针对单增李斯特菌inlB毒力基因的一种快速检测方法
【专利摘要】本发明公开一种针对单增李斯特菌inlB毒力基因的快速检测方法，首次针对毒力基因inlB设计特异引物，将反转录技术与SYBR Green Ⅰ嵌合荧光定量PCR技术相结合，建立了一种快速检测单增李斯特菌的方法，具体包括单增李斯特菌RNA的提取及cDNA的合成、SYBR Green Ⅰ嵌合荧光定量PCR检测建立标准曲线、人工污染样本的验证；食物样本RNA的提取及cDNA的合成、普通SYBR Green Ⅰ嵌合荧光定量PCR法检测验证。检测速度快、特异性高、灵敏度高、检出限低的优点，具有广泛的应用前景。
【专利说明】针对单增李斯特菌i n IB毒力基因的一种快速检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于致病菌基因检测【技术领域】，具体涉及一种单增李斯特菌检测引物以及 利用反转录SYBR Green I嵌合荧光定量PCR技术检测食物中单增李斯特菌的方法。
【背景技术】
[0002] 李斯特氏菌是兼性厌氧的革兰氏阳性杆状菌[1]。其中单核细胞增生李斯特菌 (Listeria monocytogenes，以下简称单增李斯特菌）是唯--种与人类有关系的致病菌， 广泛存在于我们日常生活中的食品中。单增李斯特菌是保证肉制品质量安全的必检项目， 近年来，我国水生生物资源丰富，水产品的出口量也是逐年增加，水产品中单增李斯特菌 的检出率也相对较高。目前在世界的很多国家都发生过因该菌引起的中毒事件。感染该菌 后临床表现多样化，例如肠炎、脑膜炎、流产等，其中对于一些免疫力低下者最易感染。该菌 的致病率远远超过其他食源性细菌，粪便污染食品后经口传播是其主要传播途径，由该菌 引起的疾病称为李斯特菌病。该病发病率不高，该病的临床表现，健康成人个体出现轻微类 似流感的症状。主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增加，死亡率可达20% -30% [2]，尤 其是婴幼儿、老人、孕妇以及免疫功能缺陷者，发病机会更大[3' 4]。其中，在新生儿和免疫力 低下的人中因单增李斯特菌病致死的高达70% [5]。
[0003] 种类多、数量少、难于富集和体外培养是食源性致病菌的特点，也决定它们一直是 微生物检测中的难点和空白点。现有的检测技术如微生物培养和生化鉴定、免疫学技术、 PCR技术等均存在一些问题：常规的生化鉴定方法操作复杂，具体包括富集培养、选择分 离、生理生化和血清学实验。这样的方式需要周期长，准确度受到外界影响因素大；免疫学 技术虽灵敏性高，但易污染，经常出现假阳性现象；PCR技术一般要与凝胶电泳联用，而电 泳结果不能作为最终结论，还需要进行其他探针杂交实验，同时常规PCR容易造成PCR产物 对环境的污染，可能导致假阳性结果的出现，对操作环境要求严格分区。而荧光定量PCR技 术的出现实现了 PCR从定性到定量的飞跃，它具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准 确、速度快、全封闭反应等优点。反转录PCR技术是一种将cDNA合成与PCR技术结合分析基 因表达的快速灵敏的方法，主要用于对表达信息进行检测或定量分析。死的细胞RNA的半 衰期要比DNA的短的多，因此可以选择用RNA作为活细胞指示器。于是将反转录技术与荧 光定量PCR技术相结合，提高检测灵敏度、准确率以及降低假阳性率，使检测过程更高效。
[0004] 致病的毒力基因常成簇状，扎堆形成毒力岛。单增李斯特菌就是含有100个大小 不一样的毒力岛组成，其中单增李斯特菌毒力岛I(LIPI-I)就是毒力基团中心聚集处，位 于此中心位置的毒力基因都发挥自己的功能。单增李斯特菌的内化素岛（LIPI-2)主要参 与诱导粘附、侵袭，是一个基因家族系inlA-inlH。其中最重要的是inlA和inlB，inlA和 inlB是单增李斯特菌中最为重要的内化素蛋白。几乎所有致病性的单增李斯特菌都含有 inlA和inlB。对单增李斯特菌具有鉴别意义[6]。其中，inlB基因属于内化素家族，位于菌 体表面，介导细菌侵入细胞并内化至吞噬小体。inlB基因具有受体特异性与肝细胞生长因 子受体结合，是肝细胞、成纤维细胞、上皮细胞的介导因素等。缺失inlB基因的单增李斯特 菌毒力株的毒力严重下降。
【发明内容】
[0005] 本发明首次针对毒力基因 inlB设计特异引物，将反转录技术与SYBR Green I嵌 合荧光定量PCR技术相结合，建立了一种快速检测单增李斯特菌的方法。死的细胞RNA的 半衰期要比DNA的短的多，因此RNA可以作为活细胞指示器。在RNA水平上检测可以检测 出样品中是否存在单增李斯特菌活菌，使本发明所述方法的实验结果更加准确。具体采用 的方法是通过提取样品细菌总RNA且合成cDNA为模板，继而进行SYBR Green I嵌合荧光 定量PCR扩增，准确率高、高效率、低污染的完成整个过程，具有广泛的应用前景。整个检测 过程可用4. 5h完成，其中人工操作时间不足60min，而用传统方法检测则需要一周的时间 才能完成检测，步骤繁琐，操作时间长，人工量大。
[0006] 本发明的技术方案为：基于单增李斯特菌毒力基因 inlB设计特异性引物，建立反 转录SYBR Green I嵌合荧光定量PCR检测系统，其中包括：单增李斯特菌RNA的提取及 cDNA的合成、SYBR Green I嵌合荧光定量PCR检测建立标准曲线、人工污染样本的验证；食 物样本RNA的提取及cDNA的合成、普通SYBR Green I嵌合荧光定量PCR法检测验证。
[0007] 本发明公开了一对从20对设计引物中筛选出来的检测引物：SEQ ID NO. 1?2。 设计引物过程中，经过NCBI Blast比对后发现单增李斯特菌毒力基因 inlB的部分序列与 其他革兰氏阳性菌毒力基因序列有重合，因此能够选取的序列片段有限且易与其他革兰氏 阳性菌重合，即设计一对特异性强的引物是有难度的，经过多次特异性实验进行筛选，得到 了特异性较强的引物=SEQ ID NO. 1?2,如下表所示。
【权利要求】
1. 一种基于单增李斯特菌特定的毒力基因 inlB设计的特异性引物，所述的引物序列 为：SEQ ID NO. 1 ?2。
2. -种将反转录技术与SYBR Green I嵌合荧光定量PCR技术相结合的快速检测单 增李斯特菌的方法，其特征在于：将待检样品的RNA反转录成cDNA作为模板，再进行SYBR Green I嵌合荧光定量PCR法检测，步骤包括： ①反应体系为25 μ 1,其中： 2 倍浓度的 SYBR? Premix Ex Taq? 丨 2.5 μ L 浓度为 ΙΟμηιοΙ/L 的引物对 SEQ ID Ν0.1 ?2 fr 0.5μ? 灭菌双蒸水 9.5μ? 浓度为200?IOOOng^iL的cDNA模板 2μ? 反应参数：95°C 30s ;95°C 5s，63. 3°C 25s ;72°C 15s ;，80°C 15s，40 个循环；60 ?95°C 建立熔解曲线。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的待检样品的RNA使用经改进后的 天根DP430细菌总RNA提取试剂盒提取，步骤包括： ① 4°C 12000rpm离心2min收集细菌，彻底去除所有培养基上清； ② 加入120 μ L浓度为50mg/mL的溶菌酶，吹散，37°C 30min ; ③ 加入350 μ L裂解液RL，涡旋振荡混匀，70°C lOmin，12000rpm离心2min，将上清液转 移到另一个离心管中；其中，所述的裂解液RL为340μ L RL中加入IOyL β-巯基乙醇； ④ 向步骤③获得的上清液中，加入250 μ L无水乙醇，混匀；将得到的溶液和沉淀一起 转入吸附柱CR3,12000rpm离心lmin，倒掉废液，将吸附柱CR3放回收集管中； ⑤ 向吸附柱CR3加入350 μ L去蛋白液RW1，12000rpm离心lmin，弃废液，将吸附柱CR3 放回收集管中； ⑥ 向步骤⑤的吸附柱CR3中加入80yL DNase I工作液，置于室温15min;其中，所述 的80 μ L DNase I由10 μ L DNase I中加入70 μ L RDD溶液配制而成； @向吸附柱〇?3中再加入35(^1^1^1，离心12000印11111^11，弃废液，将吸附柱放回收 集管中； @向吸附柱〇?3中加入50(^1^1^，室温放置21^11，12000印111离心11^11，倒掉废液； ⑨ 重复步骤⑧； ⑩ 12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CR3置于室温放置4min，以彻底晾干吸附 材料残留的漂洗液； ?加入 20-30 μ L RNase-Free ddH20,室温放置 2min，12000rpm 离心 2min ; ?重复3次步骤(11)。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的将提取样品的RNA反转录成cDNA 的步骤包括： ①反应体系为6yL，其中：模板RNA浓度为200?1000ng/yL ;01igo(dT)Primer 1 μ L;RNase free dH20 ; 反应条件：70°C IOmin ;4°C 2min ;4°C放置 ②以上模板RNA变性溶液 6pL 5XM-MLY BuITcr 2μΙ dNTP Mixture 0.5pL RNasc Inhibitor 0.25μ?, RTasc M-MLV(RNasc H') 0·5μΙ」 RNasc Free dH20 0,75μ? 反应条件：42°C 60min ;70°C 15min ;4°C 2min ;4°C放置。
5.如权利要求2?4中所述的方法在检测食品中单增李斯特菌的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104388567SQ201410708006
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月27日 优先权日:2014年11月27日
【发明者】侯红漫, 桑雪, 张公亮, 孙黎明, 王彦 申请人:大连工业大学