专利名称：一种八宝景天基因组dna的提取方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学实验中植物基因组DNA的分离提取技术，具体涉及一种八宝景天基因组DNA的提取方法。
背景技术：
八宝景天(5^￡/應是景天科景天属肉质草本植物,性喜强光,耐贫瘠和干旱，也能耐一 25°C的低温，管理粗放，病虫害少，是一种不可多得的优良园林绿化材料。作为景观工程，八宝景天的群体绿化效果极佳，也是很好的模纹材料。同时可以全草入药，具有祛风利湿，活血散瘀，止血止痛的功效。八宝景天中含有丰富的多糖和其他次生代谢产物，这让它具有了较高的利用价值，但同时给其基因组DNA的提取也带来了较大的困难。由于多糖的某些物理性质与核酸极为相似，在沉淀DNA过程中，多糖与DNA发生共沉淀而难以分离，因而影响了所提取的DNA质量，使得无法以DNA为模板进行后续的实验研究。
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基因组DNA的提取是分子生物学研究中的关键环节之一。所提取的基因组DNA的质量和产量将直接影响分子生物实验中与DNA有关的下游实验。目前，已报道了多种植物DNA提取方法，笔者通过研究发现，多数DNA提取方法并不适用于景天植物的DNA提取如常规CTAB法和SDS法，这些提取方法仅对含有极少量多糖、多酚等植物有效，而对于多糖、多酚等含量高的植物基本无效。有些方法虽然能够获得基因组DNA，但所提取的基因组DNA质量不高，而且整个操作复杂。笔者在前人研究的基础上，经过大量的研究实验，在常规CTAB提取方法的基础上，经过改良获得了一种高效提取景天植物基因组DNA的方法。此方法在操作步骤上与常规CTAB基本相同，但在提取液方面添加了可溶性PVP和SDS，另外，加大了β -巯基乙醇量，使得所提取的景天基因组DNA质量大大提高，可用于后续实验研究。
发明内容
本发明的目的在于针对八宝景天富含多糖、多酚、多蛋白及自身组织的特点，提出了一种八宝景天基因组DNA提取方法。为实现此目的本发明公开了如下的技术内容
一种八宝景天基因组DNA的提取方法，其特征在于按以下的步骤进行
(I)取O. 2g新鲜叶片放入研钵中,加入O. 02g-0. 04g石英砂,用液氮充分研磨成粉末，加入预热的O. 5mL 2% CTAB提取液溶解；
所述的2% CTAB混合提取液是由下述原料组成
2% CTAB2g/100mL
2%SDS2g/100mL
2%PVP、2g/100mL
pH 值为 8. 0 的 0. lmol/LTris-Cl I. 1214g/100mL20mmol/LEDTA0. 744g/100mL
I. 4mol/LNaCl8. 19g/100mL
10% 的 β-巯基乙醇10ml/100mL。
(2)在55°C 65°C下温浴45分钟,取出冷却后再加入O. 5-lmL氯仿-异戍醇混合液，常温下12000-15000转/分，离心10-15分钟；其中氯仿与异戊醇的体积比为24 : I ;
(3)取上清液转入新离心管，再加入等体积的氯仿-异戊醇混合液(其中氯仿与异戊醇的体积比为24 1)，常温下12000-15000转/分，离心10-15分钟；
(4)取上清液再转入新离心管，并加入上清液2/3体积的冰冷异丙醇混合，-20°C条件下放置15-30分钟沉淀DNA ；
(5)8-10°C，12000-15000转/分，离心10-15分钟，弃上清液，回收沉淀，用70%乙醇洗涤2次，风干后加入pH值为8. O的TE缓冲液80-100 μ I ;然后加入5-8 μ L RNase, 37°C保温1-1. 5小时，置于-20°C条件下保存；所述的TE缓冲液包括10mmol/L pH=8. O的Tris-Cl和 ImmoI/L 的 EDTA。本发明所述的提取方法,其中步骤(5)所使用的RNase,储藏浓度为10mg/mL,终浓度为 O. 5mg/mL。 上述步骤(I)所使用的2% CTAB 提取液包括:2% CTAB,2% SDS、2%PVP、0. ImoI/LTris-HCl (ρΗ=8· 0)、20mmol/L 的 EDTAU. 4mol/L 的 NaCl 以及 10% 的 β -巯基乙醇。上述2% CTAB提取液所包含的各试剂分别是CTAB即十六烷基三甲基溴化铵，是阳离子表面活性剂，可溶解细胞膜，与核酸形成复合物，其终浓度为2g/100mL。SDS为十二烷基磺酸钠，是一种已知的能够使蛋白质变性的去污剂，在较高温度下，破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来，其终浓度为2g/100mL。TriS-Cl即三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，提供一个pH值缓冲环境，具有缓冲pH值作用，其终浓度为O. lmol/L。 EDTA即乙二胺四乙酸是金属螯合剂，可螯合镁离子或锰离子，抑制DNA酶的活性。I. 4mol/L的NaCl提供高盐环境，使核酸充分溶解，其终浓度为I. 4mol/L。巯基乙醇是抗氧化剂，能有效防止酚氧化成为醌，避免褐变，有利于酚的去除，其终浓度为lOmL/lOOmL。上述步骤(I)中所使用的PVP即聚乙烯吡咯烷酮是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物，有效去除酚类物质，减少DNA中酚的污染；同时能与多糖结合，能有效去除多糖，其终浓度为2g/100mL。上述步骤(2)和步骤(3)抽提时所使用的氯仿-异戊醇混合液，其氯仿与异戊醇的体积比为24 I的最佳剂量配比。上述步骤(5)中所使用的70%酒精为100%酒精与去离子水体积比为7 3配制。上述步骤(5)中所使用的TE缓冲液包括10mmol/L的Tris-Cl和lmmol/L的EDTA,所述TE缓冲液的pH值为8. O。上述步骤(5)所使用的RNase即RNA酶，用于催化降解其中的RNA，储藏浓度为10mg/mL,终浓度为 0. 5mg/mL。上述技术方案中可将步骤(2)、步骤(3)以及步骤(5)中所涉及的高速离心步骤的转速均设置为12000-15000转/分，优选12000转/分，持续10-15分钟，特别设置的离心转速和时间，能够带来在适宜的时长前提下最大限度地提高抽提时液相和有机相的分离效果，保证后续步骤顺利进行。上述技术方案在步骤(I)的叶片研磨时加入少量石英砂，石英砂具有良好的破细胞壁作用，可提高研磨的效果，使得样品DNA的提取质量得到提高。另外，提取DNA时，选用新鲜的八宝景天叶片可以有效提高所得到的DNA质量。本发明在CTAB溶液中加入SDSJI强了去蛋白能力；同时使用PVP和大剂量的β_巯基乙醇有助于防止酚类物质被氧化及多糖的去除；采用在低温条件下沉淀DNA，更有助于获得更多DNA。本发明公开的八宝景天DNA提取方法的优点在于
I、在步骤(I)中加入了 2%体积的PVP，PVP是一种抗氧化剂，能与多酚形成一种不溶的络合物，有效去除酚类物质，这对于含有较多酚类物质的干制材料具有非常明显的除酚作用，从而能够有效地减少提取DNA过程中酚的污染，并且PVP能与多糖聚合，对于含有大量多糖和多酚类物质的八宝景天，能够起到非常有效祛除多糖的效果。2、步骤(3)在步骤(2)的第一次抽提之后再进行二次抽提，能够进一步提高DNA的纯度，并保证后续步骤的可靠性。
3、在步骤(2)与步骤(3)进行抽提时所加入的氯仿-异戊醇混合液，氯仿可使蛋白质变性，并有助于液相和有机相的分离，而异戊醇则可以消除抽提过程中出现的气泡。4、步骤(5)使用的TE缓冲液中含有的EDTA可抑制DNA酶的活性，并且TE缓冲液是弱碱性，对DNA的碱基有保护作用，使DNA更好的保存。5、步骤(5)中所加入的RNase即RNA酶，能够有效充分地去除RNA，从而使得提取的DNA纯度更高，也能避免RNA对后续实验的干扰。
图I是采用已报道的提取方法所提取的八宝景天基因组DNA凝胶电泳 图2是具体实施方式
为未加入RNase处理所提取八宝景天基因组DNA凝胶电泳 图3是具体实施方式
为加入RNase处理所提取八宝景天基因组DNA凝胶电泳图。
具体实施例方式为了更充分的解释本发明的实施，提供下述制备及检验方法的实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。下面通过典型的实施例对本发明做进一步的说明。需要加以说明的是所用到的实验用药品除CTAB、SDS和RNase购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司外，其余试剂均购自天津市江天化工技术有限公司。实施例I
(1)取O.2g新鲜叶片放入研钵中,加入少量(O. 02g)石英砂,用液氮充分研磨成粉末，加入预热的O. 5mL 2% CTAB混合提取液溶解，2% CTAB混合提取液包括2% CTAB、2%SDS、2%PVP、0. lmol/L 的 Tris_Cl、20mmol/L 的 EDTA、1. 4mol/L 的 NaCl 以及 10% 的 β -巯基乙醇，所述Tris-Cl的pH值为8. 0，装入I. 5mL离心管；
(2)放入水浴锅中60°C温浴45分钟，取出冷却后再加入约O.5mL的氯仿-异戊醇混合液后混合，氯仿-异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的配比为24 1，常温下12000转/分离心10分钟；
(3)取上清液转入离心管，再加入等体积的氯仿-异戊醇混合液(其中氯仿与异戊醇的配比为24 I)后混合，常温下12000转/分离心10分钟；
(4)取上清液转入离心管，加入2/3体积的冰冷异丙醇后混合，_20°C条件下放置15分钟；
(5)10°C 12000转/分离心10分钟，弃上清液，回收沉淀，用70%乙醇洗涤2次，风干后加入 100 μ L TE 缓冲液，TE 缓冲液包括 IOmmoI/L ρΗ=8. O 的 Tris-Cl 和 lmmol/L 的 EDTA,所述TE缓冲液的pH值为8. 0，然后加入5μ L RNase，37 °C保温I小时，置于_20°C条件下保存。实施例2
八宝景天基因组DNA的提取方法
(I)取O. 2g新鲜叶片放入研钵中,加入O. 04g石英砂,用液氮充分研磨成粉末,加入预热的O. 5mL 2% CTAB提取液溶解； 所述的2% CTAB提取液是由下述原料组成
2% CTAB2g/mL
2%SDS2g/100mL
2%PVP2g/100mL
pH 值为 8. 0 的 0. lmol/LTris-Cl I. 1214g/100mL
20mmol/LEDTA0. 744g/100mL
I. 4mol/LNaCl8. 19g/100mL
10% 的 β-巯基乙醇10ml/100mL。(2)在55°C下温浴45分钟，取出冷却后再加入ImL氯仿-异戊醇混合液，常温下12000-15000转/分，离心10分钟；其中氯仿与异戊醇的体积比为24 : I ;
(3)取上清液转入新离心管，再加入等体积的氯仿-异戊醇混合液(其中氯仿与异戊醇的体积比为24 I),常温下12000转/分，离心10分钟；
(4)取上清液再转入新离心管，并加入上清液2/3体积的冰冷异丙醇混合，-20°C条件下放置30分钟沉淀DNA ；
(5)IO0C，15000转/分，离心15分钟，弃上清液，回收沉淀，用70%乙醇洗涤2次，风干后加入PH值为8. O的TE缓冲液；然后加入8 μ L RNase, 37°C保温I. 5小时，置于_20°C条件下保存；所述的TE缓冲液包括10mmol/L的Tris-Cl和lmmol/L的EDTA。实施例1、2所得八宝景天基因组DNA检测分析
为比较不同方法提取DNA质量，分别取2PL DNA溶液进行凝胶电泳分析。1%琼脂糖(Spain)凝胶，IXTAE(上海生物工程公司)，Goldview (北京赛百盛基因技术有限公司)染色，将上样后的凝胶置于电泳槽(JUNYI JY-SP3，北京)进行110V、15分钟电泳检测DNA。利用SM紫外凝胶成像系统(Bio-best，美国)扫描成像。如图3所示，通过上述实施例所提取的DNA通过电泳检测后，观察可见清晰的条带，可见从上述各实施例中所提取的八宝景天DNA含量大、纯度高。实施例3 比较试验
Cl)已报道的提取方法所提取的八宝景天基因组DNA (见图I)
试验方法除未进行RNase处理外，所有步骤均按常规CTAB和SDS方法要求进行八宝景天基因组DNA提取。这两种方法均能获得DNA，但是DNA质量差而且所获得的DNA量也少(图1)，沉淀后的DNA有明显的褐化现象，而且还有部分多糖和蛋白发生了共沉淀。
(2)本发明的提取方法所提取的八宝景天基因组DNA (见图3) 试验方法本发明的提取方法完全按照实例I的要求进行。这种方法所提取的DNA进行电泳时，条带亮、无拖尾和弥散现象，RNase处理前后，也未发生DNA降解现象(图2、3)。从专业角度考虑，这些特点足以证明所提取的DNA为高质量的DNA，完全可用于后续的实验研究。
权利要求
1. 一种八宝景天基因组DNA的提取方法，其特征在于按以下的步骤进行 (I)取O. 2g新鲜叶片放入研钵中,加入O. 02g-0. 04g石英砂,用液氮充分研磨成粉末，加入预热的O. 5mL 2% CTAB提取液溶解； 所述的2% CTAB提取液是由下述原料组成 2% CTAB2g/100mL 2%SDS2g/100mL 2%PVP2g/100mLpH 值为 8. O 的 0. lmol/LTris-Cl I. 1214g/100mL20mmol/LEDTA0. 744g/100mL 1.4mol/LNaCl8. 19g/100mL 10% 的 β -巯基乙醇 10ml/100mL ； (2)在55°C 65°C下温浴45min,取出冷却后再加入O. 5-lmL氯仿-异戍醇混合液，常温下12000-15000转/分，离心10-15分钟；其中氯仿与异戊醇的体积比为24 : I ; (3)取上清液转入新离心管，再加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，常温下12000-15000 转 / 分，离心 10-15 分钟； (4)取上清液再转入新离心管，并加入上清液2/3体积的冰冷异丙醇混合，-20°C条件下放置15-30min沉淀DNA ； (5)8-10°C，12000-15000转/分，离心10-15分钟，弃上清液，回收沉淀，用70%乙醇洗涤2次，风干后加入pH值为8. O的TE缓冲液80-100 μ I ;然后加入5-8 μ L RNase, 37°C保温1-1. 5小时，置于-20°C条件下保存；所述的TE缓冲液包括10mmol/L pH=8. O的Tris-Cl和 ImmoI/L 的 EDTA。
2.权利要求I所述的提取方法，其中步骤(5)所使用的RNase，储藏浓度为10mg/mL，终浓度为0. 5mg/mL。
全文摘要
本发明公开了一种八宝景天基因组DNA的提取方法，包括取粉末状八宝景天，加入预热的2％CTAB提取液溶解；在65℃下温浴45min，再加入等体积的氯仿-异戊醇混合液混合后，常温下高速离心，重复两次；然后取上清加入2/3体积的冰冷异丙醇混合后，低温条件下放置15-30min沉淀DNA；低温下高速离心，弃上清液，回收沉淀，用70％乙醇洗涤2次，风干后加入TE缓冲液，然后加入RNase于37℃消化30min，得到的DNA样品置于低温下保存。本发明的提取方法中加入RNase酶能够有效充分地去除RNA，从而使得提取的DNA纯度更高，也能避免RNA对后续实验的干扰。
文档编号C12N15/10GK102876665SQ201210438729
公开日2013年1月16日 申请日期2012年11月7日 优先权日2012年11月7日
发明者周祥明, 宋建, 王姝 申请人:天津市农业生物技术研究中心