奥斯特线虫/马歇尔线虫coi基因的扩增引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学领域，具体地说，设及奥斯特线虫/马歇尔线虫C0I基因的 扩增引物及其应用。
【背景技术】
[0002] 反当动物胃肠道寄生线虫（gastrointestinal nematodes in ruminants)包括毛 圆线虫科（Trichostrongyloidae)中毛圆线虫亚科（Trichostrongylinae) W及长刺线虫 亚科（Mecistocirrinae)动物线虫。运其中，毛圆线虫亚科奥斯特线虫属（Ostertagia)、马 歇尔线虫属（Marshallagia)、背带线虫属（Teladorsagia)、血矛线虫属（Haemonchus)、古 柏线虫属（Cooperia)、毛圆线虫属（Trichostrongylus)等6个属对我国北方牧区的放牧 家畜危害较大，尤W奥斯特线虫、马歇尔线虫危害严重。奥斯特线虫/马歇尔线虫属于消化 道内寄生虫，主要寄生于反当动物家畜第四胃（真胃）W及肠道的權皱中。上述寄生虫每 年对我国畜牧业造成重大损失，其主要分为W下两个方面：其一为反当动物感染胃部线虫 后，由于机体营养被夺取及有毒物质的产生，影响畜产品的数量和质量，极端情况会导致动 物死亡，因此造成大量损失；另一方面，为了防治牛羊胃肠道线虫，定期驱虫消耗的药品产 生的费用。
[0003] 我国目前发现的马歇尔线虫共有许氏马歇尔线虫（Marshallagia hsui)、蒙古马 歇尔线虫（Marshallagia mongolica)等9种；奥斯特线虫有达荷奥斯特线虫（Ostertagia d址urica)、布里亚特奥斯特线虫（Ostertagia buriatica) W及西方奥斯特线虫 (Ostertagia occidentalis)等15种。反当动物奥斯特线虫、马歇尔线虫的分类依据主要 是基于传统的形态学，借助显微镜观察雄性线虫的交合刺、导刺带、交合伞等器官的形状、 长度、大小W及雌虫的阴口构造，结合虫体本身的大小、长度、颜色，W此鉴定虫种。但是，依 靠形态学鉴定线虫种类容易出现问题：首先，许多动物线虫样本的形态特征在获取标本或 储存时被破坏了；其次，全面掌握所有线虫种类的特征W及区分方法需要耗费大量的时间， 而且十分困难；再次，某些不同种类反当动物奥斯特线虫/马歇尔线虫的形态特征近似，它 们之间的形态、大小极为相近，即使经验丰富的专家也难W将它们区分；最后，奥斯特线虫 /马歇尔线虫不同种类的形态特征主要体现在雄虫上，其雌虫之间形态学差别较小，依据形 态学鉴定较为困难。基于上述原因，研发针对反当动物奥斯特线虫/马歇尔线虫的分子物 种鉴定方法势在必行。
[0004] 近年来，利用分子技术对物种进行鉴定和系统发生关系研究已经成为一种快速有 效的方法，其中线粒体C0I基因5'端序列具有物种种间遗传距离大，物种种内序列保守、序 列两端有保守序列可设计通用引物等特点成为物种鉴定和研究物种进化关系的理想基因。 目前，已经成为DNA条形码值NA barcoding)技术在动物类群中的标准基因。利用mtCOI 基因对反当动物奥斯特线虫/马歇尔线虫进行物种鉴定和系统发生关系分析具有很好的 前景。 W化]在实际研究中，使用化Imer等人于1994年设计的C0I通用引物LC01490和 肥02198在反当动物奥斯特线虫/马歇尔线虫运一类群中扩增效率较低，阻碍了 DM条形码 技术在上述的应用。因此，奥斯特线虫/马歇尔线虫C0I基因扩增引物的设计与应用，对利 用分子方法鉴定奥斯特线虫、马歇尔线虫物种W及系统发生关系分析具有重要意义，同时 也能为反当动物胃肠道寄生虫流行病学调查提供技术条件。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种奥斯特线虫/马歇尔 线虫C0I基因的扩增引物，其可W有效扩增出通用引物LC01490和肥02198不能扩增的奥 斯特线虫/马歇尔线虫的C0I目的片段。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明首先提供一种奥斯特线虫/马歇尔线虫C0I基因的 扩增引物，其包括：
[0008] GNF :5'-ACTGCTCATGCTATTTTAA-3' ；
[0009] GNR :5'-GCCCACACMACACAACCAAT-3'。
[0010] 本发明还提供一种含有所述引物的用于检测奥斯特线虫/马歇尔线虫的试剂盒。 W11] 进一步地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2\PCR反应缓冲液中的至 少一种。
[0012] 进一步地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
[0013] 本发明还提供了所述引物或所述试剂盒在检测奥斯特线虫/马歇尔线虫中的应 用。
[0014] 本发明还提供了奥斯特线虫/马歇尔线虫的特异性PCR检测方法，包括W下步 骤： 阳〇1引 1)提取样品DNA;
[0016] 。W步骤1)提取的DNA为模板，利用所述的引物GNF和GNR进行PCR扩增反应；
[0017] 扣分析PCR产物。
[0018] 进一步地，PCR反应体系Κ20μ1 计为：2μΙ lOx Buffer，2yL DNTP(2mM)，l. 2μΙ MgCl2(25mM)，2μL引物GNF(10μM)，2μL引物GNR(10μM)，0.16μLr-Taq巧u/μL)，lμL DM模板，9.64 μ L双蒸水。
[0019] 进一步地，PCR反应条件为：PCR扩增程序：94°C预变性5min ;94°C变性30S，45°C 退火30S，72°C延伸Imin，共38个循环；72°C延伸7min，4°C保存。
[0020] 本发明的有益效果在于：
[0021] 本发明提供的奥斯特线虫/马歇尔线虫C0I基因的扩增引物，可W有效扩增出通 用引物LC01490和肥02198不能扩增的奥斯特线虫/马歇尔线虫的C0I目的片段。满足反 当动物奥斯特线虫/马歇尔线虫的物种分子鉴定需求，同时也能为奥斯特线虫/马歇尔线 虫种系发生关系研究、反当动物胃肠道寄生虫病防控提供可靠的分子技术指导。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明设计的奥斯特线虫/马歇尔线虫正向扩增引物GNF序列与通用扩增 引物LC01490/肥02198扩增的奥斯特线虫/马歇尔线虫C0I序列进行BLAST比对分析的 结果；其中1 :GNF引物序列；2 :普通奥斯特线虫（Ostertagia ci;rcumcincta)COI序列；3 : 布里亚特奥斯特线虫（Ostertagia bu;riatica)COI序列；4:西藏奥斯特线虫（Ostertagia xizangensis)COI 序列；5 :西方奥斯特线虫（Ostertagia occidentalis)COI 序列；6 :许氏 马歇尔线虫（Marshallagia hsui)C0I 序列；7 :矛形奥斯特线虫（Marshallagia lanceata) COI序列；8 :吴兴奥斯特线虫（Marshallagia mihingensis)COI序列；9 :蒙古马歇尔线虫 (Marshallagia mongolica)COI 序列。
[0023] 图2为本发明设计的奥斯特线虫/马歇尔线虫反向扩增引物GNR序列与获取的普 通奥斯特线虫/布里亚特奥斯特线虫/奥氏奥斯特线虫/蒙古马歇尔线虫C0I序列进行 BLAST比对分析的结果，四条序列均为LC01490/肥02198扩增C0I序列的3'端侧翼序列； 其中1 :GNR引物序列；2 :蒙古马歇尔线虫序列；3 :普通奥斯特线虫序列；4 :奥氏奥斯特线 虫序列；5 :布里亚特奥斯特线虫序列。
【具体实施方式】
[0024] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 阳〇2引 实施例1
[00%] 1、样品采集：于2011年~2014