专利名称：启动子BGIosP514及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种启动子，特别是涉及一种来源于水稻的启动子BGIOSP514，及其用 于调控植物目的基因表达的用途。
背景技术：
启动子是基因的一个组成部分，通常位于结构基因5’端上游，是RNA聚合酶识别、 结合和开始转录的一段DNA序列。启动子能够指导全酶(holoenzyme)同模板正确结合，活 化RNA聚合酶，启动基因转录，从而控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。在转 基因植物中，启动子是影响转基因表达效率的重要因素之一，选择高效率的启动子是高效 率表达外源基因的关键。根据启动子的转录模式可将其分为3类组成型启动子、组织或器官特异性启动 子和诱导型启动子。所谓组成型启动子是指在组成型启动子调控下，不同组织器官和发育 阶段的基因表达没有明显差异，因而称之组成型启动子。双子叶植物中最常使用的组成型 启动子是花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子。另一种高效的组成型启动子CsVMV是从木薯 叶脉花叶病毒(cassava vein mosaic virus)中分离的。人们高度重视从植物本身克隆组成型启动子。例如肌动蛋白(actin)和泛素 (ubiquitin)等基因的启动子已被克隆。用这些启动子代替CaMV 35S启动子，可以更有效 地在单子叶植物中驱动外源基因的转录。Naomi等分别从拟南芥的色氨酸合酶β亚基基因 和植物光敏色素基因中克隆了相应启动子，用其代替CaMV 35S启动子，在转基因烟草中也 取得了很好的表达效果(Plant biotechnology, 2002,19(1) :19-26)。单子叶植物基因中常见的启动子有山bi启动子(Plant ubiquitinpromoter)、 Act in 启动子(Plant Actin promoter)禾口 Adh-I 启动子(Maize alcohol dehydrogenase lpromoter)。Ub i启动子以其启动效率高、甲基化程度低、遗传性状稳定等因素而倍受青睐。目 前，已经从很多泛素基因中分离得到启动子序列，包括玉米基因组中的证i-1启动子、水稻 泛素RUBQ2启动子、拟南芥泛素启动子、向日葵泛素WdBI启动子、烟草泛素Ub i. U4启动 子、马铃薯泛素证i 7启动子、番茄泛素证il-Ι启动子，大麦泛素Mubl启动子。玉米泛 素证i-Ι启动子已经广泛地应用于玉米、小麦、水稻等单子叶植物中，水稻泛素RUBQ2启动 子在水稻和甘蔗中也有较多的应用。Actin启动子1990年由康奈尔大学的McElroy等首次在水稻中发现，属于强组成 型启动子。Actin启动子在单子叶禾本科中作用显著，但是邻近科属的植物中的基因调控功 能却十分不理想。因此，许多相关研究通过其他单子叶植物寻找Actin启动子，并成功在香 蕉、甜瓜、玉米和拟南芥中陆续发现。Actin启动子由于对基因表达的强调控作用，在单子叶 植物优良性状的转基因中已经得到越来越广泛的应用。Adh-I启动子调控ADH(alcohol dehydrogenase)基因，对植物在缺氧环境下乙醇 脱氢酶的表达至关重要。Adh-I启动子对单子叶植物特别是谷类植物如水稻、燕麦和大麦，和少部分双子叶植物如烟草，基因的调控功能比CaMV (花椰菜花叶病毒CaMV) 35S启动子提 高10-50倍。Adh-I启动子主要应用于单子叶植物，对绝大部分双子叶植物基因表达的调控 效果都很有限。单子叶植物是被子植物的主要类群，单子叶植物中的禾本科、百合科、棕榈科和天 南星等，是非常重要的农业作物。单子叶植物基因的强效启动子，能够调控植物高效率表达 具有特殊性状的外源基因，对优良作物的分子育种研究意义重大。在强效启动子相关研究领域，发现并验证了许多单子叶植物的启动子。此外，双子 叶植物中的一些强效启动子如CsVMV(Cassava VeinMosaic Virus)启动子、番茄E8启动 子、白藜芦醇合酶基因Vstl启动子等高效启动子，在单子叶植物中也有很强的基因调控作 用。尽管已经有上述已知的单子叶植物的启动子，本发明人通过对水稻基因组的深入 研究，提供了一种新的单子叶植物启动子，所述启动子能够用于调控单子叶植物中目的基 因的表达，同时为研究单子叶植物中目的基因表达提供了一种新的工具和选择。
发明内容
本发明的一个方面涉及一种启动子，所述启动子含有选自以下任意一组并具有启 动子功能的核苷酸序列a、Seq ID NO 1所示的核苷酸序列；以与kq ID NO 1互补的核苷酸序列；C、在高等严紧条件下能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核 苷酸序列；e、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。所述SEQ ID NO 1的序列如下TTAACACTAGTTTGTATATATGGTCTAGCCGGTGTGCTGACATCCGATACCGTGCGCGGCGACGGGGTA GACGAAGTGGTCGGGGCCGTGCTGCGCGTGGACGACGACGACCGAAACGGCGCCGGCGCGGCGCCCGATGACGTTGT CCAGCGCCCACGACAGCGCGTTCAGGCTCTCCTCGCTCGCGTCCACGGCCACCACCACCTTCATCGTCCCCGCCGCC GCTCCCGGCTCCCCGCTCGTCGCCGCCGCCGCCGCGGGAGACGCGCCCTTCTCCTCCATCTCGCAGTCGCTCTCTCA CTAGTTTACCTGTCGCGCCGTGTGTTCACGGTTCACTACCACCAGATGATCGATCACACACACACTCCCGTGTCCCG TGCTCTATATATATACGCGCACAGCCACAGAAGGCGCCGGGGTTGCGTCGTCCCCTGTTTTGTCGCGTGGACGGCGC GGGATAGAGATGACCGGCCGGAACCCACCCACCGCCACGCGCGGGGGCGGCCGTTTTTGTTCGCTACTTGGGGCGAC ACGTTTCTCGCTTTCTCCCCTTCTCCTGCGCGCGTTTGCACCTTTGCGTTCGTCTCATCTGGCTTCCCCCCGCATGG TAAGCATTCATCCCTATCCCTCCCTCCCAGGATGTGCGATCCGGACAGCTGCCCCCGGTTTCGCTGCACCGGCGCCA TGCGTGCCGCATGCGTGCCAGGGCGTACAAACACATATACATCTTGCCAGTTGCCACCGCACCGGCAGCATCTCTGC ATCAGTTGTTGCGTTGAGCTGGTAAGGGACAAGGCTACCTGCTGATTTAGTTTTCTGGATGTGTGTTGCGTTTGTTC AGATCACCGTGGCACAGGTTTGAGTTCTTGGCACTCCAATCTGCATGCATGATGCGTGCTTGTAGCTGTATCCAAGG AGGAGATAGTGCTGAATAAAGGATTTACAAGGCAGCGAGGGTGTGTATAGTTCACACCAAAATTGAAATTGAAAGTT TAGTTAAAATTGAAACGATGCGACGAAAAAGTTGAAAGTTTGTGTGTGTAAGAAAGTTTTGATGTGAAAGAAAAATT GGAAGTTTGAAGAAAAATTTTGAAACTAAACTCGATCGGCCTGAATGAGAGATTTCACTCCCACACAAGTCAACTGAGAACATCGTCGATGG(SEQ ID NO :1)。在本发明中，将SEQ ID NO 1所示的启动子序列称为启动子BgIosP514，或简称为 P 514启动子。带有该启动子和β -葡萄糖苷酸酶(β _g lUctoonidase，⑶S)基因的水稻愈伤组 织经GUS染色后，所述水稻愈伤组织变为蓝色。带有该启动子和GUS基因的水稻和烟草小 苗经⑶S染色后，水稻和烟草的根、叶均呈现蓝色。典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性 程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严紧性”典 型地发生在约Tm-5°C (低于探针Tm 5°C )；“高等严紧性”发生在Tm以下约5_10°C;“中等 严紧性”发生在探针Tm以下约10-20°C ；“低严紧性”发生在Tm以下约20_25°C。作为替 代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗 涤为依据。例如，6XSSC =极低严紧性；3XSSC =低至中等严紧性；IXSSC =中等严紧性； 0. 5XSSC =高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一 或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80%或更多序列同 一性的核酸序列。对于要求高选择性的应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如， 选择相对低的盐和/或高温度条件。Sambrook等(Sambr00k，J.等(1989)分子克隆，实验 室手册，ColdSpring HarborPress,Plainview,N. Y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧性 在内的杂交条件。为便于说明，用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中度严紧 条件包括用 5XSSC、0. 5% SDS、1. OmM EDTA(ρΗ8· 0)溶液预洗；在 50_65°C下在 5XSSC 中 杂交过夜；随后用含0. 1% SDS的2X、0. 5X和0.2XSSC在65°C下各洗涤两次20分钟。 本领域技术人员应当理解，能容易地操作杂交严紧性，如改变杂交溶液的含盐量和/或杂 交温度。例如，在另一个实施方案中，合适的高度严紧杂交条件包括上述条件，不同之处在 于杂交温度升高到例如60-65°C或65-70°C。在本发明中，所述在高等严紧条件下与SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列杂交的核 苷酸序列，其具有与SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。在本发明中，所述对SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、 缺失、添加修饰的核苷酸序列，是指分别或同时在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和 /或序列内部进行例如不超过2-45个，或者不超过2-30个，或者不超过3-20个，或者不超 过4-15个，或者不超过5-10个，或者不超过6-8个的分别用逐个连续整数表示的碱基的取 代、缺失、添加修饰。在本发明中，所述对SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列进行如上述一个或多个碱基 的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列具有与SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列相同或相似的 启动子活性。通过一种多核苷酸进行说明，其所具有的核苷酸序列例如与SEQID NO 1的参考 核苷酸序列至少具95%的“同一性”是指在SEQ IDNO 1的参考核苷酸序列之每100个核 苷酸中，该多核苷酸的核苷酸序列除了含有多达5个核苷酸的不同外，该多核苷酸之核苷 酸序列与参考序列相同。换句话说，为了获得核苷酸序列与参考核苷酸序列至少95%相同的多核苷酸，参考序列中多达5%的核苷酸可被删除或被另一核苷酸替代；或可将一些核 苷酸插入参考序列中，其中插入的核苷酸可多达参考序列之总核苷酸的5% ；或在一些核苷 酸中，存在删除、插入和替换的组合，其中所述核苷酸多达参考序列之总核苷酸的5%。参考 序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在这些末端位置之间的 任意地方，它们或单独散在于参考序列的核苷酸中，或以一个或多个邻近的组存在于参考 序列中。在本发明中，用于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法是例如BLAST和 BLAST 2.0 算法，它们分别描述在 Altschul 等(1977)Nucl. Acid. Res. 25 :3389-3402 和 Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403_410。采用例如文献中所述或者默认参数，BLAST 和BLAST 2.0可以用于确定本发明的核苷酸序列同一性百分数。执行BLAST分析的软件可 以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。在本发明中，所述与SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一 性的核苷酸序列包括与SEQ ID NO :1所公开序列基本同一的多核苷酸序列，例如当采用本 文所述方法(例如采用标准参数的BLAST分析)时，与本发明多核苷酸序列相比含有至少 90%序列同一性、优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的 序列同一性的那些序列。在本发明中，所述与SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性 的核苷酸序列具有与SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。在本发明中，所述的启动子来源于单子叶植物，具体地，所述单子叶植物为水稻， 例如所述水禾S为曰本晴(Oryza sativaL. ssp. japonica cv. Nipponbare)。本发明的另一方面涉及一种核酸构建体，其包含本发明所述的启动子，与启动子 可操作连接的基因序列，其中所述启动子与所述基因序列来源相同或者不同。在本发明的 一个实施方案中，所述基因为GUS基因。本发明的另一方面涉及一种载体，其特征在于，所述载体含有本发明所述的核苷 酸序列或核酸构建体，所述载体可以通过例如将上述核苷酸序列或核酸构建体插入克隆载 体或表达载体而得到，或者可以通过人工合成得到。在本发明的实施方案中，所述载体为本发明的启动子或启动子与GUS基因可操作 连接的核酸构建体与PMD18-T或p8质粒经重组得到的重组载体pMD18-T+P514或p8+P514。适于构建本发明所述重组载体的克隆载体包括但不限于，例如pUC18、pUC19、 pUC118、pUC119、pMD19-T、pMD20-T、pMD18-T SimpleVecter、pMD19_T Simple Vecter 等。适于构建本发明所述的表达载体包括但不限于，例如pBI 121、pl3W4、pGEM等。本发明的另一方面涉及一种含有本发明所述载体的重组细胞，所述重组细胞可以 通过将含有本发明所述的载体转化至宿主细胞而得到。适于构建本发明所述重组细胞的宿主细胞包括但不限于，例如根癌农杆菌细胞 LBA4404、EHA105、GV 3101 等。在本发明的一个实施方案中，所述重组细胞为重组农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105-P514o本发明的还一方面涉及一种植物愈伤组织或外植体，其特征在于，所述愈伤组织 或外植体转化有本发明的核苷酸序列和/或核酸构建体和/或载体和/或感染有本发明的重组细胞。外植体可以为植物的胚、胚乳、子叶、幼苗、茎尖、根、茎、叶等，在本发明的一个实 施方案中，为烟草的叶。在本发明的另一个实施方案中，所述愈伤组织为水稻愈伤组织。本发明的还一方面涉及一种转基因植物，其特征在于，所述转基因植物转化有本 发明的核苷酸序列和/或核酸构建体和/或载体和/或感染本发明的重组细胞。本发明的还一方面涉及用于扩增本发明所述启动子的引物对，其特征在于 所述引物对的两条引物分别含有序列TTAACACTAGTTTGTATATATGG (SEQ ID NO 2)和 CCATCGACGATGTTCTCAGT(SEQ ID NO 3)；优选的，所述引物对的两条引物在5，端还分别连接 有限制性酶切位点和/或保护碱基。在本发明的一个实施方案中，所述引物对的两条引物 分别具有^^ ID NO :4禾Π Seq ID NO :5所示的序列。本发明的还一方面涉及制备SEQ I D NO :1所示的启动子的方法，包括以水稻日本 晴基因组DNA为模板，使用一对扩增引物进行扩增，所述扩增引物根据SEQ ID Ν0:1在水稻 日本晴gDNA中的序列分别针对首尾进行设计，例如为本发明所述的引物对。本发明的还一方面涉及一种调控植物中目的基因表达的方法，所述方法包括将本 发明的核苷酸序列和/或核酸构建体和/或载体转化入植物愈伤组织或外植体中的步骤， 或用本发明的重组细胞感染植物愈伤组织或外植体的步骤。在本发明的一个实施方案中，所述目的基因为⑶S基因。在本发明的一个实施方案中，将含有重组载体P8+P514的重组细胞EHA105-P514 转化入水稻愈伤组织中，水稻愈伤组织分化为水稻苗，愈伤组织和水稻苗经⑶S染色均证 明⑶S基因已表达。在本发明的另一个实施方案中，将含有重组载体p8+P514的重组细胞 EHA105-P514转化入烟草叶中，烟草叶经组织培养发育为烟草苗，烟草苗经⑶S染色证明 ⑶S基因已表达。为实现上述调控目的基因表达的目的，本发明所述启动子可以以单拷贝和/或多 拷贝的形式应用，也可以与现有技术中已知的启动子联用。在本发明中，可采用植物基因转化技术将目的基因插入到植物基因组中，包括农 杆菌介导转化、病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电穿孔等。本领域周 知，农杆菌介导的基因转化常被用于单子叶植物和双子叶植物的基因转化，但其它转化技 术也可用于本发明所述单子叶植物的基因转化。当然，适于本发明的转化单子叶植物的另 一种方法是粒子轰击(显微金或钨粒子包覆转化的DNA)胚性愈伤组织或胚胎开发。另外， 还可以采用的转化单子叶植物的方法是原生质体转化。基因转化后，采用通用的方法来筛 选和再生整合有表达单元的植株。本发明的还一方面涉及一种制备转基因植物的方法，包括在有效产生植物的条件 下培养本发明的重组细胞或植物愈伤组织或植物外植体。本发明的还一方面涉及本发明的核苷酸序列和/或核酸构建体和/或载体和/或 重组细胞用于调控植物目的基因表达的用途，以及用于制备转基因植物或用于植物育种的 用途。在本发明的一个实施方案中，目的基因为GUS基因。本发明的还一方面涉及本发明的愈伤组织或外植体用于制备转基因植物或用于植物育种的用途。在本发明中，所述植物优选是单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物优选为 稻属植物，例如水稻或旱稻，所述双子叶植物优选为烟草属植物，例如烟草或花烟草。所述单子叶植物包括但不限于水稻、谷子、小麦、高粱、玉米，优选为水稻，所述水 稻包括但不限于，中花9、中花10、中花11、台北309、丹江8号、云稻2号、汕优63、汕优608、 丰优22，黔优88,11优416,11优107,11优128,11优718、准两优527、川农1号、杂0152、 皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻 193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101(上 述水稻品种均可购自安徽徽商农家福有限公司)。在本发明的一个实施方案中，所述水稻为 日本晴。所述双子叶植物包括但不限于烟草、大豆，马铃薯、蚕豆、萝卜、花生，优选为烟草， 所述烟草包括但不限于K326、K346, K394、NC82、NC89、G140、G28、G80以及中烟90，在本发 明的一个实施方案中，所述烟草为烟草NC89。水稻或烟草是典型的基因工程模式植物，本发明选择水稻或烟草进行转基因研 究，以证明本发明的启动子在单子叶植物或双子叶植物中的效果。实验结果表明，该启动子 能在转基因水稻或烟草中起作用。发明的有益效果发明人通过生物信息学研究获得，并采用生物学实验验证了所述启动子P514的 功能。启动子P514可以用于调控单子叶植物或双子叶植物目基因的表达，具体地，所述启 动子能够在水稻和烟草中调控GUS基因表达。本发明为研究单子叶植物或双子叶植物基因 表达提供了新的工具和选择。关于牛物材料保藏的说明本发明涉及以下生物材料烟草NC89种子2010年11月12日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保 藏中心，即中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号CCTCC No :P201017。
图 lpCAMBIA-1301 质粒示意图。图2p8质粒示意图。图3经转化的水稻愈伤组织的⑶S染色结果。其中，转化有重组根癌农杆菌 P8+P514转化的水稻愈伤组织(右)经GUS染色后呈现蓝色；转化有重组根癌农杆菌p8质 粒的水稻愈伤组织(对照，左)经⑶S染色后颜色未发生变化。图4经转化的水稻苗的根的⑶S染色结果。其中，转化有重组根癌农杆菌P8+P514 的水稻苗的根(右)经GUS染色后呈现蓝色；转化有重组根癌农杆菌p8质粒的水稻苗的根 (对照，左)经⑶S染色后颜色未发生变化。图5经转化的水稻苗的叶的⑶S染色结果。其中，转化有重组根癌农杆菌P8+P514 的水稻苗的叶(右)经GUS染色后呈现蓝色；转化有重组根癌农杆菌p8质粒的水稻苗的叶 (对照，左)经⑶S染色后颜色未发生变化。图6经转化的烟草苗的根的⑶S染色结果。其中，转化有重组根癌农杆菌P8+P514的烟草苗的根(右)经GUS染色后呈现蓝色；转化有重组根癌农杆菌p8质粒的烟草苗的根 (对照，左)经⑶S染色后颜色未发生变化。 图7经转化的烟草苗的叶的⑶S染色结果。其中，转化有重组根癌农杆菌P8+P514 的烟草苗的叶(右)经GUS染色后呈现蓝色；转化有重组根癌农杆菌p8质粒的烟草苗的叶 (对照，左)经⑶S染色后颜色未发生变化。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市购获得的常规产品。其中N6D培养基、YM液体培养基、YM固体培养基、AAM培 养基和N6-AS共培养基的配制方法参见发明申请“一种启动子BgIosP587、其制备方法及用 途”，申请号:200910238992. 0，
发明者倪雪梅, 孙红正, 张耕耘, 李宁 申请人:深圳华大基因科技有限公司