专利名称：一种多功能纤维素酶及其表达基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及来源于哈氏嗜纤维菌(Cytophaga hutchinsonii)的多功能纤维素酶及其表达基因与应用，属于生物工程技术领域。
背景技术：
纤维素是由吡喃型D-葡萄糖残基以P -I, 4糖苷键形成纤维素链，纤维素链又通过氢键缔合形成不溶于 水的纤维素束。纤维素作为植物细胞壁的主要组成成分，是植物的主要支持物，可以说是地球上最丰富的可再生资源。将这些生物质资源转化成为人类可以利用的能源、食物等，对于人类社会的可持续发展具有十分重要的意义。已发现的纤维素酶大多产于微生物，一般认为微生物可以产生纤维素外切酶、纤维素内切酶以及3 -葡萄糖苷酶，纤维素外切酶可以攻击纤维素链的一端并持续性地产生纤维二糖，被认为是结晶纤维素降解的关键酶。纤维素内切酶可以攻击非结晶区的纤维素链，使其断裂，产生较短的糖链，也为纤维素外切酶提供更多的攻击位点。￠-葡萄糖苷酶则能进一步降解纤维二糖和纤维寡糖生成葡萄糖，为微生物代谢所利用。由于真菌的纤维素酶主要分泌于胞外，易于分离纯化，现在工业上用的纤维素酶大多来源于真菌的发酵产物。但是真菌作为一种真核生物，其基因含有内含子并且产生的蛋白有比较复杂的糖基化修饰，不容易在已经比较成熟的大肠杆菌表达系统中进行异源表达从而获得更高产量，因此开发细菌中的高效纤维素酶显得尤为重要。哈氏嗜纤维菌(Cytophaga hutchinsonii)是一种土壤中广泛存在的、好氧的纤维素降解细菌，它能在贫瘠的条件下迅速彻底地降解结晶度很高的天然棉纤维或滤纸(Decomposition of Cellulose by Cytophaga. Ernest Walker and Frederick Lloyd Warren, BiochemJ. 1938January; 32 (I) :31 -43)。对其基因组的生物信息学预测显示哈氏菌中主要含有多种纤维素内切酶及￠-葡萄糖苷酶，未发现有对于降解结晶纤维素起关键作用的纤维素外切酶(Genome Sequence of the Cellulolytic Gliding Bacterium Cytophagahutchinsonii. Gary Xieetc, 2007, AppI. Environ. Micobiol. 73:3536-3546)，而且其绝大多数纤维素酶均不含有纤维素结合结构域。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种多功能纤维素酶及其表达基因与应用。一种多功能纤维素酶CHU-2103，氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。多功能纤维素酶CHU-2103为一个单结构域的多功能酶，其分子量只有不足40kD，具有纤维素外切酶、纤维素内切酶及糖基转移酶的活性。该酶降解纤维素能够产生纤维三糖、纤维二糖及少量葡萄糖，呈现出类似纤维素外切酶持续性降解的特性。降解羧甲基纤维素钠则能够使其粘度迅速下降，显示出纤维素内切酶的活性。该酶既可以降解三糖及以上纤维寡糖为小分子寡糖，也能在一定条件下通过转糖基作用与纤维寡糖反应生成更高分子量的寡糖，该酶能够与3-葡萄糖苷酶共同作用直接将纤维素转化为葡萄糖。
上述多功能纤维素酶的表达基因chu_2103，核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。表达基因chu_2103容易进行异源表达，获得活性蛋白。表达基因chu_2103为哈氏嗜纤维菌(Cytophaga hutchinsonii)的纤维素酶前体蛋白基因去除信号肽序列后制得。表达基因chu_2103装载在pMAL-c2x载体上得到重组质粒pChu2103，然后转入到大肠杆菌E. coliJM109宿主中得到工程菌JM Chu2103。该重组工程菌株经过发酵培养，麦芽糖亲和层析柱(NEB)纯化能够得到了大量活性纤维素酶CHU-2103。一种重组质粒，插入了如SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列的基因片段。一种重组工程菌株，插入了如SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列的基因片段或上述重组质粒。上述多功能纤维素酶CHU-2103、表达基因chu_2103、重组质粒或重组工程菌株在降解纤维素中的应用。·有益效果本发明所述多功能纤维素酶CHU-2103为一个单结构域的多功能酶，其分子量不足40kD，容易进行异源表达，获得具有纤维素外切酶、纤维素内切酶及糖基转移酶活性的活性蛋白，有效地解决了由于哈氏菌的生长周期比较长，酶成分比较复杂，不容易对纤维素酶直接进行分离纯化的问题。该酶在生物能源、饲料等行业具广泛的应用潜力。
图I :pMAL_c2x质粒结构示意图；图2 :多功能纤维素酶CHU-2103 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳带；其中1泳道为纯化后的CHU_2103，2泳道为Marker，3泳道为诱导后工程菌超声破碎离心后的上清，4泳道为未诱导工程菌超声破碎离心后的上清。图3 :反应温度及pH对多功能纤维素酶CHU-2103的纤维素内切酶(以羧甲基纤维素钠为底物)活力影响曲线；图4 :多功能纤维素酶CHU-2103降解纤维素产物的HPLC检测；其中1为加入灭活CHU-2103降解磷酸膨胀纤维素的产物，2、3、4分别为磷酸膨胀纤维素被多功能纤维素酶CHU-2103降解不同时间的产物。图5 :金属离子对多功能纤维素酶CHU-2103酶活力的影响；其中横坐标为离子浓度，纵坐标为相对酶活。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明所述的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。哈氏嗜纤维菌购自美国菌种保藏中心，菌种编号为ATCC NO. 33406。实施例I :多功能纤维素酶的克隆表达I、哈氏嗜纤维菌的培养哈氏嗜纤维菌的培养条件为PY6培养基，300C，160rpm振荡培养，PY6培养基每升组分如下葡萄糖4g,胰蛋白胨6g,酵母浸提液0. 5g,余量水，pH 7.0。2、基因组的提取
将培养好的哈氏嗜纤维菌(Cytophaga hutchinsonii)的细菌培养物离心收集菌体，用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN公司生产的细菌DNA提取试剂盒)，按照产品说明书提取基因组DNA，备用。3、目的基因克隆(I)引物设计哈氏嗜纤维菌(Cytophaga hutchinsonii )的全基因组测序工程已经完成，我们选择了一个预测为纤维素内切酶的基因chu-2103作为研究对象。SEQ ID NO. I基因序列预计编码346个氨基酸，其编码的纤维素酶前体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，通过Signal 4. 0软件网上分析服务，预测蛋白N-端的23个 氨基酸是信号肽序列，去除这个信号肽序列后得到纤维素酶的成熟蛋白，它的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 4所示，对应编码这个纤维素酶成熟蛋白的基因序列如序列表SEQ IDNO. 3所示。根据该基因的序列特点，以及序列对应的表达蛋白的信号妝序列和成熟蛋白序列特点，我们设计了两端带有限制性酶切位点的引物上游引物ATG ACT GGA TCC CAAAAG ACA ATC GTT GA，划线部分为 BamH I 酶切位占.下游引物CTGCGG AAG CTT CTA TTT TGT TTT TGA TTT CT，划线部分为HindIII酶切位点；委托华大基因公司合成这一对引物用于克隆该纤维素酶成熟蛋白基因(该基因编码的纤维素酶成熟蛋白的氨基酸序列参见SEQ ID NO. 4)，克隆基因采取PCR扩增的方法。(2)目的基因(SEQ ID NO. 3)的PCR扩增和纯化在50 U I TransStart FastPfu DNA Polymerase 反应体系中(购自 Transegene 公司，配制方法参见试剂说明书)，以步骤2中提取获得的基因组DNA为模板，上述引物作为扩增引物，通过PCR的方法进行扩增，PCR反应条件预变性95°C 2分钟；热循环条件是95°C 20秒，55°C 20秒，72°C 30秒，反应进行31个循环；最后在72 C保温延伸10分钟。通过PCR扩增的该基因的全长为969bp，用I. 0%琼脂糖凝胶电泳检测证实得到目的基因的DNA扩增产物后，使用DNA凝胶回收试剂盒(购于Omega公司)切胶回收，纯化扩增产物。4、重组质粒的构建将上述纯化的DNA片段和载体pMAL_c2x用BamH I和Hind III (购于Takara公司)进行双酶切，实验操作参见Takara产品说明书。酶切完毕后用Cycle-pure kit (购于Omega公司)对酶切产物进行纯化。将上述纯化的DNA片段和载体片段混合,在16°C用Solution I (购自Takara公司)进行过夜连接反应。将连接产物转入大肠杆菌E. coliDH5 a (购自Takara公司)中，在含有100mg/ml氨苄青霉素的固体LB平皿上涂布，37°C静置培养，直至出现单菌落，选择性挑取单菌落在含有100mg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中37°C震荡培养。菌液PCR验证工程菌的重组质粒中含有目的片段。构建好的重组质粒PCHU2103委托华大基因进行序列测定。测出序列与哈氏菌原基因(SEQ ID NO. 3)进行比对，无碱基错误或移码突变。说明此工程菌可以表达SEQ ID NO. 4所述氨基酸序列的成熟蛋白CHU-2103。5、重组质粒在宿主菌中的表达将含有目的片段的重组质粒转入宿主菌E. coliJM109 (购自Takara公司)中，选取阳性克隆于含氨苄青霉素的液体培养基中过夜培养，次日以2wt%接种量接入新鲜培养基，37°C震荡培养至OD6tltl为0. 4至0. 6之间，加入异丙基硫代P -D-半乳糖苷(IPTG)，终浓度为0. 3mM, 18°C,80rpm低速振荡培养15小时左右，离心收集菌体，制得IPTG诱导的工程菌，然后超声破碎，12000g，离心15min，所得上清进行12%SDS_PAGE，显示有目的蛋白的表达，如图2所示。以此粗酶液，用羧甲基纤维素钠作为底物，以DNS法检测还原糖含量，经粗酶液处理后有还原糖产生，即通过异源表达得到了活性蛋白。6、其他该多功能纤维素酶的表达方法
除了用上述的方法表达该纤维素酶以外，可以采取其他的生物手段进行表达。可以通过将编码该多功能纤维素酶的基因整合至宿主的染色体上，或者是选用其他载体或是宿主细胞，比如其他细菌或是真菌。其他的宿主细胞及载体载有本发明涉及的多功能纤维素酶基因后，同样可以表达、产生本发明所涉及的多功能纤维素蛋白，这样的生物体就变成能表达、生产该多功能纤维素酶的基因工程菌或是基因工程细胞。实施例2 :多功能纤维素酶的纯化将上述IPTG诱导的工程菌离心收集菌体，用超声缓冲液重悬，后超声破碎，所得破碎液，12000g离心15min，得上清，过麦芽糖层析柱，具体操作参见NEB操作手册，即可得到纯化的多功能纤维素酶CHU-2103。实施例3 :重组多功能纤维素酶的性质(I)水解羧甲基纤维素、滤纸、磷酸膨胀纤维素的纤维素酶活以羧甲基纤维素钠盐、滤纸或是磷酸膨胀纤维素作为底物，应用本发明的多功能纤维素酶进行反应，然后通过检测反应体系中生成的还原糖的量来分析纤维素酶的活力，通过HPLC或TLC检测生成还原糖的种类。还原糖的生成量采用DNS法进行测量。蛋白浓度的测定采用考马斯亮蓝检测法。实验测定本发明所涉及的纤维素酶，对羧甲基纤维素钠有较高的水解活力，而对滤纸和磷酸膨胀纤维素的水解活力相对较低。对羧甲基纤维素钠酶解后的产物为一系列大小不一的寡糖，而对滤纸、磷酸膨胀纤维素酶解后的产物主要二糖和三糖，并有少量单糖，说明其兼具纤维素内切酶及纤维素外切酶的活力，结果如图4所示。(2)多功能纤维素酶的最适温度及最适pH以羧甲基纤维素钠为底物，在柠檬酸缓冲体系中，检测温度及pH对其活力的影响。实验测定本发明涉及的多功能纤维素酶的最适反应温度为30°C -36°C，高于45°C时酶活力显著下降，而且最适pH则相对较为宽泛，在5. 5-7. 5之间都具有相对较高的活力，结果如图3所示。(3)金属离子对酶活力的影响测试四种无机离子(Mn2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+)在不同浓度时对本发明所涉及的多功能纤维素酶的纤维素内切酶(以羧甲基纤维素钠为底物)活力的影响，测试温度是30°C，使用的缓冲液是PH6. 8的磷酸缓冲液。结果显示在一定的浓度范围内Ca2+和Zn2+对酶活力有一定的促进作用，而且随浓度增大促进作用增强，而Mn2+和Mg2+对酶活力有一定的抑制作用，随离子浓度增大，抑制作用增强。结果如图5 所示。
权利要求
1.ー种多功能纤维素酶CHU-2103，氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
2.权利要求I所述多功能纤维素酶CHU-2103的表达基因chu_2103，核苷酸序列如SEQID NO. 3 所示。
3.—种重组质粒，插入了如SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列的基因片段。
4.一种重组工程菌株，插入了如SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列的基因片段或权利要求3所述的重组质粒。
5.权利要求I所述多功能纤维素酶CHU-2103、权利要求5所述表达基因chu_2103、权利要求6所述重组质粒或权利要求4所述重组工程菌株在降解纤维素中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种多功能纤维素酶及其表达基因与应用。多功能纤维素酶CHU-2103的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；多功能纤维素酶CHU-2103的表达基因chu_2103的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；本发明所述多功能纤维素酶CHU-2103为一个单结构域的多功能酶，其分子量不足40kD，容易进行异源表达，获得具有纤维素外切酶、纤维素内切酶及糖基转移酶活性的活性蛋白，有效地解决了由于哈氏菌的生长周期比较长，酶成分比较复杂，不容易对纤维素酶直接进行分离纯化的问题。该酶在生物能源、饲料等行业具广泛的应用潜力。
文档编号C12N1/15GK102952790SQ20121043921
公开日2013年3月6日 申请日期2012年11月6日 优先权日2012年11月6日
发明者卢雪梅, 张聪, 季晓飞, 张为灿 申请人:山东大学