专利名称：一种快速免疫检测牛奶中β-内酰胺酶的方法
技术领域：
本发明属于免疫检测技术领域，具体是一种动物性食品安全或畜牧业生产领域原 料乳中添加的P -内酰胺酶的ELISA检测方法。
背景技术：
目前，青霉素作为13-内酰胺类药物是治疗牛乳腺炎的首选药物，是牛奶中最常 见的残留抗生素。由于国内多数乳品企业对抗生素残留超标的牛乳采取拒绝收购的原则， 出于经济利益的驱动， 一些不法奶站为了谋求自己的经济利益，人为地使用一些生物制剂 去降解牛乳中残留的抗生素，生产所谓的人造"无抗奶"。2005年至今，已有数家公司公开 宣称出售分解牛乳中残留抗生素的解抗剂。该解抗剂的主要成分是P-内酰胺酶，它是由 革兰氏阳性细菌产生和分泌的，可选择性分解牛奶中残留的e-内酰胺类抗生素。P-内酰 胺酶为我国不允许使用的食品添加剂，该酶的使用掩盖了牛奶中实际含有的抗生素。P-内 酰胺酶能够使青霉素内酰胺结构破坏而失去活性，导致青霉素、头孢菌素等抗生素类药物 耐药性增高，从而大大降低了人们抵抗传染病的能力，给消费者的身体健康带来危害。
当前，牛奶中|3-内酰胺酶的检查技术，有杯碟法、碘量法和酸度法等几种方法，
但都缺乏特异性。并且，e-内酰胺酶，有内源性和外源性之区别。外源性就是人为添加的， 危害巨大；内源性的量很少，但会对利用上述几种方法所检测的结果，产生干扰，测量误差 大。目前尚没有一种可以准确、特异和快速地免疫检测非法添加到牛奶中的e-内酰胺酶 的方法。
发明内容
本发明的目的提供一种快速免疫检测牛奶中13-内酰胺酶的方法，利用此法，可 以准确、特异和快速地免疫检测非法添加到牛奶中的P-内酰胺酶，以便于从源头上及时 监测和把控原奶质量，保证牛奶的安全性和人类健康，社会及经济效率好。
本发明目的是这样实现的一种快速免疫检测牛奶中P-内酰胺酶的方法，其特 征在于利用包被于酶标板上的鼠抗P-内酰胺酶单克隆抗体，与兔抗P-内酰胺酶多克隆 抗体和辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体组成三抗体夹心(Tas-ELISA)法试剂，进行三抗体 夹心(Tas-ELISA)法免疫学检测，检测原料乳中的P _内酰胺酶。 所述的鼠抗13 -内酰胺酶单克隆抗体是采用13 -内酰胺酶免疫BALB/c小鼠制备 的。 所述的鼠抗P-内酰胺酶单克隆抗体的效价为l : 655万 1310万，亚型是IgGl， 亲和力为1. 000X 109L/mol 1. 046Xl(TL/mol，较佳。 所述的兔抗13 -内酰胺酶多克隆抗体是采用13 -内酰胺酶免疫新西兰大白兔制备 的，或日本大耳白兔等制备的。 所述的兔抗13 -内酰胺酶多克隆抗体效价为1 : 320万 655万，较佳。 所述的鼠抗e -内酰胺酶单克隆抗体与兔抗e -内酰胺酶多克隆抗体都采用蛋白
3A纯化后应用，较佳。 本发明与现有技术相比具有如下优点 —、特异性强由于鼠抗单克隆抗体和兔抗多克隆抗体均是特异的，仅对原料乳中 添加的e-内酰胺酶有阳性反应，其内源性的e-内酰胺酶的干扰可被排除，准确性高。
二、检测快速、成本低原料乳样品的检测可在3个小时左右，可一次可检测96个 样本，并且由于所用试剂均为常规试剂，不需特殊设备，一般基层检验检测实验室均可进 行，成本低。 三、社会效益好从食品安全的源头实现对原料乳的检查、监控，确保广大消费群 众的饮食安全，有利于人民的身体健康。
附图是本发明的检测原理示意图。 图中1.酶标板，2.鼠抗|3 _内酰胺酶单克隆抗体，3. |3 _内酰胺酶，4.兔抗13 _内
酰胺酶多克隆抗体，5.辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体。
具体实施例方式
为了更好的实施本发明，特举较佳实施例如下。 采用P-内酰胺酶分别免疫BALB/c小鼠和新西兰大白兔，制备出了鼠抗|3-内酰 胺酶单克隆抗体和兔抗P _内酰胺酶多克隆抗体。鼠抗P _内酰胺酶单克隆抗体的效价为 1 : 1310万，亚型是IgGl亲和力为1.046Xl(^L/mol，与其他相关物质反应阴性，仅与抗原 P _内酰胺酶有阳性反应；兔抗13 _内酰胺酶效价为1 : 655万，仅与抗原13 -内酰胺酶反 应阳性。单克隆抗体与多克隆抗体都采用蛋白A纯化后应用。用于包被的鼠抗P-内酰胺 酶单克隆抗体与兔抗P-内酰胺酶多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体一起可以 实现对原料乳中e-内酰胺酶的三抗体夹心法检测。检测灵敏度为40U/mL。该发明的检测 步骤是 1、用0. 01mol/L pH9. 6碳酸盐缓冲液将单克隆抗体稀释至5 y g/mL包被酶标板， 每孔100iiL，4。C过夜; 2 、用PBS/T20洗板3次，每孔200 ii L ，每次3分钟； 3、用含3X小牛血清的PBS/T20封闭，每孔200iiL，37。C孵育1小时; 4、洗板，同步骤2 ;加入牛奶样品，每孔100ii L，37t:孵育30分钟； 5、洗板，同步骤2 ;加入0. 75mg/L的多克隆抗体，每孔100 ii L， 37°C ， 30分钟； 6 、洗板，同步骤2 ;加入0. 08mg/L的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体，每孔
100ii L，37。C，30分钟; 7、洗板，同步骤2 ;加入四甲基联苯胺(TMB)显色液，每孔100 y L， 37。C避光反应
15分钟后，加入50 ii L 2mol/L H2S04溶液；读取波长为450nm时的0. D.值。 8、判定标准阳性阈值=2. IX空白对照，空白对照< 0. 2。如样品0. D.值大于
等于阳性阈值，则该样品中含有e-内酰胺酶。 9、结果空白对照均值等于0. 106，阳性阈值是0. 223。
样品一 0. D.值为0. 248，则该样品中含有添加的P _内酰胺酶；
样品二 0. D.值为0. IOI，则该样品中不含有添加的|3 _内酰胺酶c
权利要求
一种快速免疫检测牛奶中β-内酰胺酶的方法，其特征在于利用包被于酶标板上的鼠抗β-内酰胺酶单克隆抗体，与兔抗β-内酰胺酶多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体组成三抗体夹心法试剂，进行三抗体夹心法免疫学检测，检测原料乳中的β-内酰胺酶。
2. 根据权利要求1所述的一种快速免疫检测牛奶中P-内酰胺酶的方法，其特征在于 所述的鼠抗内酰胺酶单克隆抗体是采用内酰胺酶免疫BALB/c小鼠制备的。
3. 根据权利要求2所述的一种快速免疫检测牛奶中e-内酰胺酶的方法，其特征在于 所述的鼠抗e-内酰胺酶单克隆抗体的效价为1 : 655万 1310万，亚型是IgGl，亲和力 为1. 000 X lOVmol 1. 046 X 1010L/mol 。
4. 根据权利要求1所述的一种快速免疫检测牛奶中e-内酰胺酶的方法，其特征在于 所述的兔抗内酰胺酶多克隆抗体是采用内酰胺酶免疫新西兰大白兔制备的。
5. 根据权利要求4所述的一种快速免疫检测牛奶中e-内酰胺酶的方法，其特征在于 所述的兔抗P -内酰胺酶多克隆抗体效价为1 : 320万 655万。
6. 根据权利要求1所述的一种快速免疫检测牛奶中e-内酰胺酶的方法，其特征在于 所述的鼠抗P _内酰胺酶单克隆抗体与兔抗P _内酰胺酶多克隆抗体都采用蛋白A纯化后 应用。
全文摘要
本发明提供了一种快速免疫检测牛奶中β-内酰胺酶的方法，属于免疫检测技术领域。其特征在于利用包被于酶标板上的鼠抗β-内酰胺酶单克隆抗体，与兔抗β-内酰胺酶多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体组成三抗体夹心法试剂，进行三抗体夹心法免疫学检测，检测原料乳中的β-内酰胺酶。与现有技术相比，本发明可以准确、特异和快速地免疫检测非法添加到牛奶中的β-内酰胺酶，以便于从源头上及时监测和把控原奶质量，保证牛奶的安全性和人类健康，社会及经济效率好。
文档编号G01N33/577GK101710122SQ20091017535
公开日2010年5月19日 申请日期2009年12月16日 优先权日2009年12月16日
发明者吴萌, 张小兵, 时玮, 李亚璞, 李君华, 李春生, 程华, 董超, 谢莉, 邸禄芹, 闫静辉, 陈英珠, 高志肖, 齐颖颖 申请人:河北省科学院生物研究所