用于辅助鉴定大豆M型细胞质雄性不育恢复基因Rf-m1的分子标记的引物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了用于辅助鉴定大豆M型细胞质雄性不育恢复基因Rf-m1的分子标记的引物，引物是具有如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的上游引物和具有如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的下游引物。本发明提供的分子标记与现有的大豆M型细胞质雄性不育恢复基因的分子标记相比，它具有与恢复基因Rf-m1连锁更紧密的分子标记，可减少由于遗传交换而造成的错误鉴定，而且在操作上高效、快捷。
【专利说明】用于辅助鉴定大豆M型细胞质雄性不育恢复基因Rf-m1的 分子标记的引物
【技术领域】
[0001] 本发明涉及大豆分子育种【技术领域】，尤其涉及一种大豆M型细胞质雄性不育恢复 基因（Rf-ml)区段的分子标记，可用于分子标记辅助恢复基因的选择育种。
【背景技术】
[0002] 细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS)，是指植物不能产生花 粉或产生的花粉无活力，导致雄蕊不能正常授粉而雌蕊功能正常的一种母性遗传现象 (Schnable等，1998)。王曙明等（2009)认为利用细胞质雄性不育系进行三系配套育种是作 物杂种优势利用的重要途径，而杂种优势利用是大幅度提高大豆产量的有效措施之一。大 豆细胞质雄性不育最早是由Davis(1985)获得的质核互作雄性不育的不育系和保持系，但 未见进一步的报道。2004年，赵丽梅等研宄培育出世界上第一个比对照增产20. 8%的三系 大豆杂交种"杂交豆1号"，该品种不仅品质优良，抗病性强，而且促使大豆产量大幅度的提 高（赵丽梅等，2004)。目前，国内多个研宄单位报道育成多个不育系并实现三系配套，使我 国的大豆杂种优势利用研宄处于国际前列（张磊等，2007 ;彭宝等，2008, 2010, 2013)。
[0003] 优良恢复系是利用CMS系统配制杂交种的基础，但育性恢复性易受环境影响，并 且需通过测交才能确定。定位恢复基因，利用分子标记对恢复基因进行标记辅助选择，可 提高育种效率。目前，已有研宄者利用分子标记对大豆细胞质雄性不育恢复基因进行了定 位，这在一定程度上提尚了选择的可靠性（许占友等，1999 ;赵_梅等，2007 ;Yang等，2007 ; Wang等，2010 ;李曙光等，2010 ;Dong等，2012)，但却并不能满足国内杂交大豆育种对恢复 系辅助选育的需求。
[0004] M型大豆细胞质雄性不育系W931A是张磊等（1997)利用栽培大豆品种间 杂交、回交育成的不育材料，不育性彻底，并获农业部植物新品种权保护（品种权号 CNA20010017. 3)。利用该不育系，先后育成了世界上第一个杂交夏大豆杂优豆1号（张磊 等，2007)和杂交大豆杂优豆2号（黄志平等，2013)。育性的遗传分析表明，大豆M型不育 系统为单基因配子体不育，育性恢复受1对显性基因恢复（张磊等，2007 ;汤复跃等，2009)。 汤复跃等（2009)虽然获得了与恢复基因连锁的分子标记，这在一定程度上提高了恢复系 选择的速度，且操作简单，但是这些标记大都与恢复基因的连锁距离较远，选择的准确性一 般较低。基于此，Wang等利用连锁分析的方法对大豆M型细胞质雄性不育恢复基因进行精 细定位，在大豆的16号染色体上发现了与恢复基因（Rf-ml)紧密连锁的分子标记。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种用于辅助鉴定大豆M型细胞质雄性不育恢 复基因Rf-ml的分子标记的引物。
[0006] 本发明要解决的另外一个技术问题是提供一种上述引物用于制备鉴定大豆恢复 性材料分子标记的方法。
[0007] 本发明要解决的还有一个技术问题是提供一种上述引物在大豆M型细胞质雄性 不育恢复基因分子标记辅助转育中的应用。
[0008] 对于用于辅助鉴定大豆M型细胞质雄性不育恢复基因Rf-ml的分子标记的引物， 本发明采用的技术方案是：引物是具有如SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有 如SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物。
[0009] 对于上述引物用于制备鉴定大豆恢复性材料分子标记的方法本发明采用的技术 方案是包括以下步骤：
[001 0] (1)大材料基因组DNA的提取；
[0011] ⑵对大豆基因组DNA进行PCR扩增；
[0012] ?〇?扩增反应体系为：41^139父]\&18七61?〇?1^1，2.0 1^浓度为让?111〇1/1上述 的上下游引物，20ng/yL模板DNA3yL，ddH201 yL ;反应总量10yL ;PCR反应在PTC-2225 热循环仪上进行，反应程序包括：94°C预变性5min，每个循环95°C变性60s，55°C退火50s， 72°C延伸60s，共30个循环，最后72°C延伸lOmin，12°C保存；
[0013] (3)反应产物在质量比8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用硝酸银染色并于凝 胶成像系统下观察，记载。
[0014] 上述引物在大豆M型细胞质雄性不育恢复基因分子标记辅助转育中的应用。
[0015] 本发明的有益效果是：
[0016] (1)本发明提供的分子标记与现有的大豆M型细胞质雄性不育恢复基因的分子标 记相比，它具有与恢复基因Rf-ml连锁更紧密的分子标记，可减少由于遗传交换而造成的 错误鉴定，而且在操作上高效、快捷。
[0017] (2)本发明提供的分子标记方法能实现对大豆M型细胞质雄性不育恢复基因资 源的快速鉴定，能从大豆中准确筛选出含恢复基因Rf-ml的品种，这些具有育性恢复能力 的大豆品种在育种中可以作为优异亲本来选育新的恢复系，有效的拓宽现有恢复系遗传基 础，增强杂交大豆的组合优势。
[0018] (3)本发明提供的分子标记方法能有效用于大豆M型细胞质雄性不育恢复系的辅 助育种。早期恢复系成型后，还必须对其恢复基因进行测交鉴定，这一方法不仅需要两个生 长季节，同时还要对大量单株进行杂交，其过程相当烦琐。而利用与恢复基因共分离的分子 标记则可以克服上述缺点，在苗期就可进行基因型筛选，有效降低恢复系选育的时间和强 度，大大提高育种工作的预见性。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0020] 图1是本发明实施例的大豆M型细胞质雄性不育恢复基因与分子标记的连锁图， 其标记与恢复基因Rf-ml之间的距离仅有0. 35cM。
【具体实施方式】
[0021] 以下是一种鉴别大豆M型细胞质雄性不育恢复基因Rf-ml的分子标记方法，其具 体实施步骤如下：
[0022] -、试验材料
[0023] 大豆M型细胞质雄性不育恢复基因分离群体：W931A/WR016经自交获得的356个 F2单株。
[0024] 二、分子标记开发
[0025] (1)分子标记的锚定
[0026] 根据Song等（2004和2010)提供的引物序列以及从大豆的基因组数据库 (http://www. phytozome. net/soybean)上得到的目标区段内的DNA序列，获得与大豆M型 细胞质雄性不育恢复基因Rf-ml相连锁的分子标记。
[0027] ⑵引物设计
[0028] 利用恢复基因Rf-ml区段内的核苷酸序列在大豆基因组网站（http://www. phytozome. net/soybean)下载其位于大豆第16染色体上的核酸序列，并对相关序列进行 分析；然后，利用 PrimerPremier5.0(http://www.premierbiosoft. com)设计引物，合成引 物的名称及序列如下：
[0029] 标记名称：GmAH1607
[0030] 退火温度：55°C
[0031] 产物大小：227bp
[0032] 上游引物（5，一 3'）：GCGTGCCTAAAAAITCATCGCCC
[0033] 下游引物（5' - 3'）：GCGAGGGGITTTACTCTTCATGT
[0034] 三、分子标记验证
[0035] (1)大豆植株基因组DNA的提取
[0036] 以苗期新鲜叶片为材料，采用CTAB法提取DNA，详细步骤如下：
[0037] 1)取大豆嫩叶2-3g，在液氮中研成粉末，倒入65°C预热30min左右的CTAB提取缓 冲液中，65°C水浴60min左右，其间轻摇3-5次；
[0038] 2)加等体积的氯仿：异戊醇（24 : 1/v : v)溶液，并充分摇匀，放在摇床上轻摇 20min ；
[0039] 3)经lOOOOrpm离心15min，将上清夜转入一个新的离心管中；
[0040] 4)加入10ml冰冻的异丙醇，上下摇匀；
[0041] 5)离心倒掉液体，加入2-3ml TE缓冲液，待完全溶解后，等体积氯仿：异戊醇再抽 提一次；
[0042] 6)经8000rpm离心5min，吸取上清液转到另一个新的离心管中；
[0043] 7)用1000 y 1体积的冰冻无水乙醇，在-20°C下静置20min以沉淀DNA ;
[0044] 8) lOOOOrpm 离心 5min，弃去上清夜；
[0045] 9) 70%乙醇800 y 1清洗两次，真空干燥机上吹干；
[0046] 10)将DNA溶于TE中，用1 %的琼脂糖凝胶电泳检测，置于-20 °C待用。
[0047] (2)分子标记的扩增和电泳检测：
[0048] 将上述的分子标记引物加入PCR反应体系，并对大豆育种群体植株的DNA进行扩 增；1〇111?0?反应体系包括 ：41^139\]\&18七61?0?1^1，2.〇1^浓度为让口111〇1/1上下 游引物，20ng/yL 模板 DNA3yL，ddH201 yL ;反应总量 10yL。
[0049] PCR反应程序包括：94°C预变性5min，每个循环95°C变性60s，55°C退火50s，72°C 延伸60s，共30个循环，最后72°C延伸10min，12°C保存；
[0050] (3)反应产物在质量比8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用硝酸银染色并于凝 胶成像系统下观察，记载。
[0051] (4)结果分析
[0052] 通过对W931A/WR016F2分离群体的356个单株DNA进行PCR扩增，其电泳产物呈 现2种类型的条带，即恢复系WR016 (Rf-ml Rf-ml)及杂种FI (Rf-mlrf-ml)的带型。经统 计，该标记在F2群体中共检测到Rf-ml Rf-ml基因型单株174个，Rf-ml rf-ml基因型单 株182个，2种基因型符合1 : 1的比例（x2=〇. 70，PaQ5=0.40)。通过对大豆细胞质雄 性不育系及其恢复系后代单株进行连锁分析，发现所筛选到的标记与雄性不育恢复基因紧 密连锁，遗传距离仅有0. 35cM(图1)。因此，通过紧密连锁标记的PCR扩增能准确区分恢复 基因Rf-ml位点的不同基因型，达到辅助育种的目的。
[0053] 以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明 的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范 围之内。
【权利要求】
1. 用于辅助鉴定大豆M型细胞质雄性不育恢复基因 Rf-ml的分子标记的引物，其特征 在于：所述引物是具有如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的上游引物和具有如SEQ ID NO :2 所示核苷酸序列的下游引物。
2. 如权利要求1所述引物用于制备鉴定大豆恢复性材料分子标记的方法，包括以下步 骤： (1) 大豆材料基因组DNA的提取； (2) 对大豆基因组DNA进行PCR扩增； PCR扩增反应体系为：4 y L TaqXMaster PCR Mix，2. 0 y L浓度为lppmol/L如权利要 求1所述的上下游引物，20ng/yL模板DNA3yL，ddH201 yL ;反应总量10yL ;PCR反应在 PTC-2225热循环仪上进行，反应程序包括：94°C预变性5min，每个循环95°C变性60s，55°C 退火50s，72°C延伸60s，共30个循环，最后72°C延伸10min，12°C保存； (3) 反应产物在质量比8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用硝酸银染色并于凝胶成 像系统下观察，记载。
3. 如权利要求1所述引物在大豆M型细胞质雄性不育恢复基因分子标记辅助转育中的 应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104450900SQ201410707704
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月1日 优先权日:2014年12月1日
【发明者】王大刚, 黄志平, 张磊, 李杰坤, 胡国玉 申请人:安徽省农业科学院作物研究所