专利名称：三聚氰胺的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种三聚氰胺的检测方法，具体地，涉及一种液相色谱和质谱联用检
测三聚氰胺的方法。
背景技术：
近几个月来，在婴儿奶粉及其他奶类制品中发现混有大量三聚氰胺，三聚氰胺是一种化工原料，人体摄入过量的三聚氰胺会造成肾结石并对健康产生巨大的影响。目前对三聚氰胺的检测方法可分为三类 (1)高性能液态色层分析法这种方法是利用高性能液态色层分析仪器对化合物做一个分离和检测，其检测的方法通常是紫外吸收。 (2)气相色谱质谱联用法这种方法是利用气相色谱对化合物进行分离，然后利用质谱鉴定化合物，它的灵敏度通常可以达到5PPB左右，其缺点是必须对三聚氰胺进行衍生化反应才能利用质谱检测，因此较为繁琐。 (3)液相色谱质谱联用法这种方法是使用液相色谱和质谱联用对化合物进行分离鉴定，它的灵敏度也可达到5PPB以下，而且不需要做衍生化反应。液相色谱和质谱联用的方法是目前最灵敏最好的方法。该方法是先利用液相色谱对样品进行分离，再利用质谱对分离出来的成分进行鉴定。最常用的液相色谱方法是反相色谱分析，它是利用样品在反相色谱柱上保留，再使用含有高含量的有机溶剂的流动相予以洗脱。最常用的反相色谱柱是C18和C8色谱柱。三聚氰胺是一个亲水性非常好的化合物，它在反相色谱柱上几乎无法保留，因此无法对其进行分离。 一般情况下，对于亲水性的化合物可以在溶剂中加入离子对试剂，离子对试剂可以和样品起交互作用，进而使其在反相柱上有保留而达到分离的效果。一般的离子对试剂具有很长的碳链，在尾端还键合有一个强酸或强碱基，从而和样品形成离子对并能使样品在反相柱上保留，可是一般离子对试剂都有较高的分子量不易挥发，因此无法和质谱联用，其他的方法，例如使用正相色谱分离三聚氰胺，可是众所周知正相色谱法稳定性不太好，柱效和分离效果也不如反相色谱柱，此外，高有机溶剂的流动相也容易使样品在进入质谱前的离子化不完全，从而降低了灵敏度。因此，目前需要建立一种新的用于检测三聚氰胺的反相液相色谱质谱联用的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的用于检测三聚氰胺的反相液相色谱质谱联用(简称反相LC-MS)的方法，该方法简单、准确性好，可用于奶粉和鸡蛋等食品中三聚氰胺的检测。 本发明的三聚氰胺检测方法，是一种反相液相色谱质谱联用的方法，采用含有有机溶剂的水溶液作为流动相，在流动相中加入多氟羧酸和/或其盐。 本发明的三聚氰胺检测方法中，所述多氟羧酸是下述通式(1)和(2)所表示的化合物，所述多氟羧酸盐为下式(3)或(4)所表示的分子量为15 500的小分子有机盐，其中，这些多氟羧酸或多氟羧酸盐可以一种单独使用，也可以2种以上并用，
O
II
CnFm—C—OH
其中，m、n为1 20的整数；
OH
II
CnFa—CmHb—C—OH
其中，m、n、a、b为1 20的整数，且m+n《20
O
CnFm—C一O0 M
其中，m、n为1 20的整数，M为阳离子；
(1)
(2)
(3)
CnFa—Cm Hb
(4)其中，m、n、a、b为1 20的整数，且m+n《20，M为阳离子。 本发明的三聚氰胺检测方法中，发明人考察了多种可用的多氟羧酸，结果发现三 氟乙酸(TFA)、七氟丁酸(HFBA)、3，3，3-三氟-2，2-二甲基丙酸、3，3，3-三氟-2-(三氟 甲基)丙酸、五氟丙酸都可以添加到流动相中，其中优选三氟乙酸(TFA)和/或七氟丁酸 (HFBA)。 本发明的三聚氰胺检测方法中，发明人考察了多氟羧酸在流动相中的含量，结果
发现，当多氟羧酸的含量在0.05% 5% (v/v)的范围内，都可以获得良好的色谱峰。 本发明的三聚氰胺检测方法中，所述有机溶剂可以是液相色谱中常用的各种有机
溶剂，其中优选甲醇和乙腈。此外，本发明考察了的甲醇水溶液的浓度范围，结果发现，甲醇
的水溶液的浓度只要在5% 50%的范围内，就可以获得较为良好的色谱峰，但是从获得
对称性和峰形更好的色谱峰的角度，优选10% 35% (v/v)。本发明也考察了乙腈水溶液
的浓度范围，结果发现，乙腈的水溶液只要在2% 50% (v/v)的范围内，就可以获得较为
良好的色谱峰，但是从获得对称性和峰形更好的色谱峰的角度，优选5% 30% (v/v)。 本发明的三聚氰胺检测方法中，使用C8或C18色谱柱作为色谱柱。 本发明在流动相中加入多氟羧酸和/或其盐，因为多氟羧酸和/或其盐具有很强
的疏水性，可以与反相色谱柱的固定相形成较强的交互作用。此外，多氟羧酸和/或其盐中
的羧基可以和三聚氰胺形成离子对，所以可以增加三聚氰胺在反相色谱柱上的保留而达到
分离的效果。此外，多氟羧酸和/或其盐一般具有很低的沸点、容易被挥发，因此，可以和质
谱联用而不会减低灵敏度。 本发明通过在流动相的含有有机溶剂的水溶液中加入多氟羧酸和/或其盐，可以 提供一种新的反相液相色谱和质谱联用法来检测三聚氰胺。
图1是采用本发明的一个实施例(A :含有0. 1% (v/v)HFBA的H20， B :含有0. 1% HFBA(v/v)的甲醇，A : B = 70 : 30混合作为流动相)检测不同浓度的三聚氰胺得到的色 谱图。 图2是采用本发明的另一个实施例(A :含有0. 1% (v/v)HFBA和0. 1% (v/v)TFA WH20、B :含有O. 1% (v/v) HFBA和0. 1 % (v/v)TFA的甲醇，其中，A : B = 70 : 30混合作
为流动相)检测不同浓度的三聚氰胺得到的色谱图。 图3是采用本发明的另一个实施例(A :含有O. 1% (v/v)HFBA的H20、B :含有O. 1% (v/v)HFBA的乙腈，A : B = 95 : 5混合作为流动相)检测浓度为5PPB的三聚氰胺得到的 色谱图。 图4是采用本发明的另一个实施例(A :含有0. 1% (v/v)HFBA和0. 1 % (v/v)TFA WH20、B :含有O. 1% (v/v)HFBA和0. 1% (v/v) TFA的乙腈，A : B = 90 : 10混合作为流 动相)检测浓度为5PPB的三聚氰胺得到的色谱图。 图5是采用本发明的另一个实施例(A :含有O. 1% (v/v)TFA的H^、B :乙腈，A : B
=70 : 30混合作为流动相)检测浓度为5PPB的三聚氰胺得到的色谱图。 图6是采用本发明的另一个实施例(A :含有1% (v/v)HFBA的H20、B :含有1% (v/
v)HFBA的甲醇，A : B = 85 : 15混合作为流动相)检测三聚氰胺得到的色谱图。 图7是采用本发明的另一个实施例(A :含有0. 1% (v/v)五氟丙酸的H20、B :含有
0.1% (v/v)五氟丙酸的甲醇，A : B = 70 : 30混合作为流动相)检测三聚氰胺得到的色谱图。 图8是三聚氰胺的标准曲线图。 图9是用本发明的方法检测奶粉中的三聚氰胺的色谱图。
具体实施例方式
首先说明一下本发明的检测方法的实验步骤。 液相色谱质谱联用法测定三聚氰胺是一种现有技术。主要包括以下一些步骤
(1)制备三聚氰胺标准品溶液，三聚氰胺是一种水溶性化合物，可以用各种常用的 含水有机溶剂配制三聚氰胺标准品。本发明中使用20% (v/v)甲醇水溶液配制不同浓度梯 度的三聚氰胺标准品溶液； (2)设定适宜的色谱条件和质谱条件，供分析用； (3)将不同浓度的三聚氰胺标准品溶液注入LC-MS，绘制标准曲线； (4)制备待测样品溶液，使用合适的溶剂将三聚氰胺从待测样品中提取出来，配制
成待测溶液； (5)分析待测样品，将待测样品注入LC-MS进行分析，根据分析结果计算待测样品 中三聚氰胺的含量。 接下来，简要说明本发明的检测方法中所使用的试剂材料以及仪器设备。
1.试剂与材料 除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
甲醇色谱纯。
乙腈色谱纯。 三聚氰胺标准品CAS 108-78-01，纯度大于99. 0% 。 0. 1 %的HFBA (v/v)水溶液准确量取1毫升七氟丁酸于1L容量瓶中，用水溶解并 定容至刻度，混匀后备用。 1%的HFBA(v/v)水溶液准确量取10毫升七氟丁酸于1L容量瓶中，用水溶解并 定容至刻度，混匀后备用。 0. 1%的TFA(v/v)水溶液准确量取1毫升三氟乙酸于1L容量瓶中，用水溶解并
定容至刻度，混匀后备用。
2.仪器和设备 液相色谱质谱仪Agilent 1100C即illary-LC/Q-T0F
离心机转速不低于4000r/min。 以下，结合实施例以及附图详细说明本发明的三聚氰胺的检测方法。但本发明并 不局限于这些实施例，本领域的技术人员可以以这些实施例为基础，根据实际情况进行适 当的调整。 实施例1 实施例7是流动相的优化选择试验。
实施例1 (1)色谱条件和质谱条件 色谱柱C18柱，250mmX2. lmm(i. d.) ， 5 ii m(ColumnTechnology Inc.，弗里蒙特， CA) 流动相:A :含有0. 1 % (v/v) HFBA的H20， B :含有0. 1 % HFBA (v/v)的甲醇，以A : B =70 : 30的比例混合
流速200uL/min
柱温室温 离子源(Ion source) :ESI，正离子模式
喷雾器(Nebulizer) :N2 30psi
干燥气流速(Drying gas) :N2 6L/min
进样量20iiL
(2)实验步骤 (a)配制三聚氰胺标准品溶液精密称取一定量的三聚氰胺，用20% (v/v)的甲醇 水溶液配制成浓度分别为0. 5PPB、1PPB、2PPB、5PPB、10PPB、20PPB的三聚氰胺标准品溶液， 备用； (b)分别将不同浓度的三聚氰胺标准品溶液注射入LC-MS仪，考察在此条件下的
三聚氰胺的色谱峰情况。
(3)结果 色谱分析结果示于图1。图l是仪器的工作站制出的色谱图，其中，色谱峰由上 而下分别为浓度是0. 5PPB、1PPB、2PPB、5PPB、10PPB、20PPB的三聚氰胺标准品的色谱峰，图 中，横坐标表示色谱峰的保留时间，单位是分钟，纵坐标表示离子数。由图l可以看出，在这 样的色谱条件下，三聚氰胺能够被很好地分离，色谱峰峰形良好，保留时间为3. 82分钟左 右。此外，由图1可知，该方法可以检测到0. 5PPB的三聚氰胺，灵敏度高。
实施例2 (1)色谱条件和质谱条件 将流动相更改为A :含有O. 1% (v/v)HFBA和0. 1% (v/v) TFA的H20、B :含有O. 1% (v/v)HFBA和0. 1% (v/v)TFA的甲醇，以A : B = 70 : 30的比例混合，其余条件与实施例 l相同。 (2)实验步骤
同实施例l。
(3)结果 色谱分析结果示于图2。图2是仪器的工作站制出的色谱图，其中，色谱峰由上 而下分别为浓度是0. 5PPB、1PPB、2PPB、5PPB、10PPB、20PPB的三聚氰胺标准品的色谱峰，图 中，横坐标表示色谱峰的保留时间，纵坐标表示离子数。由图2可以看出，在这样的色谱条 件下，三聚氰胺能被很好地分离，色谱峰峰形良好，保留时间3. 15分钟左右。
实施例3 (1)色谱条件和质谱条件 将流动相更改为:A :含有0. 1% (v/v) HFBA的H20、 B :含有0. 1% (v/v)HFBA的乙 腈，以A : B = 95 : 5的比例混合，其余条件与实施例1相同。 [OO 8] (2)实验步骤 取实施例1中配制的浓度为5PPB的三聚氰胺标准品溶液，注入LC-MS仪，考察在
此条件下的三聚氰胺的色谱峰情况。 (3)结果 色谱分析结果示于图3。图3是仪器的工作站制出的色谱图，其中，色谱峰为三聚 氰胺标准品的色谱峰，图中，横坐标表示色谱峰的保留时间，纵坐标表示离子数。由图3可 以看出，在这样的色谱条件下，三聚氰胺能够被很好地分离，色谱峰峰形良好，保留时间为 8. 2分钟左右。
实施例4 (1)色谱条件和质谱条件 将流动相更改为A :含有O. 1% (v/v)HFBA和0. 1% (v/v) TFA的H20、B :含有O. 1% (v/v)HFBA和0. 1% (v/v)TFA的乙腈，以A : B = 90 : 10的比例混合，其余条件与实施例 l相同。 (2)实验步骤
同实施例3。
(3)结果 色谱分析结果示于图4。图4是仪器的工作站制出的色谱图，其中，色谱峰为三聚 氰胺标准品的色谱峰，图中，横坐标表示色谱峰的保留时间，纵坐标表示离子数。由图4可 以看出，在这样的色谱条件下，三聚氰胺能够被很好地分离，色谱峰峰形良好，保留时间为 5. 3分钟左右。
实施例5 (1)色谱条件和质谱条件将流动相更改为:A :含有0. 1% (v/v) TFA的H20、B :乙腈，以A : B = 70 : 30的
7比例混合(在这个条件下，TFA的浓度相当于0. 07% )，其余条件与实施例1相同。
(2)实验步骤
同实施例3。
(3)结果 色谱分析结果示于图5。图5是仪器的工作站制出的色谱图，其中，色谱峰为三聚 氰胺标准品的色谱峰，图中，横坐标表示色谱峰的保留时间，纵坐标表示离子数。由图5可 以看出，在这样的色谱条件下，三聚氰胺能够被很好地分离，色谱峰峰形良好，保留时间为 4. 3分钟左右。
实施例6 (1)色谱条件和质谱条件 A :含有1. 0 % (v/v) HFBA的H20、 B :含有1. 0 % (v/v) HFBA的甲醇，以A : B = 85 : 15的比例混合作为流动相，其余条件与实施例1相同。 [OO"] (2)实验步骤
同实施例3。
(3)结果 色谱分析结果示于图6。图6是仪器的工作站制出的色谱图，其中，色谱峰为三聚 氰胺标准品的色谱峰，图中，横坐标表示色谱峰的保留时间，纵坐标是離子數表示离子数。 由图6可以看出，在这样的色谱条件下，三聚氰胺能够被很好地分离，色谱峰峰形良好，保 留时间为4. 5分钟左右。
实施例7 (1)色谱条件和质谱条件 A:含有O. 1% (v/v)五氟丙酸的！120、 B :含有O. 1% (v/v)五氟丙酸的甲醇，以 A : B = 70 : 30的比例混合作为流动相，其余条件与实施例1相同。(2)实验步骤 同实施例3。
(3)结果 色谱分析结果示于图7。图7是仪器的工作站制出的色谱图，其中，色谱峰为三聚 氰胺标准品的色谱峰，图中，横坐标表示色谱峰的保留时间，纵坐标表示离子数。由图7可 以看出，在这样的色谱条件下，三聚氰胺能够被很好地分离，色谱峰峰形良好，保留时间为 4. 3分钟左右。
实施例8 实施例8是奶粉样品的含量测定试验。
(1)色谱条件和质谱条件 色谱柱C18柱，250mmX2. lmm(i.d.)，5iim(Column Technology Inc.，弗里蒙特， CA)流动相:A :含有0. 1 % (v/v) HFBA的H20， B :含有0. 1 % HFBA (v/v)的甲醇，以A : B =70 : 30的比例混合
流速200uL/min
柱温室温
离子源(Ion source) :ESI，正离子模式(positive)
喷雾器(Nebulizer) :N2 30psi
干燥气流速(Drying gas) :N2 6L/min
进样量20iiL
(2)实验步骤 (a)配制三聚氰胺标准品溶液精密称取一定量的三聚氰胺，用20% (v/v)的甲醇 水溶液配制成浓度分别为2. 5PPB、5PPB、10PPB、25PPB、50PPB的三聚氰胺标准品溶液；
(b)分别将上述5种不同浓度的三聚氰胺标准品溶液注射入LC-MS中，由仪 器自带的工作站绘制出标准曲线，见图8，工作站根据分析数据求得的标准曲线为y = 23544. 9455x-6084. 8270，其中，y表示色谱峰的峰面积，x表示三聚氰胺的量，R2是一个表 示标准曲线的线性程度的参数，R2 = 0. 9988，表明具有良好的线性。
(c)配制奶粉样品溶液 称取50毫克(精确至O. l毫克)试样于5mL试管中，加入约5纳克的三聚氰胺混 合均匀，加入含1%三氯乙酸的20% (v/v)甲醇水溶液2.5毫升，超声提取10分钟，再振荡 提取10分钟，取700微升于1. 5毫升的试管中，加入100微升的氯仿振荡提取5分钟，再 以12000r/min的转速在离心机中离心分离10min。取500微升上清液到3K超滤管中，以 12000r/min的转速离心10min，取250微升过滤液并和250微升的0. 1% HFBA混合。
(d)进样分析，将配制好的样品溶液注入液相色谱质谱仪，色谱图见图9。
(e)根据仪器的工作站给出的峰面积数据，代入上述标准曲线y = 23544. 9455x-6084. 8270，计算样品中的三聚氰胺的含量。
(3)计算结果 经计算，奶粉样品中三聚氰胺的含量为5. 35纳克。
实施例9 实施例9是鸡蛋品的含量测定试验。
(1)色谱条件和质谱条件
同实施例8。
(2)实验步骤 除将奶粉换成鸡蛋外，其余都和实施例8相同。
(3)结果: 经计算，鸡蛋样品中三聚氰胺的含量为4. 75纳克。
方法学验证 通过考察重复性、稳定性和回收率这几个指标，对本发明的方法进行方法学验证
(1)重复性试验 按照实施例8中的(c)项所述的方法制备5份同样浓度的奶粉样品，按照实施例8 的色谱条件和质谱条件下进行分析，计算其中的三聚氰胺含量，结果表明平均含量为5. 35 纳克，标准偏差(RSD) < 2%，证明该方法重复性良好。
(2)回收率试验 回收率试验的结果表明该方法的回收率为94. 7 98. 2%， [OH4] (3)稳定性试验
取实施例8中的奶粉样品在0小时、2小时、4小时、8小时、24小时后测定，结果表
明稳定性良好。 由以上方法学验证结果可知，本发明的方法准确度高。可以用作为奶粉或者其他 食品中三聚氰胺的含量检测。相信此方法可在食品安全及卫生领域具有广阔的应用前景。
权利要求
一种三聚氰胺的检测方法，所述方法是一种反相高效液相色谱质谱联用的方法，其特征在于，采用含有有机溶剂的水溶液作为流动相，在流动相中加入多氟羧酸和/或其盐。
2. 根据权利要求l所述的三聚氰胺的检测方法，其中，所述多氟羧酸是下述通式(1)或 (2)所表示的化合物，所述多氟羧酸盐为下述通式(3)或(4)所表示的分子量为15 500 的有机小分子盐，其中，这些多氟羧酸或多氟羧酸盐可以一种单独使用，也可以2种以上并 用，<formula>formula see original document page 2</formula>其中，m、n为1 20的整数；<formula>formula see original document page 2</formula>其中，m、n、a、b为1 20的整数，m+n《20 ;<formula>formula see original document page 2</formula>其中，m、n为1 20的整数，M表示阳离子；<formula>formula see original document page 2</formula>其中，m、n、a、b为1 20的整数，m+n《20，M表示阳离子。
3. 根据权利要求1或2所述的三聚氰胺检测方法，其中，所述多氟羧酸是三氟乙酸、七 氟丁酸、3，3，3-三氟-2，2-二甲基丙酸、3，3，3-三氟-2-(三氟甲基)丙酸、五氟丙酸中的 l种或2种以上。
4. 根据权利要求3所述的三聚氰胺检测方法，其中，所述多氟羧酸是三氟乙酸和/或七 氟丁酸。
5. 根据权利要求1或2所述的三聚氰胺检测方法，其中，所述多氟羧酸和/或其盐在流 动相中的含量为0. 05% 5% (v/v)。
6. 根据权利要求3所述的三聚氰胺检测方法，其中，所述多氟羧酸和/或其盐的含量为 0. 05% 5% (v/v)。
7. 根据权利要求1或2所述的三聚氰胺检测方法，其中，用C8或C18色谱柱作为色谱柱。
8. 根据权利要求1或2所述的三聚氰胺检测方法，其中，作为流动相的所述含有有机溶 剂的水溶液是5% 50% (v/v)的甲醇水溶液和/或2% 50% (v/v)的乙腈水溶液。
9. 根据权利要求8所述的三聚氰胺检测方法，其中，作为流动相的所述含有有机溶剂 的水溶液是10% 35% (v/v)的甲醇水溶液和/或5% 30% (v/v)的乙腈水溶液。
全文摘要
本发明提供一种新的三聚氰胺的检测方法，是一种反相高效液相色谱质谱联用的方法，采用含有有机溶剂的水溶液作为流动相，在流动相中加入多氟羧酸和/或其盐。
文档编号G01N30/26GK101738444SQ20081020220
公开日2010年6月16日 申请日期2008年11月4日 优先权日2008年11月4日
发明者曾嵘, 谢佳辉 申请人:上海科致生物科技有限公司;中国科学院上海生命科学研究院