专利名称：一种原发性肝癌相关非编码小分子rna的多态性位点及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种与原发性肝癌相关的非编码小分子RNA hsa-miR-146a及其前体上的单核苷酸多态性位点，本发明还涉及一种检测该多态性位点，分析其与该小分子RNA加工效率相关性的方法，以及hsa-miR-146a前体上该多态性在预诊原发性肝癌方面的用途。
背景技术：
恶性肿瘤已经成为人类死亡的主要原因之一，其中原发性肝癌在所有肿瘤中发病率列第六位，死亡率列第三位。在我国城市范围内肝癌更是高居各种癌症中的第二位(曾益新，肿瘤学(第二版)。人民卫生出版社，北京，2003，5-6)。恶性肿瘤的发生是一个多因素多步骤的过程，其中遗传因素的发病机制起了重要的作用。单核苷酸多态性(SNP)是指某一物种中，在基因组上特定位置存在的单个核苷酸的序列改变，在人类基因组中其频率较高，被广泛地用来作为遗传标记(Collins，F.S.，et al.A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation，GenomeRes，1998，8(12)，1229-31)。越来越多的证据表明，蛋白质编码基因中蛋白编码序列及其上下游调控序列内存在的SNP在对基因的表达、功能等起着重要调控作用的同时，也影响了包括恶性肿瘤等疾病的发生，发展和预后。目前已有很多的该类SNP与癌症的相关性的报道，以SNP位点为标记进行疾病的辅助诊断和治疗，将是实现疾病个性化治疗的重要参考指标。
微小RNA(microRNA)是广泛存在于各种生物物种内的一类小分子非编码的核糖核酸，其长度约为20-22个碱基。它不编码蛋白质或多肽，而是通过与靶基因的mRNA(信使RNA)的3’UTR(3’端非翻译区)的特异性结合，促进其降解或抑制其翻译过程来实现对基因表达的调控。许多证据表明，microRNA参与了细胞的多种生物学过程，其自身调控的异常直接影响着恶性肿瘤的发病及恶化。由于microRNA与肿瘤发生的密切关系，它们的基因组序列中存在的SNP位点，很可能调节着它们的表达或加工过程，从而与癌症的发病相关。
经对现有技术的国内外文献检索，至今未见有任何microRNA分子序列中多态性位点与疾病的研究报道，也没有本发明所公开的microRNA家族中的hsa-miR-146a分子中多态性位点与各种疾病，包括原发性肝癌的相关报道。
发明内容
本发明目的在于揭示非编码小分子RNA hsa-miR-146a前体上的一个单核苷酸多态性位点与该小分子加工效率、与原发性肝癌易感程度的相关性，以及其在预诊原发性肝癌方面的用途。
首先，本发明提供了一种检测hsa-miR-146a分子前体上单核苷酸多态性的方法。
具体步骤如下(a)确定非编码小分子RNA hsa-miR-146a前体中存在的单核苷酸多态性(编号rs2910164)，即SEQ ID NO1序列中的第460位的核苷酸(标注为N)，两种多态性分别为G或者C；(b)采用聚合酶链式反应，特异性扩增包含hsa-miR-146a前体序列的基因组DNA片段；(c)用限制性酶切片段长度多态性(RFLP)方法对扩增得到的包含有hsa-miR-146a前体的DNA片段中的多态性位点进行基因分型。
SEQ ID NO11 CCCCTACAGA TTAGTTTTTG TTTTGACAGG GTCTCTCTCT GTGGCCCAGA51 CTGGAGTGCA GTGGTGCAAT CATAGCTCAC TGCAACCTCC AATTCCCAGG101CTCAAGCGAT CCTCCCACCA CAGGCCATCA TGCATGGCTC ATTTTTTATT151TTTAGTAGAG ACAAATTCTC CATGTTGCCC AGGCTAGTCC TGAACTCCTG201GGCTCAAGAG ATCCACCCAC ATCAGCCTTC CAGACTGCTG GCCTGGTCTC251CTCCAGATGT TTATAACTCA TGAGTGCCAG GACTAGACCT GGTACTAGGA301AGCAGCTGCA TTGGATTTAC CAGGCTTTTC ACTCTTGTAT TTTACAGGGC351TGGGACAGGC CTGGACTGCA AGGAGGGGTC TTTGCACCAT CTCTGAAAAG401CCGATGTGTA TCCTCAGCTT TGAGAACTGA ATTCCATGGG TTGTGTCAGT451GTCAGACCTN TGAAATTCAG TTCTTCAGCT GGGATATCTC TGTCATCGTG501GGCTTGAGGA CCTGGAGAGA GTAGATCCTG AAGAACTTTT TCAGTCTGCT551GAAGAGCTTG GAAGACTGGA GACAGAAGGC AGAGTCTCAG GCTCTGAAGG601TATAAGGAGT GTGAGTTCCT GTGAGAAACA CTCATTTGAT TGTGAAAAGA651CTTGAATTCT ATGCTAAGCA GGGTTCCAAG TAGCTAAATG AATGATCTCA701GCAAGTCTCT CTTGCTGCTG CTGCTACTCG TTTACATTTA TTGATTACTT
751ACGATGATTC AGGTACTGTT GTAAGTGCTT TACATGCTGT TATACGAGAC801TCTTGGGAGA AATCACTTTA ATGAAGCTTG AGACACATGG CATTGCCATG851CAATGATTTT TCCCCCCTCT TCACGGGATC AGAGGGAACT AATAGAATG本发明同时提供了特异性扩增hsa-miR-146a分子DNA片段的核苷酸引物，长度为20-22个碱基。
扩增引物如下正向引物5’-GGAGGGGTCTTTGCACCATC-3’(SEQ ID NO2)反向引物5’-TGCCTTCTGTCTCCAGTCTTCC-3’(SEQ ID NO3)其次，本发明提供了一种检测所述多态性位点对hsa-miR-146a前体(SEQ IDNO1所示序列的401-499序列)到成熟体(SEQ ID NO1所示序列的第422-441序列)加工效率影响的技术方法，具体步骤如下(a)分别构建具有如上鉴定出的两种多态性位点(基因型分别为G或C)的小分子RNA表达载体，并用其分别转染模式细胞；(b)收集转染表达载体后的模式细胞，利用RNA提取技术获得细胞中的核糖核苷酸；(c)采用Northern blot技术，检测获得的核糖核苷酸中hsa-miR-146a的前体和成熟体分子的表达水平。
本发明同时提供了特异性克隆所述表达载体中hsa-miR-146a表达片段的核苷酸引物，以及特异性结合hsa-miR-146a前体和成熟体的寡核苷酸探针。克隆引物如下正向引物5’-ATGCTCGAGCCTGGTCTCCTCCAGATGTT-3’(SEQ ID NO4)反向引物5’-ATGTCTAGATTCTCACAGGAACTCACACTCC-3’(SEQ IDNO5)探针5’-AACCCATGGAATTCAGTTCTCA-3’(SEQ ID NO6)最后，本发明提供了一种检测原发性肝癌的预诊试剂盒。包括(1)特异性扩增包含有hsa-miR-146a前体序列的基因组片断的引物对；(2)检测扩增产物中多态位点rs2910164基因型所需的限制性内切酶。
本发明的有益效果是本发明提供的分析hsa-miR-146a前体序列中所述单核苷酸多态性位点序列的试剂盒，可应用于对原发性肝癌病人的辅助诊断，对个体对原发性肝癌的易感性进行评判，从而有利于原发性肝癌的预防、早期诊断和治疗；可作为药物的潜在靶点，筛选具有调节hsa-miR-146a表达的药用分子，促进新的抗肝癌药物的发现。
图1多态性位点对hsa-miR-146a前体到成熟体加工效率的影响具体实施方式
实施例1血液样本的收集和基因组DNA的提取从广东省中山大学附属肿瘤医院采集到散发性的原发性肝癌患者标本671份，平均年龄46.8±12.2岁(标准差)，其中65例为女性。同样来自广东省无血缘关系的健康人群对照655例，平均年龄45.8±13.7岁(标准差)，其中女性样品64例。
用常规酚氯仿法从上述收集到的血液标本中提取基因组DNA后，将样品统一稀释为10ng/ul。
实施例2单核苷酸多态性位点的分型本发明采用基于聚合酶链式反应的单核苷酸多态性技术(PCR-SSCP)，对hsa-miR-146a分子前体中存在的多态位点rs2910164(其等位基因点对为G/C)在病例组和对照组中进行了基因分型。
PCR反应在MJ PTC-200仪器上进行。
扩增引物如下正向引物5’-GGAGGGGTCTTTGCACCATC-3’(SEQ ID NO2)反向引物5’-TGCCTTCTGTCTCCAGTCTTCC-3’(SEQ ID NO3)PCR反应试剂及程序每个样品进行一个总体积为20ul的扩增反应，体系中包含制备的基因组DNA稀释液20ng，10×Taq Buffer 2ul，5mM dNTP 0.8ul，25mM MgCl21.6ul，0.25个单位的Taq DNA聚合酶和上述引物(稀释至10uM)各0.5ul，最后加入ddH2O将总体积配为20ul。反应在94℃预变性2分钟后，进行35个94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒的扩增循环，最后进行72℃2分钟的补平。
用限制性酶切片段长度多态性(RFLP)方法对扩增得到的长度为210bp(位于SEQ ID NO1所示序列的第372-581序列)的包含有hsa-miR-146a前体的DNA片段中的多态性位点进行基因分型。具体方法为取3ul上述扩增的PCR反应产物，加入1ul的酶切缓冲液，1个单位的限制性内切酶MamI，加ddH2O至总体积为10ul，并在37℃消化过夜。此后，在12％的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用银染法显影后进行基因型分析酶切处理后，若检测样品中rs2910164位点基因型是纯合G时，出现82nt，77nt和51nt的条带；若基因型是纯合C时，出现82nt，51nt，45nt和32nt的条带；若基因型是杂合GC时，则出现82nt，77nt，51nt，45nt和32nt的条带。
实施例3检测该多态性位点对hsa-miR-146a前体到成熟体加工效率的影响本发明基于细胞模型检测采用体外进行hsa-miR-16a分子加工效率检测，技术路径如下(1)基于商业化的invitrogen公司的pCDNA3.0载体骨架，分别以两种纯合基因型的样品为模板，将其中含有hsa-miR-146a前体的基因组DNA序列克隆到该骨架中，构建成为该microRNA的G或C多态型的两个表达载体；克隆引物如下正向引物5’-ATGCTCGAGCCTGGTCTCCTCCAGATGTT-3’(SEQ ID NO4)反向引物5’-ATGTCTAGATTCTCACAGGAACTCACACTCC-3’(SEQ ID NO5)(2)将步骤一中构建的两种多态型的microRNA表达载体及空载体pCDNA3.0用常规的磷酸钙转染法，各自导入293T细胞(从美国菌种保藏中心获取)中，转染后继续培养细胞24小时；(3)收集步骤二中转染后的293T细胞及未转染细胞的总RNA，在15％的变性聚丙烯酰胺上电泳后，根据常规的Northern blot的方法进行转膜及同位素探针杂交，通过磷屏显影来检测到不同RNA样品中hsa-miR-146a分子前体及成熟体的表达水平。所用的特异性的杂交探针为5’-AACCCATGGA ATTCAGTTCTCA-3’(SEQ ID NO6)；(4) 比较两种多态型表达载体转染后的细胞样品中成熟体和前体的表达水平比率，即hsa-miR-146a分子前体到成熟体的加工效率。
结果如图1所示，等位位点为G时该分子的前体到成熟体的加工效率相对于等位位点为C时有明显提高。
实施例4hsa-miR-146a分子前体中单核苷酸多态位点与原发性肝癌的相关性分析统计方法利用GDA(http://hydrodictyon.eeb.uconn.edu/people/plewis/software.php)进行模拟次数为10000次的卡方分析，计算健康人群对照组标本的Hardy-Weinberg平衡。运用SPSS专业统计学软件，选用卡方检验对病人组和对照组标本中多态位点的基因型分布频率进行统计学分析，置信区间设定位95％(即95％CI)，统计学的显著性差异水平设定为p＜0.05，同时计算Odds Ratio(OR)值。
统计结果原发性肝癌病人组和健康对照组标本的rs2910164多态位点基因型及等位位点分布频率如下表所示
根据上表分布频率，利用GDA软件运算得出对照组标本的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。
从上表可见，位于hsa-miR-146a前体上的单核苷酸多态性位点rs2910164的G等位位点，在原发性肝癌患者群体中的分布频率显著性(P＝0.015)大于其在健康对照组群体中的分布频率，是原发性肝癌易感的一个标志性位点。此与原发性肝癌易感性相关的多态性位点，位于hsa-miR-146a前体分子的茎环结构上的茎部位，该多态改变了茎上碱基的互补配对情况(若该位点为G多态型，则可与另一臂上的U碱基形成RNA特有的G:U配对；若该位点为C多态型，则该配对被破坏)，从而改变了茎的互补完整性。这很可能影响RNA的二级结构，从而影响其前体到成熟体的加工效率，正如实施例3所示，该等位位点的不同已被证实可以影响其成熟体的产生，这也从一个功能性的角度支持了上述统计学的结论。
实施例5检测试剂盒制备检测原发性肝癌易感性的试剂盒，其中含有下列寡聚核苷酸引物对，用于从检测对象的基因组样本中特异性扩增包含有hsa-miR-146a前体序列的基因组片断。
正向引物5’-GGAGGGGTCTTTGCACCATC-3’(SEQ ID NO2)反向引物5’-TGCCTTCTGTCTCCAGTCTTCC-3’(SEQ ID NO3)该试剂盒还包含限制性内切酶MamI，用于酶切上述引物对扩增得到的PCR产物。将酶切产物进行15％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后显影，可以方便地检测出标本中rs2910164多态性位点的G-C等位基因型。
本发明具有实用性的例证(1)本发明所建立的方法可用于分析人的hsa-miR-146a分子前体序列上的单核苷酸多态性位点rs2910164的G-C等位基因型，来应用于对原发性肝癌的辅助诊断和对个体是否具有原发性肝癌易感性进行判断，从而有利于原发性肝癌的预防和治疗；(2)可以利用本发明所介绍的研究该类小分子非编码核糖核酸加工效率的方法，筛选以上述rs2910164多态位点为靶标的有效药物，寻找具有调节hsa-miR-146a分子加工、表达的活性分子，促进新的抗肝癌药物的发现；(3)利用本发明提供的原发性肝癌相关性的小分子非编码核糖核酸及其多态性位点的序列和基因分型方法，构建对原发性肝癌进行分子遗传学诊断的检测试剂盒；(4)由于hsa-miR-146a分子很可能还参与了其他与增殖、凋亡等细胞活动失调相关的病理过程，包括其他类型的肿瘤等。因此本发明对今后深入研究hsa-miR-146a分子与其他疾病的关系提供了经验和应用基础；(5)在同类的其他小分子非编码核糖核酸的前体序列中还有类似的单核苷酸多态性位点，这些位点同样可能对相应的小分子的加工和表达具有调节作用，从而影响其生物学功能甚至同样影响了各种疾病的发生。目前国内外仍未有该类小分子非编码核糖核酸上存在的多态性位点与疾病相关的报道，因此，本发明也对今后该领域的研究公布了最宝贵的线索、经验和应用技术。
序列表<110>中山大学<120>一种原发性肝癌相关非编码小分子RNA的多态性位点及其应用<160>6<210>1<211>899<212>DNA<213>人类(human)<220>
<221>misc_feature<222>(460)<223>n＝g或c<400>1cccctacaga ttagtttttg ttttgacagg gtctctctct gtggcccaga ctggagtgca 60gtggtgcaat catagctcac tgcaacctcc aattcccagg ctcaagcgat cctcccacca 120caggccatca tgcatggctc attttttatt tttagtagag acaaattctc catgttgccc 180aggctagtcc tgaactcctg ggctcaagag atccacccac atcagccttc cagactgctg 240gcctggtctc ctccagatgt ttataactca tgagtgccag gactagacct ggtactagga 300agcagctgca ttggatttac caggcttttc actcttgtat tttacagggc tgggacaggc 360ctggactgca aggaggggtc tttgcaccat ctctgaaaag ccgatgtgta tcctcagctt 420tgagaactga attccatggg ttgtgtcagt gtcagacctn tgaaattcag ttcttcagct 480gggatatctc tgtcatcgtg ggcttgagga cctggagaga gtagatcctg aagaactttt 540tcagtctgct gaagagcttg gaagactgga gacagaaggc agagtctcag gctctgaagg 600tataaggagt gtgagttcct gtgagaaaca ctcatttgat tgtgaaaaga cttgaattct 660atgctaagca gggttccaag tagctaaatg aatgatctca gcaagtctct cttgctgctg 720
ctgctactcg tttacattta ttgattactt acgatgattc aggtactgtt gtaagtgctt 780tacatgctgt tatacgagac tcttgggaga aatcacttta atgaagcttg agacacatgg 840cattgccatg caatgatttt tcccccctct tcacgggatc agagggaact aatagaatg 899<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>2ggaggggtct ttgcaccatc 20<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>3tgccttctgt ctccagtctt cc 22<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述引物<400>4atgctcgagc ctggtctcct ccagatgtt29<210>5<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>5atgtctagat tctcacagga actcacactc c 31<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>6aacccatgga attcagttct ca 2权利要求
1.一种检测hsa-mir-146a分子的单核苷酸多态性的方法，其特征在于它包括以下步骤(1)确定在has-mir-146a分子前体上存在的单核苷酸多态位点rs2910164，即SEQ ID NO1第460位的核苷酸；(2)采用聚合酶链式反应，特异性扩增包含has-mir-146a前体序列的基因组DNA片段；(3)用限制性酶切片段长度多态性(RFLP)方法对扩增得到的包含有has-mir-146a前体的DNA片段中的多态性位点进行基因分型。
2.根据权利要求1所述的检测hsa-mir-146a分子的单核苷酸多态性的方法，其特征在于步骤(2)聚合酶链式反应采用的引物的序列分别为SEQ ID NO2，SEQ ID NO3所示序列。
3.根据权利要求1所述的检测hsa-mir-146a分子的单核苷酸多态性的方法，其特征在于步骤(3)的具体方法为用限制性内切酶MamI对步骤步骤(2)的PCR产物进行酶切，然后根据酶切后的DNA片段的长度确定多态位点基因型。
4.一种检测hsa-mir-146a分子的单核苷酸多态性对其前体到成熟体加工效率影响的方法，包括以下步骤(1)构建分别具有鉴两种多态性位点基因型分别为G或C的小分子RNA表达载体，并用其分别转染模式细胞；(2)收集转染表达载体后的模式细胞，利用RNA提取技术获得细胞中的核糖核苷酸；(3)采用Northern blot技术，检测获得的核糖核苷酸中has-mir-146a的前体和成熟体分子的表达水平。
5.根据权利要求4所述的检测hsa-mir-146a分子的单核苷酸多态性对其前体到成熟体加工效率影响的方法，其特征在于步骤(1)以SEQ ID NO4，SEQID NO5所示序列为引物对，把单核苷酸多态位点rs2910164分别为G或C并包含has-mir-146a前体序列的两种基因型的基因DNA片段分别克隆至pCDNA3.0载体上，构建成为该microRNA的G或C多态型的两个表达载体。
6.根据权利要求4所述的检测hsa-mir-146a分子的单核苷酸多态性对其前体到成熟体加工效率影响的方法，其特征在于步骤(3)具体为利用常规的Northern Blot的方法进行转膜及同位素探针杂交，杂交探针为SEQ ID NO6所示序列，然后通过磷屏显影来检测到不同RNA样品中hsa-mir-146a分子前体及成熟体的表达水平。
7.一种原发性肝癌的诊断试剂盒，其特征在于，它包括(1)特异性扩增包含有hsa-mir-146a前体序列的基因组片断的引物对；(2)检测扩增产物中多态位点rs2910164基因型所需的限制性内切酶。
8.按权利要求7所述的原发性肝癌的诊断试剂盒，其特征在于，特异性扩增包含有hsa-mir-146a前体序列的基因组片断的引物对具有SEQ ID NO2，SEQID NO3所示序列。
9.按权利要求7所述的原发性肝癌的诊断试剂盒，其特征在于，所述的限制性内切酶是限制性内切酶MamI。
全文摘要
本发明公开了一种与原发性肝癌相关的非编码小分子核糖核酸hsa－mir－146a及其多态位点。本发明还提供了一种分析has－mir－146a前体中的单核苷酸多态性、检测该多态性与其成熟体加工效率相关性的方法，以及该多态性位点在预诊原发性肝癌方面的用途。
文档编号C12Q1/68GK101041854SQ200610122170
公开日2007年9月26日 申请日期2006年9月15日 优先权日2006年9月15日
发明者庄诗美, 许腾, 程家森, 杨金娥, 李锦清, 元云飞 申请人:中山大学