专利名称：一个大豆MADS-box基因及其在花器官改造中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个大豆MADS-box基因GmMADSl的应用，属于植物基因工程领域。
背景技术：
人们已经从处于不同进化地位的整个庞大的植物各类群中分离得到了大量的 MADS-box基因，MADS-box基因在花发育中起着重要作用，无论是从营养生长向生殖生长的 转换；还是在生殖生长的初始阶段，花分生组织决定基因启动花分生组织的发育；以及在 生殖生长后期，花器官原基的发育中都发挥着重要的作用。大豆作为重要的粮油作物，有关其花发育的研究还相对滞后。大豆花多，花器较 小，花粉粘重，花朵开放时翼瓣和龙骨瓣紧紧包住雄蕊和柱头，花药和柱头不外露，异花间 的风媒传粉等花器特点造成大豆异花传粉非常难，也使大豆杂种优势很难利用，如果能定 向改变大豆的花器结构，使之更利于吸引传粉昆虫或有利于风媒传粉，这将大大降低不育 系繁殖或杂交制种的成本，使大豆杂交种应用于大面积生产。Feng(2006)通过对LjCYC2 的遗传操作，在百脉根中已经实现对花瓣的改造。对大豆这样的严格自花授粉作物而言，或 许可以以基因操作为基础的分子设计，实现其传粉方式的改变。因此，弄清花发育的分子机 制，进而为改造花器官提供基础，具有重要的理论和现实意义。本发明从大豆中克隆了 1个 与在花瓣位置和数目的确定性上发挥了重要的调控作用的基因GmMADSl，提出了利用该基 因进行植物花器官改造的基因工程改良方法。
发明内容
技术问题本发明的目的在于公开大豆MADS-box基因GmMADSl在花器官改造中的基因工程 应用，该基因可作为目的基因导入植物，改变植物的花型，以进行植物品种改良。技术方案本发明所提供的大豆MADS-box基因GmMADSl，其序列为SEQ ID NO. 1。大豆MADS-box基因GmMADSl的基因工程应用，包括1)大豆 MADS-box 基因 GmMADSl 的克隆根据大豆MADS-box基因GmMADSl的全长序列，设计两端引物上游引物5‘ -GAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3 ‘下游引物5‘ -CAAGGAAGAGGCTAGCTAGG-3 ‘取大豆品种Jackson花和花芽的混合物，提取总RNA，经反转录合成cDNA第一链 后，进行PCR扩增，PCR程序如下94°C预变性4分钟，94°C变性30s，55°C复性Imin，72°C延 伸2min，33个循环后，72°C IOmin,将PCR产物进行克隆至pMD18_T载体，测序后获得具有完 整编码区的大豆MADS-box基因GmMADSl的cDNA序列SEQ ID NO. 1 ；2)植物表达载体的构建根据大豆MADS-box基因GmMADSl的cDNA序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物上引入BamHI限制性内切酶位点，下游引物引入SacI限制性内切酶位点 (单下划线标示的是BamHI的酶切位点；双下划线标示的是SacI的酶切位点)上游引物5-AGGATCCGAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3下游引物5-AGAGCTCCAAGGAAGAGGCTAGCTAGG-3以步骤1)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，将GmMADSl的cDNA克隆至中间载体PMD18-T，进一步克隆到双元表达载体PBI121 ；3)转基因植株的获得将步骤2)获得的表达载体转入农杆菌菌株LBA4404，进一步转入植物，对获得的转基因植株进行PCR，RT-PCR验证后进行植物的表型分析，获得将步骤2)获得的表达载体 转入农杆菌菌株LBA4404，进一步转入烟草，对获得的转基因植株进行PCR，RT-PCR验证后 进行植物的表型分析，获得的GmMADSl转基因植株提前开花、矮化，萼片、雄蕊和花瓣的数 目增加，产生了萼片、雄蕊向花瓣的转变，出现子房状萼片、开裂的花瓣和弯曲的雄蕊，而且 由于雄蕊弯曲和缩短，导致雄蕊无法触及雌蕊，而不能正常授粉；此外，GmMADSl转基因植 株的花药不能正常开裂，花粉的活力降低，最终导致转基因植株育性下降甚至完全不育。有益效果GmMADSlmRNA表达分析表明其有可能参与花瓣和雄蕊的发育。进一步的过量表达 GmMADSl的烟草的花器官变化表明GmMADSl在花瓣位置和数目的确定以及雄性器官发育方 面可能发挥了重要的调控作用。本发明公开了该基因进行植物花器官改造的基因工程改良 方法。该方法对培育花器官改变的植物品种特别是大豆品种具有一定的作用，可以通过定 向地改造作物的花器形态，为农作物提高制种效率服务，进而为提高农作物特别是大豆的 产量服务。利用植物表达载体，将本发明的GmMADSl导入植物细胞，可获得花器官改变的转 基因细胞系及转基因植株。使用GmMADSl构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强 型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用 植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因(⑶S基因、萤光素酶基 因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)。从转基因植物 的安全性考虑，也可不加任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植株。携带有本发明GmMADSl的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载 体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并 将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、玉米等单子叶植 物，也可以是大豆、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等双子叶植物。下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。
图IGmMADSl基因的组织表达分析。采用半定量RT-PCR技术进行不同大豆组织GmMADSl的组织表达研究，Actinl基 因的表达为内参图2 335S =GmMADSl转基因烟草萼片、花瓣和雄蕊的数目增加。A，D，F表示野生型烟草(WT)的花瓣、雄蕊和萼片均为5枚；B，C，E，G表示野生型烟草的花瓣、雄蕊和萼片均为6枚；D-E中标尺代表Imm图3 35S =GmMADSl转基因烟草异常的花器官。(A)WT的花型；(B)35S =GmMADSl转基因烟草萼片开裂；(C) 35S=GmMADSl转基因烟 草花瓣开裂；(D) 35S =GmMADSl转基因烟草萼片转变为花瓣；(E-G) 35S =GmMADSl转基因烟 草雄蕊转变为花瓣。图4 35S =GmMADSl转基因烟草的花丝变短卷曲。(A)WT的花型；⑶WT的花丝；(C)WT花丝外表皮扫描电镜图片；(D) 35S =GmMADSl 转基因烟草的花型；(E) 35S =GmMADSl转基因烟草的花丝；(F) 35S =GmMADSl转基因烟草的 花丝外表皮扫描电镜图片；A. B. D. E中标尺代表1mm，C中标尺代表3 μ m，F中标尺代表 5 μ m。图535S =GmMADSl转基因烟草的花药不开裂、花粉萌发活力下降。(A-B)WT 的花药；(C-D) 35S =GmMADSl 转基因烟草的花药；(E) WT 和 35S =GmMADSl 在显微镜下1个视野内花粉数目的平均值(η = 10) ； (F)WT和35S =GmMADSl在显微镜下1 个视野内花粉萌发率的平均值(η = 10) ； (A)中标尺代表100 μ m,⑶中标尺代表100 μ m， (C)中标尺代表100 μ m，(D)中标尺代表50 μ m。
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。实施例1、大豆MADS-box基因GmMADSl的cDNA克隆与鉴定根据GmMADSl的全长序列设计引物，上游引物5‘ -GAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3 ‘下游引物5‘ -CAAGGAAGAGGCTAGCTAGG-3 ‘应用RT-PCR方法，从大豆品种Jackson (公知公用，国家大豆改良中心可购买) 中克隆了 GmM舒畅ADSl基因。取大豆花和花芽的混合物，用研钵研碎，加入盛有裂解液 的1.5mL EP管，充分振荡后，再移入玻璃勻浆器内。勻浆后移至1.5mL EP管中，抽提总 RNA(TRIzol Reagents, Invitrogen，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分 光光度计上测定RNA含量。以获得的总RNA为模板，按照美国Promega公司提供的反转录 试剂盒的说明书进行反转录，合成cDNA第一链。进行PCR扩增反应。PCR程序如下94°C 预变性4分钟，94°C变性30s，55°C复性lmin，72°C延伸2min，33个循环后，72°C IOminJf 931bp的PCR产物进行克隆至pMD18-T载体，测序后获得具有完整编码区的大豆MADS-box 基因 GmMADSl 的 cDNA 序列 SEQ ID NO. 1 ；实施例2、大豆GmMADSl基因在不同组织中的表达特征大豆品种Jackson于正常季节种植于南京农业大学网室中。取大豆六复叶期的 根、茎和叶，大豆盛花期(Rl)取花和花芽的混合物，大豆初荚期(R3)的荚，开花后20天幼 嫩的种子，液氮速冻存于-80°C备用。大豆盛花期取完整的花无菌分割成萼片、花瓣、雄蕊、 雌蕊，液氮速冻存于-80°C备用。总RNA的提取同实施例1。以大豆组成型表达的Actin基因(GenBank accessionNo. V00450)为内部参照，以来自大豆不同组织的总RNA为模板，进行RT-PCR分 析。RT-PCR分析表明GmMADSl在包括花、种子和荚等生殖器官表达，在营养器官(根、茎和 叶)不表达，在茎生长点中表达(图1)，说明该基因在调节该组织细胞增殖上可能也起到一定的作用。进一步我们分析了 GmMADSl在花瓣、雄蕊、心皮和萼片中的表达情况，结果显示 该基因在四轮花器官中都表达，但花瓣和雄蕊中表达量较大(图1)，说明该基因最有可能 参与花瓣和雄蕊的发育。实施例3、GmMADSl的基因工程应用根据GmMADSl的cDNA序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物上引入BamH I限制性内切酶位点，下游引物引入SacI限制性内切酶位点上游引物5-AGGATCCGAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3下游引物5-AGAGCTCCAAGGAAGAGGCTAGCTAGG-3以1)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，将GmMADSl的cDNA克隆至中 间载体PMD18-T，进一步克隆到双元表达载体pBI121 ；用冻融法将获得的表达载体转入农 杆菌菌株LBA4404，通过农杆菌介导法转化烟草，对获得的转基因植株进行表型和细胞学分 析，发现GmMADSl的异位表达促使烟草提前开花、矮化，增加了萼片、雄蕊和花瓣的数目(图 2)，产生了萼片、雄蕊向花瓣的转变，出现子房状萼片、开裂的花瓣和弯曲的雄蕊等(图3)， 而且由于雄蕊弯曲和缩短，导致雄蕊无法触及雌蕊(图4)；此外，GmMADSl转基因植株的花 药不能正常开裂，花粉的活力降低，最终导致转基因植株育性下降甚至完全不育(图5)。因 此我们认为GmMADSl在花瓣位置和数目的确定以及雄性器官发育方面发挥了重要的调控 作用。利用GmMADSl基因获得的花器官发生变异的新材料可用于农作物和观赏园艺植物的 育种应用。
权利要求
大豆MADS-box基因GmMADS1，其序列为SEQ ID NO.1。
2 权利要求1所述大豆MADS-box基因GmMADSl的基因工程应用，包括1)大豆MADS-box基因GmMADSl的克隆根据大豆MADS-box基因GmMADSl的全长序列，设计两端引物 上游引物5 ‘ -GAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3 ‘下游引物5 ‘ -CAAGGAAGAGGCTA GCTAGG-3 ‘取大豆品种Jackson花和花芽的混合物，提取总RNA，经反转录合成cDNA第一链后， 进行PCR扩增，PCR程序如下94°C预变性4分钟，94°C变性30s，55°C复性lmin，72°C延伸 2min, 33个循环后，72°C IOmin,将PCR产物进行克隆至pMD18_T载体，测序后获得具有完整 编码区的大豆MADS-box基因GmMADSl的cDNA序列SEQ ID NO. 1 ；2)植物表达载体的构建根据大豆MADS-box基因GmMADSl的cDNA序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并 在上游引物上引入BamH I限制性内切酶位点，下游引物引入SacI限制性内切酶位点上游引物5-AGGATCCGAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3下游引物-c^-A GAGCTC CAAGGAA GAGGCTAGCTAGG-3以步骤1)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，将GmMADSl的cDNA克隆至中 间载体PMD18-T，进一步克隆到双元表达载体pBI121 ；3)转基因植株的获得将步骤2)获得的表达载体转入农杆菌菌株LBA4404，进一步转入烟草，对获得的转基 因植株进行PCR，RT-PCR验证后进行植物的表型分析，获得的GmMADSl转基因植株提前开 花、矮化，萼片、雄蕊和花瓣的数目增加，产生了萼片、雄蕊向花瓣的转变，出现子房状萼片、 开裂的花瓣和弯曲的雄蕊，而且由于雄蕊弯曲和缩短，导致雄蕊无法触及雌蕊，而不能正常 授粉；此外，GmMADSl转基因植株的花药不能正常开裂，花粉的活力降低，最终导致转基因 植株育性下降甚至完全不育。
全文摘要
本发明公开了一个大豆MADS-box基因及其在花器官改造中的应用及其在花器官改造中的应用，属于生物技术领域。GmMADS1是定位于细胞核内的转录因子，在四轮花器官中都有所表达，但花瓣和雄蕊中表达量较大，过量表达GmMADS1的烟草，增加了萼片、雄蕊和花瓣的数目，产生了萼片、雄蕊向花瓣的转变，出现了开裂的花瓣和弯曲的雄蕊等，导致雄蕊无法触及雌蕊，而不能正常授粉以及花药不能正常开裂，花粉的活力降低。以上结果表明GmMADS1在花瓣位置和数目的确定以及雄性器官发育方面发挥了重要的调控作用。利用GmMADS1基因获得的花器官发生变异的新材料可用于农作物和观赏园艺植物的育种应用。
文档编号C12N15/82GK101805740SQ201010156259
公开日2010年8月18日 申请日期2010年4月23日 优先权日2010年4月23日
发明者喻德跃, 迟英俊, 黄方 申请人:南京农业大学