检测egfr基因l858r位点的特异性引物、探针及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子检测，具体地说，设及检测EGFR基因 L858R突变位点的特异性引 物、探针及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 表皮生长因子受体巧pidermal Growth Factor Rec邱tor,EGFR)是上皮生长因子 化GF)细胞增殖和信号传导的受体。EGFR属于皿R或化bB受体家族的一员，该家族包括EGFR 化rbB-1)、肥R2/c-neu 巧rbB-2)、Her 3 化rbB-3)和Her 4 (化bB-4) dEGFR也常被称作肥R1 或 ErbBl dEGFR及其家族成员能够调控细胞分化、调亡、细胞运动、新血管生成、浸润和转移等 多项生理过程，同时在大部分的人类肿瘤中都有表达，因此EGFR已经被证明在众多肿瘤的 发生、发展及预后过程中发挥了重要调控作用。
[0003] EGFR是典型的具有酪氨酸激酶(Tyrosine Kinase，ΤΚ)活性的受体，TK在EGFR的活 性中发挥了关键作用。美国FDA批准对拟采用易瑞沙、特罗凯等EGFR-TKI治疗的患者，进行 EGFR基因突变检测。需要指出，检测EGFR基因突变并不能作为患者是否患癌的依据。在我国 《NCCN:非小细胞肺癌临床实践指南（中国版)》中只是明确提出了临床实践中EGFR-TKI治疗 前需要针对EGFR编码区第18、19、20和21外显子的突变位点开展检测。
[0004] CN103740843A公开了 一种检测人表皮生长因子受体基因 EGFR外显子21上L858R点 突变的方法及试剂盒；W数字PCR为平台，在反应体系中加入PCR引物和化qMan探针，利用两 条标记不同类型巧光的化qMan探针对野生和突变DNA模板进行检测；根据巧光类型判断样 品中DNA模板的类型及其数量及比例。但该技术方案的引物探针组合的突变检出率仅能达 到2500分之一。
[0005] CN103333963A公开了一组用来检巧化GFR基因 L858R点突变的引物组及用此引物组 来检测EGFR基因 L858R点突变的方法。然而，其只有引物序列，检测效率不如探针法，不能检 出突变频率。
[0006] CN102851375A公开了一种检测EGFR基因突变的引物、探针及其试剂盒和使用方 法。其能够检出含0.1~1 %EGFR基因突变DNA的样本，但血液循环游离核酸的突变有时低于 该频率，因此该技术方案不适用于血液循环游离核酸的检测。
【发明内容】
[0007] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用于检测血液循环游 离核酸中EGFR基因 L858R位点的特异性引物、探针及试剂盒。
[000引为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
[0009] 第一方面，本发明提供一种用于检巧化GFR基因 L858R位点的特异性引物，其核巧酸 序列为：
[0010] 前向引物:ACACCGCAGCATGTCAAGATC;
[0011 ]反向引物:CAGCCTGGTCCCTGGTGTCAG。
[0012] 第二方面，本发明提供与所述引物配合使用的探针，其核巧酸序列为：
[0013] VIC:5 '-VIC-GGCCAGCCCAAA-MGB-NFQ-3 '；
[0014] FAM：5'-FAM-GGCCCGCCCAAA-MGB-NFQ-3'〇
[0015] 第Ξ方面，本发明提供含有所述引物和所述探针的试剂。
[0016] 第四方面，本发明提供含有所述引物和所述探针的试剂盒。
[0017] 第五方面，本发明提供一种检测血液循环游离核酸中EGFR基因 L858R位点的方法， W血液游离核酸为模板，利用所述引物和所述探针进行数字PC閲金证，数字PCR依据检测巧 光信号给出拷贝数判定结果。
[001引数字PCR检测方法具体为：
[0019] 标准PCR反应体系经过微滴发生后，分配到约20000个微滴中，每个微滴包含或不 包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板），实现"单分子模板PCR扩增"，扩增结束后，含有 核酸分子模板的微滴会给出巧光信号，没有模板的微滴就没有巧光信号产生。最终根据泊 松分布原理W及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检祀分子的浓度或拷贝数。数字 PCR可W直接计算目标序列的拷贝数，因此无需依赖于对照样品和标准曲线就可W进行精 确的绝对定量检测;此外，由于数字PCR在进行结果判读时仅判断有/无两种扩增状态，因此 也不需要检测巧光信号与设定阔值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，因此数字PCR的反 应受扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高;数字PCR实验中标 准反应体系分配的过程可W极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度。计 算给出待检祀分子的浓度或拷贝数。
[0020] 数字P邸验证实验流程为：
[0021] 配制PCR反应液，配置后室溫静置3分钟。将静置后的PCR反应液转移到DG8微滴发 生卡中的样品槽，再加入微滴发生专用油。放入QXSOODroplet Generator中进行微滴发生 反应。转移生成好的微滴到96孔板。覆上PCR粘性封锥片使用热封仪进行封片。随后转移至 PCRW进行扩增反应，反应条件为95°C10分钟；94°C30秒，60°C1分钟，40个循环；98°C10分 钟;4°C持续。反应完成后放入QXSOODroplet Reader进行信号读取;对数据进行分析。
[0022] 本发明还提供了适用于微滴式数字PCR系统的该突变位点的检测体系。具体包括： 2 X dd PCR预混液lOul，lOuM前向引物lul，lOuM反向引物lul，2uM的野生型探针2ul，2uM的 突变型探针化1，水3ul，模板lul，共20ul。
[0023] 本发明的有益效果在于：
[0024] 本发明提供了用于检测血液循环游离核酸中EGFR基因 L858R位点的方法和检测试 剂盒，适用于对非小细胞肺癌病人祀向用药厄洛替尼片，吉非替尼等的评估。本发明提供的 用于检测EGFR基因 L858R的方法为MGB-化qman探针方法，不仅适用于对肿瘤组织，石蜡包埋 组织来源的核酸进行检测，更加适用于对血液循环游离核酸中EGFR基因 L858R突变的位点 的检测;且结合该检测体系和微滴式数字PCR系统可对核酸样本的突变频率进行准确检出。 检测该突变位点的引物和探针序列如下文所示，本发明还提供了对EGFR基因 L858R突变位 点进行拷贝数检测的试剂盒。本发明提供的EGFR基因 L858R突变位点检测方法肺癌祀向用 药，病情监测和预后评估方面，为临床提供了有效的指导。
[0025] 本发明提供的特异性引物和探针，能够对血液游离核酸进行准确检测，在检测突 变同时可W直接给出基因位点的突变频率，且结合数字PCR系统对突变的检出可达5000分 之一，灵破度局。
【附图说明】
[0026] 图访本发明实施例3中W包含EGFR基因 L858R突变位点的突变质粒(mu化nt)和包 含该位点野生型的质粒(WT)为模板，用微滴式数字PCR系统对探针的特异性和灵敏度进行 测试。
[0027] 图2为本发明实施例3中野生型质粒(WT)终浓度从0.01到O.OOOlng时，WT探针检测 从11000至Ij453个拷贝不等，mu化nt探针无检出
[002引图3为本发明实施例3中突变型质粒(mutant)终浓度从0.01到O.OOOOlng时，WT探 针无检出，mu化nt探针检出从1000000到40个拷贝不等。
[0029] 图4为本发明实施例3中11个样本分别进行检测的结果对比。
[0030] 图5为本发明实施例3中11个样本的EGFR基因的L8 5 8 R位点的野生型拷贝进行检 巧。，结果是11个样本均有野生型拷贝检出。
[0031 ]图6为本发明实施例3中11个样本的EGFR基因的L858R位点的突变型拷贝进行检 巧。，结果是只有第Ξ个样本有突变型拷贝检出。
[0032]图7为本发明实施例3中引物和探针对7个肿瘤患者血液游离核酸进行检测的统计 结果。
[00削图8为本发明实施例帥7个循环游离DNA样本的EGFR基因的L858R位点的野生型拷 贝进行检测，结果是7个样本均有野生型拷贝检出。
[0034] 图9为本发明实施例帥7个循环游离DNA样本的EGFR基因的L858R位点的突变型拷 贝进行检测，结果只有第7个样本有突变拷贝检出。
【具体实施方式】
[0035] 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是W下实 施例的给出仅是为了起到说明的