包含嵌合巨细胞病毒启动子和增强子序列的表达载体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及哺乳动物表达系统，以及尤其涉及用于在哺乳动物细胞中异源表达感 兴趣的核酸序列的包含嵌合启动子调控序列的表达构建体。嵌合启动子调控序列由源自鼠 或人巨细胞病毒的启动子序列和源自人和/或猴巨细胞病毒的上游区和/或增强子序列组 成，只要该序列元件源自至少两种不同的巨细胞病毒种。
【背景技术】
[0002] 使用包括原核和真核细胞的各种遗传工程改造的有机体生产用于基础研宄、诊断 和治疗应用的重组（多）肽和蛋白，如抗体分子、疫苗、激素和生长因子。然而，绝大多数的 重组肽或蛋白涉及翻译后修饰，当使用原核宿主细胞时翻译后修饰不能被模拟或再造。出 于这个原因，已证明哺乳动物基因表达系统代表了一个优选的选择。
[0003] 基于中国仓鼠卵巢（CHO)细胞的哺乳动物表达系统被广泛地应用在重组蛋白生 产中。除了淋巴细胞系，CHO细胞代表一些细胞类型中的一种，这些细胞类型允许简单有效 的高密度悬浮分批培养动物细胞。此外，使用CHO细胞导致高的产物产量，而淋巴细胞更难 于以工业规模培养。鉴于重组生产多肽和蛋白可观的成本，将每生物反应器运行的重组蛋 白产量最大化同样至关重要。那些对产物产量有相当大影响的过程参数包括尤其是细胞 培养条件、待表达的核酸（基因）的拷贝数、这些基因被转录和相应的mRNA被翻译的效率、 mRNA稳定性等。
[0004] 因此，控制基因表达的调控遗传元件的强度或转录活性的改进构成了为增加所生 产的重组蛋白产量特别关键的因素。即使是转录活性在单细胞水平上小的增量增加将最终 转化为高密度工业规模分批培养中产物产量相当大的改善。
[0005] 哺乳动物基因表达系统的绝大多数使用在源自病毒的启动子调控序列控制下编 码待表达的异源核酸序列的表达载体。在这些表达盒中两个最常用的病毒调控元件是人巨 细胞病毒（hCMV)即早期基因1和2 (IE1和IE2)的那些。然而，与使用hCMV IEl和IE2调 控元件相关联的一个缺点是它们显著的物种特异性。
[0006] 美国专利5, 866, 359公开可通过在弱启动子的控制下共表达腺病毒ElA蛋白改善 来自此类hCMV启动子的基因表达。ElA是一种多功能转录因子，它可以作用于细胞周期调 控，并且具有独立的转录激活和抑制功能结构域二者。ElA表达的微调对于实现基因反式激 活和对细胞周期进展的任何负面影响之间理想平衡是重要的。然而，ElA表达的过表达可 降低细胞合成感兴趣的重组蛋白的能力。
[0007] 美国专利5, 591，639描述了表达载体，其包含待表达的异源核酸序列的上游 (5'）、增强子、启动子和含有内含子A(即第一天然内含子）的人巨细胞病毒（hCMV-MIE) 主要即早期基因的完整5'非翻译区。然而，如果存在该序列（约2100bp的总长度）的前 400bp (5' -端），则在C0S7和CHO两种细胞中观察到不良的基因表达率（Chapman, B. S等人 (1991)Nucl. Acids Res. 19, 3979-3986)。
[0008] 鼠巨细胞病毒（mCMV)即早期基因调控元件的转录活性高于hCMV对应部分的转 录活性，而不表现出人序列所观察到的明显物种偏好（Addison, C. L等人（1987) J. Gen. Virol. 78, 1653-1661)。
[0009] 然而，试图通过插入mCMV IE启动子下游（3'）的鼠主要即早期基因的天然第一内 含子来提高mCMV IE启动子调控元件（类似于hCMV的对应部分）活性的尝试失败了（尤 其参考欧洲专利1 525 320 BI)。然而，产生包含嵌合盒的表达载体导致和使用完整人序列 时不相上下的产物产量，其中嵌合盒由mCMV IEl的调控元件和人主要即早期基因的天然第 一内含子组成（参见，例如WO 2006/111387A2)。对于包含mCMV IE2调控序列的表达载体 也获得了类似的基因表达率（尤其参见EP专利1 601 776 BI)。
[0010] 因此，仍然需要产生高产量的所生产的重组多肽或蛋白的改善的哺乳动物基因表 达系统。特别是，需要克服上述局限性的哺乳动物基因表达系统，即这样的表达系统基于所 述mCMV或hCMV启动子序列，但是比现有系统实现更高的表达率（以及因此，产物产量）。
[0011] 因此，本发明的一个目的是提供这样的基因表达系统，主要是适合的表达构建体 和相应的哺乳动物宿主细胞。
【发明内容】
[0012] 一方面，本发明涉及一种用于在哺乳动物细胞中异源表达感兴趣的核酸序列的表 达载体，所述载体包含可操作地连接至第一待表达的核酸序列的第一嵌合启动子调控序 列，其中所述嵌合启动子调控序列包含：
[0013] (i)启动子序列，其源自鼠巨细胞病毒或源自人巨细胞病毒，并且可操作地连接至 待表达的核酸序列的转录起始位点；以及
[0014] (ii)上游区和/或增强子序列，其源自人和/或猴巨细胞病毒，其中所述上游区和 /或增强子序列位于鼠或人启动子序列的5'并且可操作地连接至鼠或人启动子序列；并且
[0015] 其中所述嵌合启动子调控序列包含源自鼠巨细胞病毒、人巨细胞病毒和猴巨细胞 病毒中至少两种的序列元件。
[0016] 在具体的实施方式中，启动子序列源自鼠巨细胞病毒IEl启动子；和/或上游区和 /或增强子序列源自人和/或猴巨细胞病毒IEl增强子。
[0017] 在优选的实施方式中，鼠巨细胞病毒IEl启动子序列具有SEQ ID NO :4的核苷酸 序列。
[0018] 在其它【具体实施方式】中，启动子序列源自人巨细胞病毒IEl启动子；和/或上游区 和/或增强子序列源自人和/或猴巨细胞病毒IEl增强子。
[0019] 在优选的实施方式中，人巨细胞病毒IEl启动子序列具有SEQ ID NO :5的核苷酸 序列。
[0020] 在其它优选实施方式中，上游区和/或增强子序列包含源自猴巨细胞病毒IEl区 的SEQ ID NO :6的核苷酸序列。
[0021] 在尤其优选的实施方式中，嵌合启动子调控序列包含选自SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO : 11、SEQ ID NO :12 和 SEQ ID NO : 13 的核 苷酸序列。
[0022] 在其它具体的实施方式中，表达载体还包含可操作地连接至第二待表达的核酸序 列的第二嵌合启动子调控序列，其中第二嵌合启动子调控序列和第一嵌合启动子调控序列 相同。
[0023] 在替代的【具体实施方式】中，表达载体还包含可操作地连接至第二待表达的核酸序 列的第二嵌合启动子调控序列，其中第二嵌合启动子调控序列和第一嵌合启动子调控序列 不同。
[0024] 优选地，所述第一和第二待表达的核酸序列编码不同的多肽。在具体的实施方式 中，不同的多肽代表二聚体或多聚体蛋白的亚基。尤其优选地，所述二聚体或多聚体蛋白是 抗体分子。
[0025] 另一方面，本发明涉及一种哺乳动物宿主细胞，其转染有本文上述所限定的表达 载体。优选地，所述宿主细胞是CHO细胞。
[0026] 又一方面，本发明涉及一种用于在哺乳动物宿主细胞中异源表达感兴趣的核酸序 列的方法，其包括：
[0027] ⑴用本文上述所限定的表达载体转染哺乳动物宿主细胞；以及
[0028] (ii)在允许表达所述感兴趣的核酸序列的条件下培养转染的哺乳动物宿主细胞。
[0029] 在优选的实施方式中，转染是稳定的转染。
[0030] 另一方面，本发明涉及本文上述所限定的表达载体用于在哺乳动物宿主细胞中异 源表达感兴趣的核酸序列的用途。
[0031] 本发明的其它实施方式将通过如下详细的描述变得明显。
【附图说明】
[0032] 图1表示用作"亲本载体"用来产生本文所限定的哺乳动物表达载体的表达载体 pRY42(SEQ ID NO:l)。pRY42包含两个用于驱动异源基因表达的调控盒（分别在"mCMV" 和"pA"之间）：位于"Ex2"区3'（Sr下游"）的多克隆位点用于插入待表达的异源核酸序 列。调控盒两侧是突变（"F5-mFRT"）和野生型（"wFRT"）翻转酶识别靶位点。框内起始 蛋氨酸密码子已被添加到wFRT位点的5'端（"ATG+F"）。SV40早期启动子（"SV"）位于 ATG+F的5'（ "上游"）。异源核酸序列的转录由鼠巨细胞病毒IEl基因（"mCMV"）的启动 子驱动，鼠巨细胞病毒IEl基因的启动子之后是5'UTR，其中外显子I ( "Exl"）是鼠（"m"） 和人（"h"）CMV衍生序列的杂交体，并且其中外显子2( "Ex2"）和内含子A序列（"Int A"）源自hCMV序列。β内酰胺酶选择标记基因被表示为"bla"。pRY42被用作靶载体用于 克隆本文所限定的不同嵌合启动子调控序列。
[0033] 图2表示编码鼠人嵌合单克隆抗体（mAb)cB72. 3的轻（"LC"）和重（"HC"）链 的表达载体 pRY57(SEQ ID NO :2) (Whittle, N 等人（1987) Protein Eng. 1,499-505)，LC 和 HC分别位于"Ex2"区的3'克隆位点和聚腺苷酸化位点（"pA"）之间。其他方面，pRY57 和PRY42相同。除去pRY57的LC和HC核酸序列并将其克隆到pRY42变体中，在其中原始 的mCMV启动子序列被替换为本文所限定的不同嵌合启动子调控序列。
[0034] 图3示意性描绘包含在pRY42 (上部）中的原始mCMV启动子序列（SEQ ID NO :3) 以及如本文所限定的5个不同的嵌合启动子调控序列（构建体"1至5"）（分别为SEQ ID NO :7至SEQ ID NO : 11)，其包含位于源自猴（sCMV)和/或人（hCMV) CMV的上游区和/或增 强子元件3'的鼠 CMV(mCMV)启动子序列。此外，显示了如本文所限定的两个额外的嵌合启 动子调控序列（构建体"6和7"）（SEQ ID NO :12和SEQ ID NO :13)，其包含位于源自sCMV 和/或人hCMV的上游区和/或增强子元件3'的hCMV启动子序列。本文所特异性使用的 所有mCMV和hCMV启动子序列在它们的3' -末端包含额外的鸟嘌呤（"G"）核苷酸，其代表 转录起始位点。
[0035] 图4显示在稳定的CHO系生产的mAb cB72. 3的浓度比较，其中所述mAb序列的 基因表达在嵌合构建体1至5的控制下，如图3所示。使用补料分批过生长（FOG)规程在 E250摇瓶培养中的50ml生长介质中生长15天后，通过Protein A HPLC进行测定。对于每 一个嵌合构建体，η = 4,这代表重复补料分批分析用于一式两份的转染，构建体4例外，其 中η = 6 (重复FOG分析用于一式三份的转染），以及pRY57 (原始mCMV)，其中η = 8,组合 实验1和2中的数据点。
[0036] 图5显示在稳定的CHO系生产的mAb CB72.3的浓度比较，其中所述mAb序列的基 因表达在嵌合构建体6和7的控制下，如图3所示。使用分批过生长（BOG)规程在Ε125摇 瓶培养中的30ml生长介