专利名称：丹波黑大豆c2h2型锌指蛋白基因stop1的植物表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及ー种丹波黑大豆根中铝诱导的C2 H2型锌指蛋白基因S/aw的植物表达载体PPZP-35S-S7TF7及其提高植物抗铝毒胁迫能力的应用。
背景技术：
铝毒是酸性土壌中植物生长和作物产量的主要限制因素。酸性土壌占世界可耕种土壌的30%，主要分布在南非、中亚和东南亚对粮食需求量最大的发展中国家。我国的酸性土壌主要分布在长江以南的热带、亚热带及云贵川等地区，面积达204万公顷，大部分土壌的PH值小于5. 5，其中很大一部分小于5. O。农业上通常依靠施加生石灰以缓解酸性土壌中的铝毒问题，然而这种方法只能改良表层土壌，并不能改变深层土壤的pH值，且耗费大量的经济和人力。因此，在降低土壌酸度的同时，挖掘植物自身的抗铝潜力，利用基因工程手段在植物中过量表达抗铝基因，是解决酸性土壌中铝毒害和农业生产可持续发展的有效策略。铝诱导的植物根尖苹果酸的分泌是植物抗铝的主要机制，苹果酸的分泌由苹果酸通道蛋白基因(也#/7)所控制。目前已从多种耐铝植物中克隆得到了ALMTl是ー类含有UPR)005结构域且具有5-7个跨膜结构域的跨膜蛋白。TaALMTl是从耐铝小麦{Triticum aestivum) ET8中克隆得到的第一个植物耐招基因，生理及电生理实验发现，招耐受性小麦品种在铝胁迫下有机酸的分泌是通过开启有机酸阴离子通道来实现。很多研究结果表明，过量表达有机酸通道蛋白基因是提高植物抗铝能力的有效手段。如抗铝小麦ET8主要的抗铝基因TaALMTl在水稻和烟草细胞中异源表达后引起铝诱导的苹果酸外流，因而提高烟草细胞的耐铝能力。将TaALMTl基因转入大麦中过量表达，转基因大麦具有与ET8相似的苹果酸分泌和抗铝能力。如Delhaize等发现表达的转基因大麦具有ー个铝激活的苹果酸流，当转基因大麦受到铝胁迫时可以增加苹果酸和对铝毒的抗性。进ー步的研究发现转基因大麦在酸性土壌上可以更有效的吸收磷元素，产量也比非转基因株系高。Pereira等在小麦种过表达TaALMTl基因，结果9个T2代转基因株系的TaALMTl表达增强，苹果酸的分泌量和铝耐受性显著提高。ー些T2代转基因株系在含有铝溶液和土壌中培养时铝耐受性都高于抗铝小麦品种ET8。抗铝油菜品种中铝诱导根的苹果酸分泌与ガ
和BnALMT2的高表达有夫。过量表达和BnALMT2的转基因烟草细胞在铝胁迫下苹果酸分泌比野生型细胞高8-11倍，鲜重增加3-4倍。AtALMTl是拟南芥的重要抗铝基因之一，该基因的突变使其对铝敏感性增加。Ryan等的研究证实过表达的转基因拟南芥RRG比野生型高大约3倍。在拟南芥中，C2H2锌指蛋白转录因子STOPl直接或间接的通过ー个信号通路控制了有机酸通道蛋白基因和招的表达，S7TF7的正常表达使拟南芥具有对低pH和铝的抗性。tSTOPトKO的拟南芥突变体中，铝诱导的苹果酸和柠檬酸的分泌受到抑制。在STOPl {STOPI-MT)诱变突变体中，与拟南芥抗铝有关的基因如—招和(铝敏感3)的表达水平也均被抑制，且与耐酸有关基因的表达也被下调。可见，STOPl通过调节耐酸和抗铝基因的表达而赋予拟南芥对酸和铝的抗性。随后Yamaji等在水稻也发现了与STOPl类似的一个锌指蛋白ARTl(铝抗性转录因子I)。然而，与S7TF7不同的是，
的表达不受铝调节且呈组成型表达的。研究发现，ARTl在水稻种调节铝诱导的30多个基因的表达，其中包括已鉴定的水稻抗铝基因，如Mg2+通道单边基因，STMV和似(ABC转运蛋白)，姻招(柠檬酸通道蛋白)等。此外，他T7还调节了水稻中的ー个Al3+转运蛋白基因#raWWramp Al3+通道蛋白)的表达。可见，该基因在水稻抗铝性中有很关键的作用。目前，大量的研究集中于在植物中过表达来源于不同植物的苹果酸通道蛋白基因(dZ#77)和柠檬酸通道蛋白基因(姻招)，而有关在植物中过表达调控这两个基因的转录因子的研究还未见报道。虽然使用突变体技术已经很明确的验证了 S7TF7在植物抗铝中的功能，但是有关在植物中过量表达该基因和提高转基因植物抗铝毒方面的应用还未见报道。 丹波黑大豆是ー种在PH值5-7的中性到弱酸性土壤可很好生长的大豆栽培品种。与普通大豆、高效磷利用基因型大豆(BTXlO)和小黒豆相比丹波黑大豆有较高的铝耐受性。本专利以丹波黑大豆为材料，克隆获得了其根中受铝诱导的C2H2型锌指蛋白基因，该基因在增加转基因烟草根苹果酸和柠檬酸分泌的同时，显著地提高了转基因烟草对铝毒胁迫的抗性。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种丹波黑大豆C2H2型锌指蛋白基因STOPl的植物表达载体，该载体是提高植物抗铝毒能力基因的植物表达载体，该载体是含有来自于丹波黑大豆根中的C2H2型锌指蛋白基因，即STOPl基因'STOPl基因的上游连接有CaMV 35S组成型启动子。本发明中所述C2H2型锌指蛋白基因STOPl的cDNA来源于丹波黑大豆(67ァmax L. cv. Tamba black),所述的来源于丹波黑大豆的基因的GenBank登录号为EU418733。本发明的另一目的是将该载体应用在制备吸收和抗铝毒能力增强的转基因植株中。上述载体中，用于构建所属植物表达载体的起始载体为PPZP-221。本发明的上述植物表达载体PPZP-35S-S7TF7由下述方法构建而成
(I)根据NCBI上大豆的公布的ORF序列(NCBI登录号为EU418733)，设计引物
为
上游引物5' -GGTACCATGTTGAATAACCTTTCCTTCC-3'
下游引物5, -GGTACCGATAGCGACAATTTATAA-3'
上游引物5’端和3’端加GGTACC特征序列，并由此形成ぬwI酶切位点，以丹波黑大豆第一链cDNA为模板扩增，得到STOPl基因的全长cDNA ；
2)回收并纯化全长基因cDNA片段，并将其连接到pMD_18T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18-^7TF7 ；(3)构建植物表达载体pPZP-SSS-^ra/V，使用KpnI酶切pMDlS-^ra/^和pPZP-211，获得目的片段S7TF7和pPZP-211 (含CaMV 35S启动子)，回收后进行连接、转化感受态细胞，获得STOPi的植物表达载体ppzp-sss-sra/^。本发明使用pPZP-221植物表达载体，该表达载体含有组成型CaMV 35S启动子，构建的植物表达载体中含有基因，以便在转基因植物中过量表达C2H2型锌指蛋白基因，由于该基因编码的蛋白调节了烟草中苹果酸通道蛋白基因和柠檬酸通道蛋白基因的表达，因此增强了植物苹果酸和柠檬酸分泌的同时，也提高了转基因植物的抗铝能力和降低了植物根尖对铝的吸附。
图I是本发明中间载体pMDis-sraw的构建策略；
图2是本发明中间载体pMD18-S7rF7的构建产物电泳示意图；其中k I STOPl的PCR 扩增产物，图中1，2和3为使用铝处理的植物根提取的RNA反转录合成cDNA第一链为模板的扩增产物，4为Maker III ；B是重组质粒pMD18-^7rF7的提取产物，图中1_11为重组质粒，12 为 Maker III ；
图3是本发明中间载体pMDlS-^ra/^的检测电泳示意图；其中A是重组质粒pMD化-STOP I的PCR检测，图中I -6为重组质粒，I为Maker III ; B是重组质粒pMD I^-STOPl的酶切检测，图中1-3为重组质粒的KpnI酶切检测，4 Maker III ；
图4本发明中所述植物表达载体pPZP-35S-S7TF7的构建策略；
图5本发明中植物表达载体pPZP-35S-S7TF7的检测电泳示意图；其中A是pPZP-221和pMDlS-Sra/^的ぬ7/ 1酶切图，图中1-3为pPZP-221经KpnI酶切，4为pPZP-221未经酶切的对照质粒，5为Maker 111,6-8为pMDlS-^raW经KpnI酶切；B是植物表达载体V l -^~ST0P1的质粒PCR检测示意图，图中1-4为pPZP-SSS-Sra/^质粒，5为MakerIII ;
图6本发明中植物表达载体pPZP-35S-S7TF7的检测电泳示意图；其中A是植物表达载体PPZP-35S-S7TF7的质粒酶切检测，图中I为使用ぬWI酶切后的电泳图，2为Maker III ；B是为含有植物表达载体PPZP-35S-S7TF7农杆菌的菌落PCR检测，图中1_8为农杆菌转化子，9为pPZP-SSS-^ra/^的正对照，10为水负对照，11为Maker III。图7是本发明STOPl转基因烟草的中基因组水平和转录水平的检测电泳示意图；其中A是转基因植物的基因组水平的检测图，图中I为Maker III，2_6为转基因株系，7为未转基因的野生型植物，8为pPZP-35S-S7TF7质粒的正对照；B是RT-PCR分析转基因植物STOPl的表达水平检测图，图中1-4为转基因植物，5为对照，以烟草的18s rRNA为内參；
图8是本发明中转基因植物和野生型植物根尖苹果酸的分泌结果比较示意图，图中+Al为0. 5 mM CaCl2 (pH4. 2)的处理液中添加30 u M AlCl3处理24 h，_Al为不添加AlCl3的CaCl2溶液(pH4. 2)处理24 h，WT为野生型烟草，S1-S5为转基因株系；
图9是本发明中转基因植物和野生型植物根尖柠檬酸的分泌结果比较示意图，图中+Al为0. 5 mM CaCl2 (pH4. 2)的处理液中添加30 u M AlCl3处理24 h，_Al为不添加AlCl3的CaCl2溶液(pH4. 2)处理24 h，WT为野生型烟草，S1-S5为转基因株系；
图10是本发明中转基因植物和野生型植物根尖总有机酸(苹果酸和柠檬酸)的分泌结果比较示意图，图中+Al为0. 5 mM CaCl2 (pH4. 2)的处理液中添加30 y M AlCl3处理24h，-Al为不添加AlCl3的CaCl2溶液(pH4. 2)处理24 h。WT为野生型烟草，S1-S5为转基因株系；
图11是本发明中转基因烟草和野生型烟草的抗铝能力一一铝胁迫下根的相对生长率分析示意图，图中WT为野生型烟草，S1-S5为转基因株系；
图12是本发明中转基因烟草和野生型烟草的抗铝能力一一铝胁迫后根尖铝含量分析示意图；图中WT为野生型烟草，S1-S5为转基因株系。
具体实施例方式本实施例中试剂主要分为分子生物学实验 试剂、植物遗传转化所需的培养基以及转基因植物鉴定和检测所需的各种试剂。各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自博大泰克生物技术有限公司，TRIzoL Reagent RNA 提取试剂盒、Gateway LR clonase Enzyme Mixkit购自invitrogen公司。其余试剂均为国产分析纯。本实施例中仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所有引物序列均在大连宝生物公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例I 'STOPl基因cDNA扩增、TA克隆和序列分析 根据NCBI上GmSTOPl的公布的ORF序列，设计引物为
上游引物5' -GGTACCATGTTGAATAACCTTTCCTTCC-3'
下游引物5, -GGTACCGATAGCGACAATTTATAA-3'
上游引物5’端和3’端加GGTACC特征序列，并由此形成ぬwI酶切位点，以丹波黑大豆第一链cDNA为模板扩增，得到STOPl基因的全长cDNA ；
抗铝大豆品种丹波黑大豆经铝处理24 h后，剪取0. Ig根，使用液氮研磨后加入Iml的TRIzoL提取液,室温静置5min后移入离心管,再加入0. 2ml氯仿,振荡混勻，离心15min(12000rpm),转移上清液至新管,加入0. 5ml异丙醇，混勻室温放置lOmin, 4°C离心IOmin(12000rpm),弃上清，沉淀用75%こ醇Iml清洗,4°C离心5min (7500rpm),弃こ醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20iU焦碳酸ニこ酯(DEPC)处理水溶解RNA，取I y I电泳检测(见图 2A)。使用 M-MuLV Reverse Transcriptase Kit (TaKaRa)进行 cDNA 的合成，取植物总RNA 约 0. liig-5iig，oligo(dT) 50ng, IOmM dNTP mix I ii 1，用 DEPC 处理水补足至 10 y 1，混匀后，短暂离心将之收集于管底，置于72°C加热5min，冰浴lOmin，加入反应混合物9 yl(5Xreaction buffer 4u l,25mM MgCl2 4u 1,0. IM DTT 2 ii 1，RNA 酶抑制剂 I y 1)，将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25°C保温2min，加入Iiil M-MuLV ReverseTranscriptase,将上述混合物混勻，短暂离心将之收集于管底,25°C保温20min,然后42°C保温70min,合成cDNA。以cDNA为模板，用基因上下游特异性引物进行PCR，扩增得到全长的序列(图2A)。切胶回收并纯化全长基因片段，并将其连接到PMD-18T (大连宝生物公司)载体上(图1)，转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞(天根生化科技)，采用碱裂解法提取质粒DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳，选取大小和理论值相符的重组质粒做进ー步的双酶切并测序和测序(图2B)。使用重组质粒为模板进行PCR检测，结果表明，所挑取的均为阳性克隆，可以扩增出大小约为I. 2 kb的条带(图3A)。根据阳性重组质粒pMDlS-SraW载体两端的多克隆位点，用ぬ7/7/酶切重组质粒，经I %琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，连接成功的重组质粒pMD18-
STOPl单酶切产物理论上为I. 2kb左右的条带(图3B)。测序结果表明，STOPl的ORF全长序列为1245bp，且编码了一个编码由414个氨基酸组成的跨膜蛋白。预测的STOPl蛋白由四个锌指结构域组成，其中ZF1、ZF2和ZF4为典型的Cys2His2型锌指结构域，而ZF3为Cys2HisCys型锌指结构域，这与AtSTOPl和ARTl的锌指结构域是相似的，W0LF-PS0RT软件分析分析显示，该蛋白主要定位在细胞核内。
实施例2:构建植物表达载体pPZP-sss-sra/^
用KpnI酶切PMD18-S7TF7和pPZP-221载体(图5A)，通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段，分别回收PMD18-S7TF7被切割后产生的STOPl基因片段(约I. 2kb)和pPZP-221被切割后产生的线性载体片段pPZP-221，然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接pPZP-221和STOPl基因的DNA片断产生植物表达载体pPZP_35(图4)。用反应混合物转化高效率(IO8)的大肠杆菌感受态细胞(DH5 a，购自天根生化科技公司)，把转化好的大肠杆菌涂于加有壮观霉素(Spe，50 u g/ml)的平板上，于37で过夜培养，筛选Spe抗性重组子菌落。从Spe抗性重组子菌落中提取质粒，进行PCR检测(图5B)。用ん /酶切检测ppzp-sss-^ra/v，酶切结果得到11. Ikb和I. 2 kb左右的两条带(图6A)。确认是整合成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5 a，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒。pPZP-221携带的筛选标记基因为庆大霉素(Gnf)，这样可用加有庆大霉素的MS培养基筛选转基因植物。 实施例3 :用STOPl基因的植物表达载体转化农杆菌
制备农杆菌的感受态细胞，用电脉冲法将上述构建好的植物表达载体ppzp-sss-sra/^转入农杆菌(C58Cl(pPMP90))中，在加有壮观霉素的平板上筛选转化子。取少量质粒加入农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀；将混合物加入到预冷的电转化杯中，轻轻敲击杯身使混和液落至杯底；将电转化杯置于电转化仪(BIO-RAD)滑槽中，用Imm的电击杯和200欧姆，2. 5kV/0. 2cm的參数进行电击，电击后立即取出电转化杯，迅速加入0.5 ml SOC培养基，混勻，转移到I. 5ml的离心管中;28V , 200rpm摇床培养3_5h ;室温下,7500rpm离心Imin,弃大部分上清，保留100 u I将细胞悬浮；把农杆菌涂布于有壮观霉素(Spe，50 u g/ml)的LB固体培养基上，28°C培养2天获得单菌落；首先用灭菌牙签挑取农杆菌菌落于20 u I ddH20中，98°C处理5分钟后取出10 U I农杆菌裂解液作为PCR反应的模板。PCR检测pPZP-35S-S7TF7转化結果，正对照扩增体系模板使用pPZP-35S-S7TF7质粒，负对照使用pPZP-221质粒，扩增片断理论长度约为1.2 kb, PCR产物经电泳分析显示其片段大小与理论预测值相符，表明质粒已转入农杆菌(图6B)。实施例5 :用含有STOPl基因植物表达载体的农杆菌转化烟草
挑取携帯有质粒PPZP-35S-S7TF7的农杆菌单菌落接种于50ml的LB培养基中(含Spe，100 V- g/ml), 180rpm, 28°C培养 24h,待菌液 OD600 至 I. 0 左右，离心 IOmin (3000rpm),沉淀菌体。再用IOml左右的MS液体培养基悬浮，离心IOmin (3000rpm)，沉淀菌体。重复以上操作2 3次。最后加入一定体积的MS液体培养基重悬浮,使菌体的OD6tltl值为0. 5。制备烟草tabacum cv. Xanth)的无菌苗,通过农杆菌介导,用叶盘法转化烟草,然后通过组织培养获得小苗，进ー步筛选获得所需的转基因植物。把无菌烟草的叶片切成小片叶盘，在制备好的农杆菌菌液中浸染15-20min，用无菌吸水纸吸干后，平铺于愈伤组织诱导培养基MSI (MS+NAA02. I u g/ml+BAP 0. 02 u g/ml)上黑暗共培养2天，将外植体转移至含卡那霉素(50 u g/ml)的芽诱导培养基MS4 (MS+NAA0. 53 u g/ml+BAPO. 5 u g/ml)上进行芽的诱导，约15天继代一次。待有芽生成后，转入含卡那霉素(50 y g/ml)的MS培养基上进行根的诱导。实施例6 'STOPl基因在转基因烟草中的插入情况及转录水平检测
为了确认通过卡那霉素筛选的转基因烟草株系确实含有导入的目的基因的DNA片段，用PCR方法对筛选到的转基因烟草作进ー步的鉴定。首先采用CTAB法提取植物基因组称取植物叶片IOOmg左右置于I. 5ml离心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉末状；加入 900ii I 预热到 65°C的 2XCTAB 缓冲液(Tris-HCl pH 7. 5 100 mM, EDTA 20 mM, NaCl I. 4M, CTAB 2%)，65°C度水浴加热20分钟后取出冷却；加入500 氯仿-异戊醇混合液(24 1)摇勻，4°C离心IOmin (7500rpm)后转移上清至I. 5ml EP管；再次加入500 y I氯仿ー异戍醇混合液(24 :1)摇匀，4°C离心IOmin (7500rpm);取出上清置于新的EP管中，加入1/10体积3M pH5. 2醋酸钠和等体积异丙醇，摇匀后4°C离心20min (12000rpm);弃上清，用75%こ醇清洗两次后，干燥，用含RNase的TE缓冲液溶解并降解RNA，获得的基因组DNA样品。以转STOPl烟草抗性苗基因组作为模板，用STOPl基因上下游引物进行PCR扩增检测STOPl是否插入烟草基因组。扩增产物大小约为I. 2 kb左右，和预期推測一致，说明目的基因均已插入这些转基因株系的基因组，野生型烟草基因组PCR产物未出现目标条带(图7A)。为了进一步检测目的基因在转基因烟草株系中的转录情况，从转基因植物中抽取总RNA，反转录成cDNA后用于RT-PCR分析，检测STOPl基因在转基因植物中的转录水平。采用 TRIzoL Reagent (Invitrogen)提取 RNA,取植物根约 0. Ig,加入 Iml 的 TRIzoL 提取液在研钵中研磨，室温静置5min后移入离心管,再加入0. 2ml氯仿,振荡混勻，离心15min(12000rpm),转移上清液至新管，加入0. 5ml异丙醇，混勻室温放置lOmin, 4°C离心IOmin(12000rpm),弃上清，沉淀用75%こ醇Iml清洗,4°C离心5min (7500rpm),弃こ醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20 u I焦碳酸ニこ酯(DEPC)处理水溶解RNA。所获得的RNA样品用凝胶电泳检测质量和浓度。使用Reverse Transcriptase进行cDNA的合成,取植物总RNA约 0. I ii g-5 u g, oligo (dT) 50ng, IOmM dNTP mix I ii 1，用 DEPC 处理水补足至 10 u 1，混匀后，短暂离心将之收集于管底，置于65°C加热5min，冰浴lOmin，加入反应混合物9 U I(5 Xreaction buffer 4 u l,25mM MgCl2 4u 1,0. IM DTT 2 y 1，RNA 酶抑制剂 I y 1)，将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25°C保温2min，加入Iiil M-MuLV ReverseTranscriptase,将上述混合物混勻，短暂离心将之收集于管底,25°C保温20min,然后42°C保温70min，合成cDNA。以cDNA为模板，用STOPl基因的上下游引物进行RT-PCR分析，考察转基因烟草中是否有目的基因的转录物。结果证明转基因烟草植株均有目的基因的转录物，而野生型的烟草则没有(图7B)。实施例7 :转基因烟草根系苹果酸的分泌
选取在MS培养基上生长两周、大小一致的烟草幼苗,于1/2 MS液体培养基上生长I周后，分别置于15 mL含30iiM AlCl3和不含AlCl3的CaCl2 (0.5 mM/L，pH4. 2)溶液中，置于25°C恒定光照(100 u mol/mVs1)下处理24 h后，收集处理液用于苹果酸和柠檬酸分泌量的測定。将得到的烟草根尖分泌物，使用真空干燥仪真空干燥后，溶于I mL蒸馏水中。苹果酸的测定为将 0. 35 mL 样品与 0. 45 mL 缓冲液 Tris-HCl (0. I mol/L, pH 9. 0)以及 30 u L氧化型辅酶I (NAD)溶液(30 g/L)混合，读取波长为340 nm处的OD值(Al)。接着加入2y L苹果酸脱氢酶悬浮液(16. 5 U/yL)于上述反应溶液中并混合均匀。15 min后，读取340 nm处的OD值A2。根据样品和苹果酸标准溶液吸光度的增加值(A2-A1)计算样品中苹果酸的含量。柠檬酸的測定方法为使用岛津生产的LC-20At色谱仪，爱尔兰Waters生产的色谱柱XTerra phenyl column (4. 6 X 250 mm),柱温 30°C,流动相为 0. 8% NH4H2PO4-H3PO4(pH 2. 8)缓冲液，流动相流速为0. 6 ml/min,紫外检测波长为210 nm,进样量10-20 yし柠檬酸的含量根据标准曲线计算。结果表明，在转基因株系中，在无铝胁迫下，野生型(WT)和转基因植物S1、S4和S5根尖分泌的苹果酸分别为0. 16,0. 26,0. 26和0. 23 u M/g Fff0在铝胁迫条件下，野生型和转基因株系SI、S4和S5根尖分泌的苹果酸均有所増加，分别为0. 20、0. 25、0. 27和0. 24iiM/g FW (图8)。在没有铝的处理条件下，转基因植物SI、S4和S5根尖分泌的柠檬酸分别是野生型烟草的7. 63、12. 90和11. 60倍(图9)。30 y M处理24 h后，
野生型和转基因烟草根尖柠檬酸的分泌均被显著性诱导。铝处理后野生型烟草根尖柠檬酸分泌为未添加铝的2. 57倍，而转基因烟草SI、S4和S5根尖分泌的柠檬酸分别为野生型的3. 62,5. 30和6. 08倍。铝处理后，转基因烟草SI、S4和S5根尖分泌苹果酸和柠檬酸的总和分别为野生型烟草根尖的2. 77,3. 89和4. 35倍(图10)。实施例8 :铝胁迫下转基因和野生型烟草的抗铝能力和根尖铝含量
选取在MS培养基上生长两周、大小一致的烟草幼苗,于1/2 MS液体培养基上生长I周后，分别置于15 mL含30iiM AlCl3和不含AlCl3的CaCl2 (0.5 mM/L, pH4.2)溶液中，使用直尺測定根的长度；随后置于25°C恒定光照(100 u mol/mVs1)下处理24 h后，使用直尺測定根的长度。每个株系測定9个根尖的长度，相对根伸长率为铝溶液处理植株的根伸长量/无铝溶液处理植株的根伸长量。铝处理结束后，取根尖称鲜重后在65°C烘箱烘至衡重，用灰化炉550°C灰化10 h左右，使用Iml浓硝酸溶解过夜，定容至50 ml，使用原子吸收分光光度法测定铝的含量。为了确定转基因烟草对铝的抗性，本研究检测了 30iiM AlCl3 (含0.5 mM CaCl2,pH 4. 2)胁迫下转基因烟草与野生型烟草的RRG。结果表明，在铝处理下，野生型烟草的根明显受到了抑制，其RRG仅为对照的0. 48。转基因株系能够有效的缓解铝毒，S1、S4和S5株系根的相对伸长率分别为0. 79,0. 90和0. 83，分别为野生型相对根伸长率的1.65、1.88和I. 74倍(图11)。对于根尖铝含量测定表明，30 ii M处理24 h后，转基因株系S1、S4和S5根尖的铝含量仅为野生型根尖铝含量的46%、30%和32%(图12)。可见，在烟草中过表达基因可以有效的増加烟草对铝的抗性并有效的減少根尖铝含量。
权利要求
1.丹波黑大豆C2H2型锌指蛋白基因S7TF7的植物表达载体，其特征在于其含有铝诱导的C2H2型锌指蛋白基因基因的上游连接有CaMV 35S组成型启动子。
2.根据权利要求I所述丹波黑大豆C2H2型锌指蛋白基因STOPl的植物表达载体，其特征在于所述基因来源于丹波黑大豆，NCBI登录号为EU418733。
3.权利要求I或2所述的丹波黑大豆C2H2型锌指蛋白基因STOPl的植物表达载体在制备吸收和抗铝毒能力增强的转基因植株中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种丹波黑大豆C2H2型锌指蛋白基因STOP1的植物表达载体pPZP-35S-STOP1及其提高植物抗铝毒胁迫能力的应用，该载体为含有花椰菜花叶病毒的组成型启动子(35S)和丹波黑大豆铝诱导的C2H2型锌指蛋白基因STOP1的植物表达载体，从丹波黑大豆根中扩增出STOP1基因，用组成型启动子控制它在烟草中过量表达，提高烟草抗铝毒的能力。实验表明转STOP1基因烟草在含有30μM的AlCl3溶液中胁迫生长24h后，转基因烟草的根尖分泌的苹果酸和柠檬酸以及抗铝能力均显著性高于野生型对照植物，而根尖铝含量显著性低于野生型植物。
文档编号C12N15/82GK102952822SQ20121043803
公开日2013年3月6日 申请日期2012年11月6日 优先权日2012年11月6日
发明者陈丽梅, 陈奇, 武孔焕, 李昆志, 玉永雄 申请人:昆明理工大学