一种用于单细胞定量分析的微流控连续进样方法及装置制造方法

一种用于单细胞定量分析的微流控连续进样方法及装置制造方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于单细胞定量分析的微流控连续进样方法和装置。这种方法和装置是以十字通道上引入辅助聚焦通道的微流控芯片为操作平台，以芯片通道末端五个宽贮液池中一定体积比的样品或电泳缓冲液提供的静压力和四路程控直流电压提供的电动为流体操控手段,来实现微流控芯片上多个微通道内样品和试剂的平行化处理、皮升级进样体积控制和连续进样操作。特别是，所公开的这种方法和装置，不仅可以提供微流控芯片上一次单细胞进样的3步操作即细胞上样、单细胞装载/捕获、单细胞溶膜及电泳分离，而且一次进样完成后，自动重复上述3步操作，实现单细胞连续进样。
【专利说明】一种用于单细胞定量分析的微流控连续进样方法及装置

【技术领域】：
[0001] 本发明属于单细胞分析【技术领域】，涉及一种可以提供微流控芯片上"细胞上样、单 细胞捕获/装载、单细胞溶膜和胞内组分电泳分离"等操作的进样方法和装置，尤其涉及一 种用于单细胞定量分析的微流控连续进样方法和装置。

【背景技术】：
[0002] 单细胞定量分析是一类在单个细胞尺度上实现单细胞进样、多参数测量和胞内组 分信息定量获取的全新实验技术。该技术的发展与完善，不仅可以在单细胞层面、分子水平 上为生命科学、医药健康等学科的分析和研究提供重要的技术支撑，而且可以为生命奥妙 的诠释以及疾病机制与诊疗手段的探索提供全新的信息，从根本上推动疾病早期诊断、新 药创制等相关领域的跨越式发展。
[0003] 单细胞进样作为单细胞定量分析不可或缺的关键步骤，其作用是从群体细胞中 精确捕获单个目标细胞，将其受控装载/送入分离通道或预定位点，并完成观测、溶膜、电 泳分离等操作。良好的进样方法除了包括对分析结果重要影响的因素如超小体积（单细 胞）样品的获取与进样体积的可控、连续进样与较高通量等特征外，进样方法的简单、可重 复、易于其他操作集成等特征不能忽视。
[0004] 受细胞尺度小、受试进样体积下降、检测精度和分析速度提升等条件的限制，目前 用于单细胞分析研究的进样操作还高度依赖于传统的生命化学分析手段和操作者的细致 程度。例如显微镜下的微管吸吮、光镊、磁镊、膜片钳及流式细胞术等。这些操作虽然可行， 但是缺点明显：（1)大量的操作都是在开放环境中进行，操作过程时间长，极难进行样品污 染的控制，而对于单细胞定量分析而言，由于样品量极少，极其微量的污染将导致严重的结 果错误；（2)大多数操作存在细胞样品与试剂操作的不平行现象，不仅减缓了实验进度，而 且很难保证单细胞进样与样品进样体积的操控精度；（3)大量的耗时操作，不仅导致实验 通量无法上升，同时还导致很多对操作时间要求较高的实验无法实现；(4)尽管流式细胞 术能对完整的细胞进行快速检测和分类，但由于不能对单细胞内的组分进行电泳分离，难 以得到精确的定量信息；（5)常规的实验器具不仅需要较大的受试细胞样本，而且很难适 合干细胞、元祖细胞等珍稀样本，导致较高的空载率以及假阳性与假阴性结果的较大系统 误差，使得精细的定量结果掩盖在设备带来的噪音中。
[0005] 微流控技术作为近年来能够精确操控微尺度生化流体的一种新兴手段，其微米 级的通道尺度与细胞直径具有良好的相符性，为实现单细胞的操纵和微环境调控提供了 极为便捷的条件，因而该技术已成为单细胞进样与定量分析研究的重要手段。微流控单 细胞进样通常包括微流控芯片上的"细胞上样、单细胞捕获/装载、单细胞溶膜及电泳分 离"等多步复杂操作。迄今为止，微流控单细胞进样按进样策略可以分为：（1)阀控泵进 样（Science. 2007, 315, 81-84.); (2)电动进样，主要模式有简单进样（J. Chromatogr. A，2005, 1063, 227 - 233.)、夹流进样（J. Chromatogr. A. 2009, 1216, 6746 - 6751.)和门 式进样（Lab Chip, 2011，11，1144 - 1150.); (3)负压进样（Lab Chip, 2010, 10, 1472 - 1475.) ; (4)压力结合电动的进样（Electrophoresis 2010, 31，1630 - 1636.)。阀控泵进 样需要机械微泵驱动细胞流体，外部气泵与芯片上多个微阀的联动来控制单细胞的捕获和 溶膜。这类方法的不足为：所用芯片加工复杂，方法实施高度依赖于复杂操作，并不适合大 规模的商业化使用。电动进样通过切换施加到芯片液池上的电压，可以在简单"十字"或双 "T"结构芯片上完成细胞上样、单个细胞的捕获、溶膜及电泳分离。这类方法简便灵活、易于 与芯片耦合和整个仪器系统的小型化；但是电动进样也存在样品歧视效应，同时过高的电 压（电场强度）会造成细胞样品的不可逆损伤。负压进样利用施加到"十"字芯片样品废 液端（SW)和缓冲液废液端（BW)的负压，实现细胞上样和单细胞装载。该类方法可以在一 定程度上解决电动进样中样品歧视效应的问题，但其控制进样体积的能力有限，方法实施 依赖于多个仪器设备的联动和多步复杂操作；同时该方法也存在一个难以解决的矛盾，即 如果采用玻璃基质芯片有利于电泳分离，但与气动器件耦合困难，而采用聚二甲基硅氧烷 (PDMS)弹性体芯片有利于与气动器件的耦合，但电泳分离困难。压力结合电动的进样则是 利用施加到"十"字芯片样品废液端（SW)上的负压或静压力，实现细胞上样，然后撤销负压 或静压力，在分离通道两边施加一个电场，并借助显微镜观察实现单细胞的捕获与装载。该 类方法无样品歧视效应，对细胞无损伤。但是该方法实施依赖于人工的多步操作，同时由于 其静压力采用传统贮液池（即贮液池的高度大于其内径），贮液池的液面随着流体的流出 而下降，使得流速随液面下降而明显减少，难以适应进样体积精确调控和较长时间的连续 进样操作。总体而言，现有的微流控单细胞进样方法仍存在以下共性问题：（1)难以实现连 续进样。目前的进样方法在完成一次进样及分析后，通常需要中断分析过程，然后进行流体 操控手段及样品、试剂的移出，清洗芯片，新样品、试剂注入，操控手段重新施加等大量的耗 时操作，导致系统的分析通量无法上升。（2)进样效率低。目前进样的操控手段多是采用多 个独立仪器设备的简单组合，且单个细胞的捕获往往需要借助显微镜，使得样品、试剂的操 作难以平行或同步，不仅导致进样体积可控性差，还影响分析系统的稳定性。


【发明内容】
：
[0006] 本发明旨在克服现有微流控单细胞进样技术的不足，目的之一是提供一种微流 控芯片上一次单细胞进样所涉及的细胞上样、单细胞捕获/装载、单细胞溶膜及电泳分离 等多步操作，尤其是在一次单细胞进样完成后，可以自动重复上述操作，实现连续单细胞进 样，具有多次进样连续可控、进样体积可调、效率高、重现性好的用于单细胞定量分析的微 流控连续进样方法；目的之二是提供为实现目的之一的方法所使用的装置简便、操作简单 的用于单细胞定量分析的微流控连续进样装置。
[0007] 本发明的目的之一可通过如下技术措施来实现：
[0008] -种用于单细胞定量分析的微流控连续进样方法，以微流控芯片作为操作平台， 以静压力和电动作为流体操控手段；一次进样包括细胞上样、单细胞装载/捕获、单细胞溶 膜及电泳分离三步操作；一次进样完成后，自动重复上述三步操作，即可实现多次连续进 样；
[0009] 所述的微流控芯片，其通道末端的五个宽贮液池分别定义为样品池 S、辅助聚焦液 池 A、样品废液池 SW、缓冲液池 B和缓冲液废液池 BW ;其通道之间的二个交叉口分别定义为 "聚焦"交叉口 J和"十字"交叉口 C，样品池 S经过交叉口 J、交叉口 C到样品废液池 SW之 间的通道S-J-C-SW定义为细胞上样通道，交叉口 J与交叉口 C之间的通道J-C定义为单细 胞捕获/装载通道，交叉口 C与缓冲液废液BW之间的通道C-BW定义为单细胞溶膜和电泳 分离通道；
[0010] 所述的静压力，包括分别依次在样品池S、辅助聚焦液池A、缓冲液池B、缓冲液废 液池BW中加入等体积的样品或电泳缓冲液，样品废液池SW中加入一定体积的电泳缓冲液， 并保证样品池S、辅助聚焦液池A、缓冲液池B、缓冲液废液池BW中样品或电泳缓冲液与样品 废液池SW中电泳缓冲液的体积比为1. 3?1. 5 :1而形成的液压差；
[0011] 所述的电动则由施加到辅助聚焦液池A、样品废液池SW、缓冲液池B和缓冲液废液 池BW上的独立或/和同步输出的四组程控直流电压（Vi、V 2、V3、V4)组成；所述的细胞上样， 采用静压力操控即样品池S、辅助聚焦液池A、缓冲液池B、缓冲液废液池BW与样品废液池 SW之间存在液压差，在交叉口 C处形成水力门控，此时从样品池S流出的细胞样品经过从辅 助聚焦液池A流出电泳缓冲液流的挤压在通道J-C处形成二相层流的线状细胞流，并经交 叉口 C流向样品废液池SW ;与此同时从缓冲液池B和缓冲液废液池BW流出的电泳缓冲液 流与交叉口 C处的线状细胞流汇合形成三相层流（两边为电泳缓冲液流，中间为线状样品 流）后流向样品废液池SW，从而避免上样通道S-J-C-SW内的细胞样品向分离通道C-BW的 扩散；
[0012] 所述的单细胞捕获/装载，采用电动操控即样品池S不施加电压，辅助聚焦液池 A施加低电压，缓冲废液池BW施加OV电压（接地），样品废液池SW和缓冲液池B为"悬空 (既不施加电压，也不接地）"，此时在电压（电场）的作用下捕获通道J-C中的单个细胞， 并装载送入分离通道C-BW，从而实现单细胞的捕获/装载与样品进样体积的控制；
[0013] 所述的单细胞溶膜及电泳分离，采用电动操控即样品池S不施加电压，辅助聚焦 液池A "悬空"，缓冲液池B、样品废液池SW、缓冲液废液池BW分别施加2500V、1500V、0V的 电压，在交叉口 C处形成电动门控，此时在电动作用下从缓冲液池B引出的电泳缓冲液流经 交叉口 C后分成两股流体：一股流向缓冲液废液池BW的流体将被捕获/装载到分离通道 C-BW中的单细胞进行溶膜和胞内组分电泳分离，而另一股流体则流向样品废液池SW，以避 免上样通道S-J-C-SW中的细胞向分离通道泄露而影响单细胞分析结果的有效性。
[0014] 至此,一次单细胞进样完成，自动重复上述3步操作（细胞上样,单细胞装载/捕 获，单细胞溶膜及电泳分离），即可实现连续进样。
[0015] 本发明的目的之一还可通过如下技术措施来实现：
[0016] 本发明所述的样品为细胞悬液或其他生化液体样品；所述的单细胞捕获/装载与 样品进样体积的控制也可以通过优化调节静压力、细胞密度、单细胞捕获/装载操作的电 压及运行时间来实现。
[0017] 本发明的目的之二可通过如下技术措施来实现：
[0018] 该用于单细胞定量分析的微流控连续进样装置包括微流控芯片、四路程控直流电 压；
[0019] 所述的微流控芯片，结构为"十字"通道上引入辅助聚焦通道，通道之间有两个交 叉口即"聚焦"交叉口 J和"十字"交叉口 C，两个交叉口将微流控芯片的通道分成S-J (细胞 悬液通道）、A-J(辅助聚焦通道）、J-C (单细胞捕获/装载通道）、C-B (电泳缓冲液通道）、 C-SW (细胞悬液及电泳缓冲废液通道）、C-BW (单细胞溶膜和电泳分离通道）六个隔段；其 通道的末端分别安装有五个相同结构的宽贮液池，每个宽贮液池的结构为上下同心圆筒， 上部圆筒的内径大于其高度2?3倍，下部圆筒与芯片通道末端链接；
[0020] 所述的四路程控直流电压，包括串行通信接口（RS232)、单片机（MCS-51)、DA转换 器（DAC7614)、DC - DC高压电源模块、外接键盘和数码显示；其对外接口有2个即串行通 信接口和四路直流电压（Vi、V2、V 3、V4);每路直流电压（"电压/接通"、"0V/接地"、"悬空 /断开"）的输出设定由外接键盘或者串行通信接口 RS232连接的计算机（上位机）实现， 每路直流电压的输出显示则由数码管或上位机实现；基于预先设定的实验参数，单片机控 制四路直流电压的独立或/和同步的可编程输出流程与连续进样的操作步骤对应一致。
[0021] 将本发明应用于细胞或其他生化样品的连续进样及定量分析，实施装置还包括激 光诱导荧光检测系统或者其他检测单元，以便进行进样流形观察、进样条件优化、测定电泳 分离的有关组分及其含量。
[0022] 本发明的优点：
[0023] 1、样品池S中始终不加电压的进样方法，可以有效避免单细胞溶膜、电泳分离阶 段高电压对样品池内细胞的损伤；
[0024] 2、芯片液池采用宽贮液池的设计，在保持液池液面下降缓慢的同时，可以保证较 长时间的流速稳定，便于提高进样体积控制和连续进样操作的稳定性；
[0025] 3、芯片结构采用"十字"通道引入辅助聚焦通道的设计，不仅可以提供细胞上样、 单细胞捕获/装载操作的聚焦层流控制，提高进样体积与单细胞进样的有效性，而且可以 通过在辅助聚焦液池中添加预溶膜试剂来减少后续单细胞溶膜操作的时间，以保证单细胞 的原始特性和分析结果的准确性；
[0026] 4、本发明可以提供微流控芯片上一次单细胞进样所涉及的细胞上样、单细胞捕获 /装载、单细胞溶膜及电泳分离等多步操作，尤其可以提供一次单细胞进样完成后，自动重 复上述操作，实现连续单细胞进样，具有多次进样连续可控、进样体积可调、效率高、重现性 好、装置简便、操作简单等优点。
[0027] 本发明不仅可以实现一次单细胞进样所涉及的细胞上样、单细胞捕获/装载、单 细胞溶膜及电泳分离等操作，而且具有多次单细胞进样连续可控、操作简便、便于单细胞定 量分析等优点。

【专利附图】

【附图说明】：
[0028] 图1为本发明实施例的方法原理图；
[0029] 图2为本发明实施例的装置示意图；
[0030] 图3为本发明实施例的装置应用示意图；
[0031] 图4为本发明实施例的控制进样体积及其对应的电泳图和流形图；
[0032] 图5为本发明实施例用于连续进样的电泳图及重现性；
[0033] 图6为本发明实施例用于细胞上样、单细胞捕获/装载、单细胞溶膜及电泳分离的 流形图；
[0034] 图7为本发明实施例用于单个PC-12细胞连续进样与胞内NO连续检测的电泳图；
[0035] 图8为本发明实施例用于定量分析186个PC-12细胞内NO含量的统计直方图；
[0036] 图9为本发明的进样工程示意图。

【具体实施方式】：
[0037] 下面结合附图对本发明作进一步说明。
[0038] 参见附图1 :
[0039] 图中：（1)细胞上样；(2)单细胞捕获/装载；（3)单细胞溶膜及电泳分离；S样品 池，SW样品废液池，A辅助聚焦液池，B缓冲液池，BW缓冲液废液池；黑色虚线箭头为静压力 驱动的液流方向，黑色实线箭头为电场方向；浅灰色实心圆点为细胞悬液，黑色实心圆点为 捕获/装载和溶膜的（目标）单细胞；天蓝色为电泳缓冲液。
[0040] 本发明的方法包括如下步骤：
[0041] 第一步，细胞上样。首先在样品池S与辅助聚焦液池A、缓冲液池B、缓冲液废液池 BW中分别依次加入等体积的样品（细胞悬液或其他生化液体样品）和电泳缓冲液，样品废 液池SW中加入一定体积的电泳缓冲液，并保证样品池S、辅助聚焦液池A、缓冲液池B、缓冲 液废液池BW中样品或电泳缓冲液与样品废液池SW中电泳缓冲液的体积比为1. 3-1. 5:1。 随后将四路程控直流电压（Vi、V2、V3、V4)的钼丝电极对应插入辅助聚焦液池A、样品废液池 SW、缓冲液池B和缓冲液废液池BW，并按表1的输出方式启动四路程控直流电压的输出。此 时，由于四路程控直流电压的输出均为"悬空"，样品池S、辅助聚焦液池A、缓冲液池B、缓冲 液废液池BW与样品废液池SW之间存在液压差，芯片内的流体（样品和电泳缓冲液）只受 静压力操控，并在交叉口 C处形成水力门控（附图1，（1))，使得从样品池S中流出的细胞 样品经过从辅助聚焦液池A流出的电泳缓冲液流的挤压在通道J-C处形成二相层流的线状 细胞流，并经交叉口 C流向样品废液池SW ;与此同时从缓冲液池B和缓冲液废液池BW流出 的电泳缓冲液流与交叉口 C处的线状细胞流汇合形成三相层流后流向样品废液池SW，从而 避免上样通道S-J-C-SW内的细胞向分离通道扩散。
[0042] 表1 :四路程控直流电压用于连续进样的典型输出

【权利要求】
1. 一种用于单细胞定量分析的微流控连续进样方法，其特征在于：以微流控芯片作为 操作平台，以静压力和电动作为流体操控手段；一次进样包括细胞上样、单细胞装载/捕 获、单细胞溶膜及电泳分离三步操作；一次进样完成后，自动重复上述三步操作，即可实现 多次连续进样； 所述的微流控芯片，其通道末端的五个宽贮液池分别定义为样品池S、辅助聚焦液池 A、样品废液池SW、缓冲液池B和缓冲液废液池BW ;其通道之间的二个交叉口分别定义为"聚 焦"交叉口 J和"十字"交叉口 C，样品池S经过交叉口 J、交叉口 C到样品废液池SW之间 的通道S-J-C-SW定义为细胞上样通道，交叉口 J与交叉口 C之间的通道J-C定义为单细胞 捕获/装载通道，交叉口 C与缓冲液废液BW之间的通道C-BW定义为单细胞溶膜和电泳分 离通道； 所述的静压力，包括分别依次在样品池S、辅助聚焦液池A、缓冲液池B、缓冲液废液池 BW中加入等体积的样品或电泳缓冲液，样品废液池SW中加入一定体积的电泳缓冲液，并保 证样品池S、辅助聚焦液池A、缓冲液池B、缓冲液废液池BW中样品或电泳缓冲液与样品废液 池SW中电泳缓冲液的体积比为1. 3?1. 5 :1而形成的液压差； 所述的电动则由施加到辅助聚焦液池A、样品废液池SW、缓冲液池B和缓冲液废液池BW 上的独立或/和同步输出的四组程控直流电压（Vi、V2、V3、V4)组成； 所述的细胞上样，采用静压力操控即样品池S、辅助聚焦液池A、缓冲液池B、缓冲液废 液池BW与样品废液池SW之间存在液压差，在交叉口 C处形成水力门控，此时从样品池S流 出的细胞样品经过从辅助聚焦液池A流出电泳缓冲液流的挤压在通道J-C处形成二相层流 的线状细胞流，并经交叉口 C流向样品废液池SW ;与此同时从缓冲液池B和缓冲液废液池 BW流出的电泳缓冲液流与交叉口 C处的线状细胞流汇合形成三相层流后流向样品废液池 SW，从而避免上样通道S-J-C-SW内的细胞样品向分离通道C-BW的扩散； 所述的单细胞捕获/装载，采用电动操控即样品池S不施加电压，辅助聚焦液池A施加 低电压，缓冲废液池BW施加0V电压（接地），样品废液池SW和缓冲液池B为"悬空"，此时 在电压（电场）的作用下捕获通道J-C中的单个细胞，并装载送入分离通道C-BW，从而实现 单细胞的捕获/装载与样品进样体积的控制； 所述的单细胞溶膜及电泳分离，采用电动操控即样品池S不施加电压，辅助聚焦液池 A "悬空"，缓冲液池B、样品废液池SW、缓冲液废液池BW分别施加2500V、1500V、0V的电压， 在交叉口 C处形成电动门控，此时在电动作用下从缓冲液池B引出的电泳缓冲液流经交叉 口 C后分成两股流体：一股流向缓冲液废液池BW的流体将被捕获/装载到分离通道C-BW 中的单细胞进行溶膜和胞内组分电泳分离，而另一股流体则流向样品废液池SW，以避免上 样通道S-J-C-SW中的细胞向分离通道泄露而影响单细胞分析结果的有效性。
2. 根据权利要求1所述的一种用于单细胞定量分析的微流控连续进样方法，，其特征 在于：所述的样品为细胞悬液或其他生化液体样品。
3. 根据权利要求1所述的一种用于单细胞定量分析的微流控连续进样方法，其特征在 于：所述的单细胞捕获/装载与样品进样体积的控制也可以通过优化调节静压力、细胞密 度、单细胞捕获/装载操作的电压及运行时间来实现。
4. 一种用于单细胞定量分析的微流控连续进样装置，其特征在于：该装置包括微流控 芯片、四路程控直流电压； 所述的微流控芯片，结构为"十字"通道上引入辅助聚焦通道，通道之间有两个交叉口 即"聚焦"交叉口 J和"十字"交叉口 C，两个交叉口将微流控芯片的通道分成细胞悬液通 道、辅助聚焦通道、单细胞捕获/装载通道、电泳缓冲液通道、细胞悬液及电泳缓冲废液通 道、单细胞溶膜和电泳分离通道六个隔段；其通道的末端分别安装有五个相同结构的宽贮 液池，每个宽贮液池的结构为上下同心圆筒，上部圆筒的内径大于其高度2?3倍，下部圆 筒与芯片通道末端链接； 所述的四路程控直流电压，包括串行通信接口（RS232)、单片机（MCS-51)、DA转换器 (DAC7614)、DC - DC高压电源模块、外接键盘和数码显示；其对外接口有2个即串行通信接 口和四路直流电压（Vi、V2、V3、V4);每路直流电压的输出（"电压/接通"、"0V/接地"、"悬 空/断开"）设定由外接键盘或者串行通信接口 RS232连接的计算机（上位机）实现，每路 直流电压的输出显示则由数码管或上位机实现；基于预先设定的实验参数，单片机控制四 路直流电压的独立或/和同步的可编程输出流程与连续进样的操作步骤对应一致。
【文档编号】C12M1/00GK104388300SQ201410707828
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月27日 优先权日:2014年11月27日
【发明者】唐波, 李忠义, 李清岭 申请人:山东师范大学