夜，小量碱法(J.萨姆布鲁克. D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，分子克隆实验指南（第Ξ版)科学出版社）提取质粒，Sail / Xbal酶切质粒1 yg，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。检测正确的阳性重组克隆，将目的片段连 入PMD18-T载体，得到所述的PAhFAD2-lB-m启动子。
[0039] 为了确保载体中启动子的序列信息，WM13F/M13R为引物，将pMD18-PAhFAD2-iB-m进行 ii序，分析结果，获得了 PAhFAD2-lB-m，其序列为SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列。础13。:5>-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3';Ml3R:5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3')。
[0040] 实施例2:PAhFAD2-lB-m植物表达载体的构建和根癌农杆菌菌株EHA105(购于上海沪 尚生物科技有限公司）的转化 构建重组载体，是将质粒pBI-PAhSAD-GUS (质粒pBI-PAhSAD-GUS，河南省农业科学院经济 作物研究所保存，下同）上的PAhSAD启动子克隆得到PAhFAD2-lB-m片段，通过替换获得。
[0041 ] 为完成此目的，首先用Sail / Xbal双酶切克隆载体pMD18-PAhFAD2-iB-m，同时用Sail / Xbal双酶切地I-Pahsad-GUS质粒;酶切反应在37°C培养箱中进行，约反应4~6小时后，用1% (质量体积比，下同）的琼脂糖胶电泳检测。
[0042] 将克隆载体pMD18-PAhFAD2-lB-m酶切下的约3肺的片段和地I-PAhSAD-GUS酶切下的约 10肺的片段用DNA凝胶回收试剂盒回收。按照pMD 18-PAhFAD2-lB-m酶切下的约3肺的片段和 pBI-PAhSAD-GUS切下的约10肺的片段（150 ng 3肺的片段:50 ng 10肺的片段）=3:1的比 例(摩尔浓度比）混合样品，加入T4 DNA连接酶5个单位，10 X反应缓冲液2化，无菌水补充 体积至20化，16°C连接，过夜，获得连接液。
[0043] 冻融法转化连接液至DH5a菌株的感受态细胞，在含有卡那霉素巧0 yg/mL)的固体 LB培养基平板上筛选，16小时后挑取正常生长的菌斑进行菌落PCR，挑取阳性菌落提质粒， 经酶切验证正确的重组质粒，命名为地I-PAhFAD2-lB-m。
[0044] 利用冻融法将地I-PAhFAD2-lB-m转入根癌农杆菌EHA105,用卡那霉素巧0 yg /血)和 利福平巧0 yg/mL)双抗性平板筛选，48小时后挑斑，菌落用PCR检测验证，挑取阳性菌斑，保 存菌株，命名为地I-PAhFAD2-lB-m EHA105。
[004引其中的冻融法步骤如下：（1)取0.2 mL农杆菌EHA105感受态，于冰水中缓慢融化； (2)加入约2 yg重组质粒DNA，轻轻混匀，冰浴30 min后，投入液氮速冻5 min,然后37°C水 浴5 min,融化细胞；（3)加入800化不含抗生素的LB液体培养基，28°C轻摇培养4~化；（4) 12000巧m，30s，去上清，细胞重悬于0.2 mL的LB培养基中；（5)将培养物均匀涂布在含Rif 巧0 mg / L)、StW50 mg / L)和Kan巧0 mg / L)的琼脂板上，28°C培养2天，待平板上出现 转化子后挑菌，进行PCR检测。
[0046] 实施例3 : PAhFAD2-lB-m植物表达载体地I-PAhFAD2-lB-m在拟南芥中的遗传转化及转基因 植株筛选 参照文献中的方法进行拟南芥转化（Zhang X.R, et al. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature, 2006，1: 1-6)。制备含有植物表达载体地I-PAhFAD2-iB-m的根癌农杆菌EHA105菌液，在转化拟 南芥前一天，将pBI-PAhFAD2-iB-mEHA105转入含有卡那霉素50 yg / mL、利福平50 yg /血的 LB液体培养基200 mL中，28°C、220 r/min过夜培养。第二天，用紫外分光光度计（SPEK0L 1300)于276纳米波长下检测菌液的吸光值，当菌液的吸光值在1.6~2.0之间时取出。室溫 (20~25°C，下同）W4000 g离屯、10 min,弃上清，沉淀悬浮于等体积的5%薦糖溶液中（质量 体积比）。将浑浊的薦糖溶液倒入直径为15cm的培养皿中，转化前加入终浓度为0.02%(体积 比）的Silwet L-77(购自北京五洲元业科贸中屯、），混匀。把待转化的拟南芥整个花序轻轻 的浸没在薦糖中，15秒后取出植株花序。转化后的植株用黑色塑料袋包好，放在植物生长箱 中培养。
[0047] 第二天将塑料袋掲开，隔一周再做一次转化。培养一个月左右收获种子，种子在培 养箱或者日光下干燥3~5天。将转化收获的TO代种子用70%(体积比）的酒精和0.01%(质量 比）的升隶分别消毒3分钟和10分钟，然后用蒸馈水洗涂数次巧~7次），均匀地吹打到含卡 那霉素（50 mg / L)的MS固体筛选培养基表面(MS固体筛选培养基组成:MS大量元素母液 100 mLMS微量元素母液10 mLMS有机母液10血;MS铁盐10 ιΛ;肌醇10 ιΛ;薦糖30 g;用 1M化0H调pH至5.8,8 g琼脂粉，定容至1 L，121°C，6.859X 104化下高压消毒15分钟，备 用。各种母液配方见表1)d4°C避光放置3~5天后，转入植物生长培养箱【光周期16(白天)/8 (黑暗)小时，溫度：白天22°C，黑夜20°C】培养。根据表达载体上所特有的卡那霉素抗性筛选 阳性苗。
[0048] 当叶片长到足够大时（3~4叶期），取少许绿苗叶片，提取DNA，进行PCR阳性检测， 反应体系为25 化，内含：1XPCR buffer，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L、引物浓度 为0.5 mol/L，P化酶1.5单位，模板约100 ng，引物为： PAhFAD2-iB-mS: 5' -ACGCGTCGACACCAAGTAGCTTCTCAATGGCTCAGATTCG-3'; PAhFAD2-iB-mA: 5' - GACATCTAGATGTTGTGTTGTTAAAGCTCCTGTTACCAATG-3'; 根据具体情况设置循环参数，结果表明获得了转基因阳性苗。
[0049] 表1 MS培养基母液配方
将获得的转基因阳性苗进行培养，待绿苗长出两片真叶后，将其移栽到赔石中，待植株 长出花序后，取一片真叶用SDS方法提取基因组DNA，做PCR鉴定。PCR鉴定时采用的引物序列 为P化FAD2-lB-mS和PAhFAD2-lB-mA ; PCR反应体系如下：基因组DNA模板1化（约50 ng)、10 X Taq酶反应缓冲液2 uL、25 mM MgCL2 1.2 uL、2 ml dNTP 1.5 uL、10 uM引物各 0.2 uL、0.3单位Taq酶，加无菌水至20 yL。
[0050] 反应程序为:94°C预变性5 min，94°C变性45 s、55°C退火45 s、72°C延伸2 min，32 个循环，72°C延伸5 min。用1 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物，结果表明：PAhFAD2-iB-m植物 表达载体地I-PAhFAD2-lB-m的T-DNA区段已经成功转入拟南芥（图4)，共获得30株阳性苗。
[0051 ]实施例4:花生PAhFAD2-lB-m启动子的功能分析 本发明首次克隆得到PAhFAD2-lB-"的序列，并对其进行了功能分析。从实施例3中，采用拟 南芥转化及PCR检测步骤中筛选得到的阳性苗T1代，自交收获种子(即T2代）。取T2代10个株 系的不同时期组织进行GUS染色。
[0052] T2代取染色过程如下：将样品浸泡在GUS染液中，抽真空5分钟，37°C过夜。第二天 用酒精-乙酸溶液(体积比为1:1)进行脱色，直至叶片变为无色，