专利名称：与大豆黄色种皮基因相关的rapd标记及其获得方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于农业生物技术工程，特别涉及与大豆黄色种皮基因相关的RAPD标记及其获得方法和应用。
背景技术：
我国是大豆的原产国，大豆在我国的国民经济和社会生产中占有重要的地位。加入WTO后，我国大豆生产面临严峻的挑战，国内市场受到严重冲击，只有提高大豆品种的竞争力，才能从根本上解决这种状况。我国拥有丰富的抗大豆胞囊线虫的大豆种质资源，这些大豆种质大多为黑色种皮的小黑豆，在大豆育种过程中黑色和深色种皮颜色都是大豆中的不良性状，栽培性状比较原始，不能直接用于大豆生产，但这些种质是理想的大豆胞囊线虫抗性基因供体。因此，在表型研究的基础上进行基因型的深入研究，开发具有我国特色的重要性状基因的分子标记并进行辅助选择研究，将对提高我国大豆育种水平起到促进作用。
本研究采用BSA(Bulked Segregates Analysis)即分离群体分组分析法(MichelmoreR.W.，Paran I and Kesseli R.V.1991.Identification of markers linked to disease-resistance genes by usingsegregating analysisA rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregatingpopulations.Proc NatlAcad Science USA，889828-9832)，对不同种皮颜色的大豆品种进行研究，旨在建立一种快速准确地筛选与种皮颜色相关的RAPD标记，为新品种的选育提供理论依据。
发明内容
本发明是针对上述情况，用分子生物学方法以种皮颜色不同的大豆品种为材料，筛选和寻找新的、稳定存在的与种皮颜色基因密切相关的分子标记及其方法，用于优良黄色种皮的大豆新品种的辅助选择育种。
本发明涉及一种获得与大豆黄色种皮基因相关的RAPD分子标记的方法，所述的方法包括下列步骤(1)将种子去除种皮，用SDS法提取大豆种子DNA；(2)选取11个黑色种皮大豆品种，12个黄色种皮大豆品种，利用分离群体分组分析法(BSA)，将11个黑色种皮大豆DNA等量混合构成黑色种皮池，12个黄色种皮大豆的DNA等量混合构成黄色种皮池；(3)采用RAPD技术进行不同种皮颜色大豆分子标记的筛选；(4)筛选出一个RAPD分子标记S79500，经检测发现，该标记与大豆黄色种皮基因密切相关。
采用RAPD技术进行筛选与大豆种皮颜色相关的分子标记的方法是采用10bp寡核苷酸作为随机引物，进行PCR扩增，分析RAPD引物在黄色种皮池、黑色种皮池间的DNA多态性。优选所用的随机引物为S79，其序列为GGTTGTACCC。
用RAPD标记技术筛选，采用上海生工生物技术有限公司开发的10bp寡核苷酸作为随机引物，在PTC-200型PCR仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为其中模板20ng·μL-1，大豆基因组DNA 2μL，5U·μL-1Taq DNA聚合酶0.2μL，10×PCR Buffer 2μL，2.5mM MgCl22μL，2.5mM dNTP 1.6μL，随机引物1μL，ddH2O 11.2μL，总体系为20μL。
PCR反应程序第1循环94℃预变性5min，第2循环至35循环程序为94℃变性1min，36℃退火1min，72℃延伸1min，最后一个循环在72℃中保温延伸5min。扩增产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳，电压为4V·cm-1，电泳结束后在EB中染色30min，在凝胶成像仪中检测分析。在凝胶成像仪中观察，大小约为500bp的谱带为与黄色种皮基因相关的分子标记带。
本发明还涉及用上述的方法获得的与大豆黄色种皮基因相关的RAPD分子标记S79500，其是约500bp的DNA片段。
本发明所获得的与大豆黄色种皮基因相关的分子标记可用于不同种皮颜色大豆的鉴定或黄色种皮的大豆品种的辅助选择育种。
本发明还涉及用所获得的与大豆黄色种皮基因相关的RAPD分子标记鉴定大豆种皮颜色的方法，包括从大豆中提取的基因组DNA，经PCR扩增后进行凝胶电泳，出现约500bp的分子标记谱带的品种，为黄色种皮品种。
本发明的优点及实际意义在于1.将本发明的与大豆黄色种皮基因分子标记用于大豆种皮颜色种质鉴定和大豆种皮颜色育种后代选择，是大豆种皮颜色的早期鉴定成为可能。
2.用本发明的大豆黄色种皮基因分子标记鉴定大豆的种皮颜色，不受环境条件和大豆生长发育阶段影响，快速准确。
3.为克隆大豆黄色种皮基因、基因序列分析以及转黄色种皮基因大豆研究奠定基础。
图1与大豆种皮颜色相关的S79引物扩增产物的电泳图谱，箭头所示为RAPD标记S79500，其中1-11为黑色种皮品种，12-23为黄色种皮品种(编号代表的不同品种名称与表1中的一致)；.MλDNA/EcoR I+HindIII。
图2与大豆种皮颜色相关的S79引物的RAPD产物电泳图谱，箭头所示为RAPD标记S79500，其中24-31为辽豆10×PI437654杂交后代种皮颜色有分化的群体；32-38分别为黄、青、黑、褐色种皮的大豆(编号代表的不同品种名称与表1一致)；黄代表黄色种皮池；黑代表黑色种皮池。
具体实施例方式
实施例1与大豆黄色种皮基因相关的RAPD分子标记S79500的获得用RAPD分子标记方法，得到与大豆黄色种皮基因相关的分子标记S79500。
一、提取DNA取大豆种子0.2g，将种子去除种皮(尤其是黑色种皮会影响结果的准确度，因此将种皮去净)，在研钵中研磨成豆粉，加入SDS提取缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.0，20mMEDTA，pH8.0，50mM NaCl)800μL，混合，65℃水浴40min，其间每隔10min轻轻旋转混匀。10000rpm离心20min，取上清液，加入等体积酚∶氯仿(1∶1)、氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提1次。10000rpm离心8min，取上清液，加入2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置1h以上；10000rpm离心10min，倾去上清，留沉淀；然后用70％乙醇清洗沉淀两次，风干后，溶于200μL TE中。紫外分光光度法检测DNA样品的浓度，0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。
二、随机扩增多态性DNA(RAPD)分析143个10bp的随机引物购自上海生工生物工程公司。
1.PCR扩增(1)反应体系20ng·μL-1大豆基因组DNA 2μL，5U·μL-1Taq DNA聚合酶0.2μL，10×PCR Buffer 2μL，2.5mM MgCl22μL，2.5mM dNTP 1.6μL，随机引物1μL，ddH2O 11.2μL，总体系为20μL。于PTC-200型PCR仪上进行反应。
(2)反应程序
94℃预变性5min；94℃变性1min，36℃退火1min，72℃延伸1min，扩增35个循环；最后72℃延伸5min。
2.电泳检测取扩增产物6μL，在1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结束后在0.5μg·μL-1的EB中染色，紫外检测仪中检测照像并记录结果。
3.分离群体分组分析法(BSA)参照Michelmore等(Michelmore R.W.，Paran I and Kesseli R.V.1991.Identification of markerslinked to disease-resistance genes by using segregating analysisA rapid method to detect markers in specificgenomic regions by using segregating populations.Proc Natl Acad Science USA，889828-9832)的方法，将11个黑色种皮大豆品种的基因组DNA等量混合构成黑色种皮池，12个黄色种皮大豆品种的DNA等量混合构成黄色种皮池。用黄、黑种皮池对随机引物进行筛选能够产生多态性的随机引物。
三、与大豆黄色种皮基因相关的RAPD标记利用143个随机引物对11个黑色种皮大豆和12个黄色种皮大豆基因组DNA进行RAPD分析，发现有66个产生了扩增产物，产生RAPD多态性的随机引物有15个，其中引物S79(其序列为GGTTGTACCC。)在黄、黑种皮池和黄黑品种间可扩增出特异性片段(黄色种皮池和黄色大豆品种有而黑色种皮池和黑色大豆品种没有)，特异性片段的长度约为500bp(图1所示)。
实施例2不同大豆品种(如表1所述)对RAPD标记S79500的鉴定1.黄色种皮大豆品种辽豆10用黄色种皮大豆品种辽豆10作为实验材料，具体做法同实施例1。如图1所示，在凝胶成像系统中观察，出现大小约为500bp的特异性条带，谱带21为大豆黄色种皮基因分子标记带。
2.“辽豆10×PI437654F5代”暗黄色种皮大豆用“辽豆10×PI437654F5代”暗黄色种皮大豆为实验材料，具体做法同实施例1。如图2所示，在凝胶成像系统中观察，出现大小约为500bp的特异性条带，谱带27为大豆黄色种皮基因分子标记带。
3.黑色种皮大豆品种哈尔滨小黑豆用黑色种皮大豆品种哈尔滨小黑豆作为实验材料，具体做法同实施例1。如图1所示，在凝胶成像系统中观察，未出现大小约为500bp的特异性条带，谱带3为大豆黑色种皮基因分子标记带。
表1供试大豆品种名称及全国总编号
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权利要求
1.一种获得与大豆黄色种皮基因相关的RAPD分子标记的方法，所述的方法包括下列步骤(1)将种子去除种皮，用SDS法提取大豆种子DNA；(2)选取11个黑色种皮大豆品种，12个黄色种皮大豆品种，利用分离群体分组分析法(BSA)，将11个黑色种皮大豆DNA等量混合构成黑色种皮池，12个黄色种皮大豆的DNA等量混合构成黄色种皮池；(3)采用RAPD技术进行不同种皮颜色大豆分子标记的筛选；(4)筛选出一个RAPD分子标记S79500，经检测发现，该标记与大豆黄色种皮基因密切相关。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，采用10bp寡核苷酸作为随机引物，进行PCR扩增，分析RAPD引物在黄色种皮池、黑色种皮池间的DNA多态性。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于，PCR反应体系为其中模板20ng·μL-1，大豆基因组DNA 2μL，5U·μL-1Taq DNA聚合酶0.2μL，10×PCR Buffer 2μL，2.5mMMgCl22μL，2.5mM dNTP 1.6μL，随机引物1μL，ddH2O 11.2μL，总体系为20μL。
4.按照权利要求2或3所述的方法，其特征在于，PCR扩增的反应程序为第1循环94℃预变性5min，第2循环至35循环程序为94℃变性1min，36℃退火1min，72℃延伸1min，最后一个循环在72℃中保温延伸5min。
5.按照权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的随机引物为S79，其序列为GGTTGTACCC。
6.按照权利要求1-5中任一项所述的方法获得的与大豆黄色种皮基因相关的RAPD分子标记，其特征在于所述的分子标记是约500bp的DNA片段。
7.权利要求6所述的分子标记在不同种皮颜色大豆的鉴定中或黄色种皮的大豆品种的辅助选择育种中的应用。
8.应用权利要求6所述的与大豆黄色种皮基因相关的RAPD分子标记鉴定大豆种皮颜色的方法，其特征在于从大豆中提取的基因组DNA，经PCR扩增后进行凝胶电泳，出现约500bp的分子标记谱带的品种，为黄色种皮品种。
全文摘要
本发明涉及与大豆黄色种皮相关的RAPD标记及其获得方法和应用，属于农业生物技术领域。本发明的分子标记是用下述方法得到的(1)从大豆中提取基因组DNA；(2)应用随机引物及Taq DNA聚合酶等进行PCR扩增反应；(3)扩增产物进行凝胶电泳；(4)在凝胶成像系统中观察，大小约为500bp的谱带为与黄色种皮基因相关的分子标记条带。该分子标记可以广泛应用不同种皮颜色大豆的鉴定中，为辅助选育优良的黄色种皮的大豆新品种提供理论依据。
文档编号A01H1/00GK1814809SQ20051013436
公开日2006年8月9日 申请日期2005年12月16日 优先权日2005年12月16日
发明者段玉玺, 王惠, 陈立杰, 薛春生 申请人:沈阳农业大学