专利名称：一种可预测原发性肝癌病人手术后肝癌转移复发的方法
技术领域：
本发明涉及一种可预测原发性肝癌病人手术后肝癌转移复发的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
肝癌是我国第二位癌症死因，手术是目前主要的治疗手段。然而术后高转移复发率(5 年复发率达70%，小肝癌也达50%)已成为进一步提高远期疗效的瓶颈，也是攻克肝癌的 重要关键。若能对肝癌根治术后的特定人群进行早期转移复发的预测，及时给予干预治疗， 做到早发现早治疗，会进一步提高根治性术后复发患者的生存率，也会有很大的社会效益 和经济效益。
近年来癌周微环境在肿瘤发生及进展中的作用成为肿瘤研究的热点。许多研究也显示 Thl/Th2免疫的失衡与多种肿瘤相关。然而，这方面研究大多都主要集中于基因水平，基 因水平研究的明显缺陷是这种变化不一定反应在蛋白水平或功能上。而目前可用于疾病诊 断的检测都是以蛋白为基础的。蛋白不像基因那样可以复制，蛋白检测的敏感性就成了关 键问题，尤其对低丰度蛋白的检测一直是一个难题，以前的研究表明，细胞因子如干扰 素Y,白细胞介素2,肿瘤坏死因子等很难在组织抽提物中检测到。现有从组织中抽提蛋白的 方法由于配方和抽提程序的原因，蛋白多不易溶解，抽提后会大量丢失，另外就是含有大 量碱使得抽提物不适合于下游蛋白检测中的抗原抗体结合反应。
目前临床尚无足够敏感和特异的预测指标来预测肝癌术后患者的转移复发以及生存 情况，甲胎蛋白、肿瘤大小，包膜有无等虽与转移复发有关但总体来说其预测准确率还很 低。
发明内容
本发明的目的是找到一种可预测原发性肝癌病人手术后肝癌转移复发的方法。
为了达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种可预测原发性肝癌病人手术后肝癌
转移复发的方法，其特征在于，具体步骤为
第 一 步将3-[(3_胆酰氨基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐 (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonic acid， CHAPS)、 二硫苏、糖醇(DL-Dithiothreito1, DTT)、乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid， EDTA)、 苯甲基石黄酰氟(Phenylmethanesulfonyl
3fluoride, PMSF)、抑胃肽(P印statin A)和亮抑蛋白酶肽(Leup印tin)溶于pH7.0-7.5的磷酸
盐缓冲溶液中，使3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐终浓度为3-28mM、 二硫 苏糖醇终浓度为10-80mM、乙二胺四乙酸终浓度为2-35mM的、苯甲基磺酰氟终浓度为 0.2-8mM、抑胃肽终浓度为0.5-9.8 mM、亮抑蛋白酶肽终浓度为0.5-11mM，配成蛋白抽 提液；
第二步将冰冻的肝癌癌周组织放于液氮中，砸成粉末状，加入第一步得到的蛋白抽 提液，混旋器上混匀，其中肝癌癌周组织与第一步得到的蛋白抽提液的用量比为1g : 1.8ml-1g :45ml，以功率70-150瓦超声5-7次，每次3-15秒，然后在2-10。C离心30-90 分钟，吸取上清液，在20-80。C保存；
第三步将第二步得到的上清液用pH7.0-7.5的磷酸盐缓冲溶液配成浓度为4ug/ul 的溶液，测定其中的白细胞介素2、白细胞介素15和白细胞介素5的浓度，用于预测肝癌 患者术后的转移复发和肝癌患者术后的生存或死亡，当白细胞介素2浓度低于25. 76pg/ml， 白细胞介素15浓度低于37. 16pg/ml，或白细胞介素5浓度低于23. 173 pg/ml，肝癌患者 术后易转移复发，当白细胞介素2浓度低于25.76pg/ral，肝癌患者术后易死亡。
在133例患者的癌周组织中白细胞介素2、白细胞介素15和白细胞介素5能较准确地 预测肝癌患者术后的转移复发，准确率分别为69.2%、 61.7%、 61.7%，白细胞介素2还可 以预测肝癌患者术后的生存或死亡，准确率为72.9%。
本发明具有以下优点
1. 本发明中组织蛋白抽提液适合于抽提组织中的低丰度蛋白，此抽提方法抽提的蛋白 处于合适的PH值范围更宜于蛋白的检测，尤其是应用抗原和抗体结合反应的检测体系， 如酶联免疫吸附试验和蛋白芯片。
2. 白细胞介素2、白细胞介素15和白细胞介素5明显优于目前用于预测肝癌患者术 后复发和生存的临床指标，如甲胎蛋白、肿瘤大小，包膜有无等。而且测定这些白细胞介 素简单易行且无创。
图1为白细胞介素2、白细胞介素15和白细胞介素5对肝癌患者术后的转移复发的预 测情况图2为白细胞介素2的无瘤生存曲线； 图3为白细胞介素2的总生存曲线； 图4为白细胞介素15的无瘤生存曲线；
4图5为白细胞介素5的无瘤生存曲线。
具体实施例方式
实施例l
一种可预测原发性肝癌病人手术后肝癌转移复发的方法，其特征在于，具体步骤为 第一步将3-[(3_胆酰氨基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐、二硫苏糖醇、乙二胺四乙酸、
苯甲基磺酰氟、抑胃肽和亮抑蛋白酶肽溶于pH7.0的磷酸盐缓冲溶液中，使3-[(3-胆酰 氨基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐终浓度为3mM、 二硫苏糖醇终浓度为10mM、乙二胺四 乙酸终浓度为2mM的、苯甲基磺酰氟终浓度为0.2mM、抑胃肽终浓度为0.5mM、亮抑蛋 白酶肽终浓度为0.5mM，配成蛋白抽提液；
第二步将冰冻的肝癌癌周组织放于液氮中，砸成粉末状，加入蛋白抽提液，混旋器
上混匀，其中肝癌癌周组织与第一步得到的蛋白抽提液的用量比为1g : 1.8ml，以功率70 瓦超声5次，每次3秒，然后在2。C离心30分钟，吸取上清液，在20。C保存；
第三步将第二步得到的上清液用pH7.0的磷酸盐缓冲溶液配成浓度为4ug/ul的溶 液，测定其中的白细胞介素2、白细胞介素15和白细胞介素5的浓度，用于预测肝癌患者 术后的转移复发和肝癌患者术后的生存或死亡，当白细胞介素2浓度低于25.76pg/ml，白 细胞介素15浓度低于37. 16pg/ml，或白细胞介素5浓度低于23. 173 pg/ml，肝癌患者术 后易转移复发，当白细胞介素2浓度低于25.76pg/ml，肝癌患者术后易死亡。
实施例2
一种可预测原发性肝癌病人手术后肝癌转移复发的方法，其特征在于，具体步骤为 第一步将3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐、二硫苏糖醇、乙二胺四乙酸、 苯甲基磺酰氟、抑胃肽和亮抑蛋白酶肽溶于pH7.5的磷酸盐缓冲溶液中，使3-[(3-胆酰 氨基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐终浓度为28mM、 二硫苏糖醇终浓度为80mM、乙二胺四 乙酸终浓度为35mM的、苯甲基磺酰氟终浓度为8mM、抑胃肽终浓度为9.8 mM、亮抑蛋 白酶肽终浓度为11mM，配成蛋白抽提液；
第二步将冰冻的肝癌癌周组织放于液氮中，砸成粉末状，加入蛋白抽提液，混旋器 上混匀，其中肝癌癌周组织与第一步得到的蛋白抽提液的用量比为1g:45ml，以功率150 瓦超声7次，每次15秒，然后在10。C离心90分钟，吸取上清液，在80。C保存；
第三步将第二步得到的上清液用pH7.5的磷酸盐缓冲溶液配成浓度为4ug/ul的溶 液，测定其中的白细胞介素2、白细胞介素15和白细胞介素5的浓度，用于预测肝癌患者 术后的转移复发和肝癌患者术后的生存或死亡，当白细胞介素2浓度低于25.76pg/ml，白细胞介素15浓度低于37. 16pg/ml，或白细胞介素5浓度低于23. 173 pg/ml，肝癌患者术 后易转移复发，当白细胞介素2浓度低于25.76pg/ml，肝癌患者术后易死亡。
实施例3
一种可预测原发性肝癌病人手术后肝癌转移复发的方法，其特征在于，具体步骤为
第一步将3-[(3_胆酰氨基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐、二硫苏糖醇、乙二胺四乙酸、 苯甲基磺酰氟、抑胃肽和亮抑蛋白酶肽溶于pH7.2的磷酸盐缓冲溶液中，使3-[(3_胆酰 氨基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐终浓度为10mM、 二硫苏糖醇终浓度为45mM、乙二胺四 乙酸终浓度为17mM的、苯甲基磺酰氟终浓度为4mM、抑胃肽终浓度为5 mM、亮抑蛋 白酶肽终浓度为5mM，配成蛋白抽提液；
第二步将冰冻的肝癌癌周组织放于液氮中，砸成粉末状，加入蛋白抽提液，混旋器 上混匀，其中肝癌癌周组织与第一步得到的蛋白抽提液的用量比为1g:25ml，以功率120 瓦超声6次，每次8秒，然后在5。C离心60分钟，吸取上清液，在50。C保存；
第三步:将第二步得到的上清液用pH7.2的磷酸盐缓冲溶液配成浓度为4ug/ul的溶液， 测定其中的白细胞介素2、白细胞介素15和白细胞介素5的浓度，用于预测肝癌患者术后 的转移复发和肝癌患者术后的生存或死亡，当白细胞介素2浓度低于25.76pg/ral，白细胞 介素15浓度低于37. 16pg/ml，或白细胞介素5浓度低于23. 173 pg/ml，肝癌患者术后易 转移复发，当白细胞介素2浓度低于25.76pg/ml，肝癌患者术后易死亡。
癌周肝组织中Thl和Th2细胞因子浓度的检测
将实施例3得到的每个样本取4ug/ul抽提蛋白共100ul用于酶联免疫吸附试验检测。 与肝癌转移复发及生存密切相关的Thl/Th2细胞因子
1. 如图1所示，其中a代表白细胞介素2， b代表白细胞介素15， c代表白细胞介素 5，受试者工作特征曲线显示白细胞介素2、白细胞介素15和白细胞介素5可以预测肝癌 患者术后的转移复发。它们曲线下的面积分别是0. 627、 0. 633、 0. 602， P值分别为0. 013、 0.009、 0.046。
2. Kaplan-Meier生存和复发分析显示IL-2以25. 76pg/ml为分类标准，IL-15以 37. 16pg/ml为分类标准，IL-5以23. 173 pg/ml为分类标准，如图2所示，其中，a代表白细 胞介素2低组，b代表白细胞介素2高组，低水平IL-2比高水平IL-2病人复发率明显升高Co =3.48E-8)、如图3所示，其中，a代表白细胞介素2低组，b代表白细胞介素2高组，生存期 明显更短(P = 0.02);如图4所示，其中，a代表白细胞介素15低组，b代表白细胞介素15高组，低水平IL-15比高水平IL-15病人明显复发率升高(^0.004);如图5所示，其中， a代表白细胞介素5低组，b代表白细胞介素5高组，低水平IL-5比高水平IL-5病人明显复发 率升高(；^0.02)。如表1所示，IL-2， IL-15和IL-5均是复发的预测指标。
3. IL-2以25. 76pg/ml为参考值，低于25. 76pg/ral预测为转移复发，高于25. 76pg/ml预 测为不转移复发，IL-2预测转移复发准确率69.2%.以同样参考值IL-2预测生存准确率 72. 9%. IL-15以37. 16pg/ml为参考值，低于37. 16pg/ml预测为转移复发，高于37. 16pg/ml预 测为不转移复发，比-15预测转移复发准确率61.7%. IL-5以23. 173 pg/ml为为参考值，低于 23.173 pg/ml预测为转移复发，高于23. 173 pg/ml预测为不转移复发，IL-5预测转移复发 准确率也为61. 7%.
表1.比例风险模型分析与肝癌复发相关的因素
单因素分析
多因素分析
临床参数
风险比例
(95%可信区间V
p值
风险比例
(95%可信区间)'
P值
性别(男/女)
年龄(》50岁/<50岁) 乙肝表面抗原(阳性/阴 性)
肝炎史(无/有) 甲胎蛋白(》300 ng/ml / <300 ng/ml) 谷丙转氨酶(^50 U/I/ <50 U/I)
白蛋白(》0.15g/1 / >0.15g/l)
肿瘤大小(^3cm / <3 cm)
1.37(0.67-2.80) 1.16(0.68-1.98)
2.07(0.65-6.63) 0.84(0.43-1.62)
1.16(0.66-2.05)
1.07(0.63-1.83)
1.08(0.39-2.98)
1.36(0.74-2.5)
.387 590
.221 ■593
597
.792
888
.316肿瘤包膜(没有/完
整)1.33(0.78-2.27).290
肿瘤分化(l-ll期/川-IV
期)1.33(0.67-2.64).414
肝硬化(无/有)3.35(0.82-13.76).093
Child-Pugh分级法(B
/ A)0.40(0.06-2.92).369
Th1型细胞因子(低/
咼)
干扰素1,71(1.01-2.91).047
白细胞介素1A1,64(0,89-3.02).109
白细胞介素1B1.54(0.83-2.88).171
白细胞介素24.83(2.59-9.00)7.16E-7
肿瘤坏死因子1.70(1.00-2.89).049
白细胞介素12p401.18(0.69-2.01).552
白细胞介素12p701.56(0.89-2.75).120
白细胞介素152.31(1.27-4.18)掘
Th2型细胞因子(低/
咼)
白细胞介素41.79(1.01-3.17).046
白细胞介素51.83(1.08-3.11).025
白细胞介素81.67(0.88-3.16).118
白细胞介素101.33(0,76-2,32).313
白细胞介素2和白细
胞介素15相结合
总 1.94E-6
l组/川组 6.59(3.14-13.83) 6.41E-7
II组/lll组 1.72(0.91-3.25) .093
0.88(0.42-1.83) 0.727
3.81(1.89-7.67) 1,84E-4
0.86(0.38-1.96) 0.726
1.6攀79-3.44) 0.化7
1.42(0.73-2.74) 0.300
124(0.64-2.39) 0.529
8
权利要求
1. 一种可预测原发性肝癌病人手术后肝癌转移复发的方法，其特征在于，具体步骤为第一步将3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐、二硫苏糖醇、乙二胺四乙酸、苯甲基磺酰氟、抑胃肽和亮抑蛋白酶肽溶于pH7.0-7.5的磷酸盐缓冲溶液中，使3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐终浓度为3-28mM、二硫苏糖醇终浓度为10-80mM、乙二胺四乙酸终浓度为2-35mM、苯甲基磺酰氟终浓度为0.2-8mM、抑胃肽终浓度为0.5-9.8mM、亮抑蛋白酶肽终浓度为0.5-11mM，配成蛋白抽提液；第二步将冰冻的肝癌癌周组织放于液氮中，砸成粉末状，加入第一步得到的蛋白抽提液，混旋器上混匀，其中肝癌癌周组织与第一步得到的蛋白抽提液的用量比为1g1.8ml-1g45ml，以功率70-150瓦超声5-7次，每次3-15秒，然后在2-10℃离心30-90分钟，吸取上清液，在20-80℃保存；第三步将第二步得到的上清液用pH7.0-7.5的磷酸盐缓冲溶液配成浓度为4ug/ul的溶液，测定其中的白细胞介素2、白细胞介素15和白细胞介素5的浓度，用于预测肝癌患者术后的转移复发和肝癌患者术后的生存或死亡，当白细胞介素2浓度低于25.76pg/ml，白细胞介素15浓度低于37.16pg/ml，或白细胞介素5浓度低于23.173pg/ml，肝癌患者术后易转移复发，当白细胞介素2浓度低于25.76pg/ml，肝癌患者术后易死亡。
全文摘要
本发明提供了一种可预测原发性肝癌病人手术后肝癌转移复发的方法，具体步骤为将3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐、二硫苏糖醇、乙二胺四乙酸、苯甲基磺酰氟、抑胃肽和亮抑蛋白酶肽溶于pH7.0-7.5的磷酸盐缓冲溶液中，配成蛋白抽提液；将冰冻的肝癌癌周组织放于液氮中，砸成粉末状，加入蛋白抽提液，混旋器上混匀，超声，离心，吸取上清液，在20-80℃保存；测定上清液中的白细胞介素2、白细胞介素15和白细胞介素5的浓度，用于预测肝癌患者术后的转移复发和肝癌患者术后的生存或死亡。本发明的白细胞介素2、白细胞介素15和白细胞介素5明显优于目前用于预测肝癌患者术后复发和生存的临床指标。
文档编号G01N33/48GK101430323SQ20081020227
公开日2009年5月13日 申请日期2008年11月5日 优先权日2008年11月5日
发明者周海军, 越 赵, 钦伦秀 申请人:复旦大学附属中山医院