脂肪酸脱氢酶AhFAD2-1B-m基因的启动子及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及植物基因工程和生物技术领域，具体设及一种花生Δ U脂肪酸脱氨酶 AhFAD2-lB-m基因启动子，同时还设及AhFAD2-lB-m基因启动子的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 花生是世界上最重要的经济作物之一，在世界食用油消费及消遣食品中占有举足 轻重的地位。巧仁含油量一般为46%-57%，其中油酸、亚油酸是最重要的组份，二者含量之和 一般占80%W上，两者均为不饱和脂肪酸，分别含有1个和2个不饱和键。油酸含量或油酸/亚 油酸比值(〇化)是衡量花生耐胆藏性及品质的一个重要生化指标，该值愈大，花生耐胆藏性 愈好，其品质愈高。从对人体健康方面考虑，亚油酸的氧化产物具有导致动脉粥样化的潜在 危险，同时还产生难闻的气味和腐败恶臭的不适口感，油酸在降低收缩压、保护低密度脂蛋 白、降低有害胆固醇、维持有益胆固醇(高密度脂蛋白）和减缓动脉粥样硬化等方面发挥重 要作用。而我国花生品种的油酸/亚油酸的比值普遍偏低，大果品种一般在1.3左右，小果品 种一般在1.0左右。
[0003] Δ "脂肪酸脱氨酶(del1:a 12-fatty acid desa1:urase, FAD2)是负责向油酸中引 入第二个双键生成亚油酸的关键酶，决定了油巧中油酸和亚油酸的比例。花生中存在2个同 源非等位FAD2基因（AhFAD2-lA和AhFAD2-lB)，运2个基因在编码区DNA序列高度同源 (99%)，分别来源于花生区组A基因组和B基因组。另外，在花生基因组中还存在一些FAD2的 假基因。FAD2基因结构和表达水平的变化是导致花生高油酸性状产生的原因。高油酸天然 突变体F435的AhFAD2B基因起始密码子后第442位核巧酸有一个碱基A插入，导致移码突变， 使翻译提前终止。高油酸突变体M2-225和C458分别是在AhFAD2B基因起始密码子后997bp和 665bp处存在MITE插入，导致基因功能丧失。AhFAD2A基因在448个碱基出现G^A突变，导致 高油酸性状产生。Jung等研究证实，控制高油酸性状的oil位点和〇12位点分别编码AhFAD2A 和AhFAD2B基因，花生高油酸性状的产生是由于AhFAD2A和AhFAD2B基因同时突变，导致其 编码的酶蛋白活性降低或功能丧失所致。目前对FAD2基因的研究主要集中在基因编码区的 功能研究上，对该基因启动子的研究鲜有报道。阐明该基因及其假基因启动子的功能，对于 研究FAD2的功能、进化模式及改良花生脂肪酸组份及品质具有重要意义。
[0004] 启动子包含多种重要顺式作用元件参与基因的转录，参与调控下游基因的表达， 使得植物能够适应外界环境的变化及自身生长发育的需要。因此对植物启动子的研究有助 于了解基因表达模式及其调控机理。随着分子生物学的发展和基因工程研究的需要，人们 分离了大量的启动子，并对它们进行了鉴定，获得了一大批有应用前景的启动子，按照启动 子的表达模式可分为Ξ类:第一类是组成型启动子，运类启动子在各个器官、组织、不同的 发育阶段和各种环境下都有转录活性;第二类是组织特异性启动子，运类启动子仅在特定 的细胞、组织和发育阶段具有转录活性;第Ξ类是诱导型启动子，运类启动子在特定的生物 或非生物信号诱导下具有转录活性。目前植物基因工程中广泛应用的是组成型启动子，它 们驱动目的基因在植物各个组织和整个发育阶段都表达，运造成了物质和能量的浪费，增 加了植物的代谢负担，有时候影响植物的发育，甚至引起植物形态的改变。因此采用特异性 启动子取代组成型启动子，使外源基因能够特异性的表达，是植物基因工程的重要研究内 容。
【发明内容】
[000引本发明的目的在于:提供一种花生A U脂肪酸脱氨酶基因 AhFAD2-lB-m的启动子。
[0006] 本发明的另一个目的在于:提供一种操作简单、结果稳定可靠的花生Δ?2脂肪酸脱 氨酶基因 AhFAD2-lB-m启动子的制备方法。
[0007] 本发明的再一个目的在于：提供一种含有植物高效表达启动子的重组载体，其含 有所述的启动子核巧酸序列。该载体大小适合，在植物中易与转化，所带有的标记基因 GUS 表达强度高，容易检测。
[0008] 本发明还有一个目的：提供一种花生Δ U脂肪酸脱氨酶基因 AhFAD2-lB-m启动子在 种子、子叶和下胚轴中的应用。
[0009] 为了完成上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种分离的花生A"脂肪酸脱氨酶AhFAD2-lB-m基因启动子，其序列是下列核巧酸序 列之一： (a) 序列表中SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列； (b) 在严谨条件下能与(a)的核巧酸序列杂交并且具有相同功能的核巧酸序列； (C)与(a)或(b)的核巧酸序列具有90%W上的同源性，并且具有所述启动子功能的核巧 酸序列。
[001 0] -种花生PAhFAD2-lB-m启动子的制备方法，包括W下步骤： (1) 利用SDS裂解法提取基因组DNA，所用引物为： PAhFAD2-lB-mS : 5>- ACGCGTCGACACCAAGTAGCTTCTCAATGGCTCAGATTCG-3>; PAhFAD2-lB-mA: 5'- GACATCTAGATGTTGTGTTGTTAAAGCTCCTGTTACCAATG-3'; (2) W基因组DNA为模板，进行PCR扩增，反应体系为25化，包括：1XPCR buffer、MgCl2 1.5 mmol/L、dNTP 0.2 mmol/L、Pfu Taq酶1.5单位、模板约30~100 ng，体系中引物浓度为 0.5 mol/L； 扩增过程为:95°(3预变性1111111;94°(3变性1〇3,55°(3退火3〇3,72°(3延伸2 111111，35个 循环;72°C延伸10 min; (3) PCR产物经质量体积比为1.0%的琼脂糖凝胶检测，用凝胶回收试剂盒回收目的片 段;按回收片段、pMD 18-T载体3:1的摩尔比混合，加入5个单位的T4 DNA连接酶，10 X反应缓 冲液2.5化，用无菌水补充体积至25化，16°C连接过夜，获得连接液； (4) 用冻融法转化D册α菌株的感受态细胞，将连接液涂布于含有氨节青霉素50 mg / L的LB固体培养基平板上，37°C培养过夜，挑选白斑，进行菌落PCR检测，将阳性重组子接种 于含氨节青霉素50 yg/mL的LB液体培养基，37°C 200 r/min振荡培养过夜，用小量碱法提 取质粒，Sail / Xbal双酶切1 yg质粒，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测;检测正确的阳性重 组克隆，将目的片段连入pMDlS-T载体，获得载体pMD18-PAhFAD2-lB-m，即得到所述的PAhFAD2-lB-m 启动子。
[001。 所述的花生PAhFAD2-lB-m启动子的制备方法，其中LB固体培养基的制备方法如下:分 别称取10 g膜蛋白腺、5 g酵母提取物、10 g氯化钢和8 g琼脂依次溶解于蒸馈水中，定容于 1000毫升;然后分装于500毫升Ξ角瓶中，121°C、6.859X 104 化下高压消毒15分钟，4°C冷 藏备用； LB液体培养基的制备方法如下:分别称取10 g膜蛋白腺、5 g酵母提取物和10 g氯化钢 溶解于蒸馈水中，定容于1000血，然后分装于500 mLS角瓶中，12rC、6.859Xl04化下高 压消毒15分钟，4°C冷藏备用。
[0012] 含有所述的花生Δ U脂肪酸脱氨酶AhFAD2-lB-m基因启动子的重组载体。
[0013] 含有权利要求4所述的花生Δ U脂肪酸脱氨酶AhFAD2-lB-m基因启动子的重组载体 的构建方法，包括W下步骤： 首先用Sail / Xbal双酶切克隆载体pMD18-PAhFAD2-iB-m，同时用Sail / Xbal双酶切 pBI-PAhSAD-GUS质粒;酶切反应在37°C培养箱中进行，反应4~6小时后用质量体积比为1%的 琼脂糖胶电泳检测； 将克隆载体pMD18-PAhFAD2-lB-m酶切下的3肺的小片段和pB