体与pMD18-T或p8质粒经重组得到的重组载体。
4.一种重组细胞，其特征在于所述细胞含有权利要求1所述的启动子或权利要求2 所述的核酸构建体或权利要求3所述的载体，优选的，所述重组细胞为重组大肠杆菌细胞 或重组农杆菌细胞。
5.一种含有权利要求1的启动子或权利要求2的核酸构建体或权利要求3的载体或权 利要求4的重组细胞的植物愈伤组织或植物外植体或植物，优选的，所述植物为单子叶植 物或双子叶植物，再优选的，所述植物为稻属或烟草属，更优选的，所述植物为水稻或烟草， 进一步优选的，所述植物为水稻日本晴或烟草NC89。
6.一组引物对，所述引物对用于扩增得到权利要求1所述的启动子，其特征在于所述 引物对的两条引物分别含有kq IDID No :3所示的序列，优选的，所述引物对 的两条引物在5’端还分别连接有限制性酶切位点和/或保护碱基，更优选的，所述引物对 的两条引物分别具有kq ID No ID No :5所示的序列。
7.制备SEQID NO :1所示的启动子的方法，包括以水稻日本晴基因组DNA为模板，使用一对扩增引物进行扩增，所述扩增引物根据SEQ ID NO :1在水稻日本晴gDNA中的序列分别针对首尾进行设计，优选是权利要求6所述的引 物对。
8.—种调控植物中基因表达的方法，所述方法包括，将权利要求1所述的启动子或权 利要求2的核酸构建体或权利要求3的载体或权利要求4的重组细胞导入植物，优选导入 植物愈伤组织，优选的，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，再优选的，所述植物为稻属或烟草属，更优选的，所述植物为水稻或烟草，进一步优选的，所述植物为水稻日本晴或烟草NC89。
9.一种制备转基因植物的方法，包括在有效产生植物的条件下培养权利要求4的重组 细胞或权利要求5的植物愈伤组织或植物外植体或植物。
10.权利要求1所述的启动子或权利要求2的核酸构建体或者权利要求3的载体或权 利要求4的重组细胞或权利要求5的植物愈伤组织或植物外植体或植物在调控植物中目的 基因表达或植物育种中的用途，植物优选是单子叶植物或双子叶植物，再优选为稻属或烟草属，更优选为水稻或烟草，更进一步优选为水稻日本晴或烟草NC89。
全文摘要
本发明涉及一种启动子BgIosP545、制备方法及应用。所述启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列a、Seq ID No.1所示的核苷酸序列；b、与Seq ID No.1互补的核苷酸序列；c、在高等严紧条件下能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列；e、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。本发明启动子能够在单子叶和双子叶植物中调控基因表达，从而为研究植物中目的基因的表达提供了一种新的工具和选择。
文档编号A01H4/00GK102146395SQ201010615820
公开日2011年8月10日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者全志武, 夏秋菊, 李河南, 杨爽 申请人:深圳华大基因科技有限公司