有的酚氯仿法，即分别加入细胞裂解液，蛋白酶K，苯酚，以及氯仿和异戊醇的混合液逐步进行处理，再加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来，而提取到的三组草鱼鱼鳞中基因组DNA样品的电泳图。对比图1和图2，图1中可以明显看出提取到的草鱼鱼鳞中基因组DNA条带虽然不是非常明亮，得率较低，但却清晰、整齐、基本无降解和拖尾现象且完整性较好，蛋白质和RNA污染少。而图2中提取到的草鱼鱼鳞中的基因组DNA不仅弥散于整条跑道，有非常严重的降解现象，且有含有较多的杂质。由此可知，本发明的鱼类总基因组DNA的提取方法以鱼鳞为原料时，提取效果明显优于现有的酚氯仿法。
[0062]图3是采用实施例4的鱼类总基因组DNA的提取方法提取到的三组草鱼肌肉组织中基因组DNA样品的电泳图。图4是采用现有的酚氯仿法提取到的三组草鱼肌肉组织中基因组DNA样品的电泳图。对比图1、图3和图4，图3中提取到的草鱼肌肉组织中的基因组DNA条带明亮、清晰、整齐，得率较高，基本无降解和拖尾现象且完整性较好，明显无蛋白质、RNA等杂质的污染，比图1中提取到的草鱼鱼鳞中的基因组DNA效果更好，原因可能是因为鱼的肌肉组织比鱼鳞片含有更多细胞，所以DNA浓度更高，条带更加明亮。而图4中提取到的草鱼肌肉组织中的基因组DNA条带虽明亮，但含有杂质，且有一定的降解现象。由此可知，本发明的鱼类总基因组DNA的提取方法以肌肉组织为原料时，提取效果略优于现有的酸氯仿法。
[0063]图5是采用实施例1至3的鱼类总基因组DNA的提取方法分别提取到三组草鱼鱼鳞中基因组DNA样品后，以这三组基因组DNA为模板，通过PCR检测得到的草鱼启动子ADARl的电泳图。图6是采用现有的酚氯仿法分别提取到三组草鱼鱼鳞中基因组DNA样品后，以这三组基因组DNA为模板，通过PCR检测得到的草鱼启动子ADARl的电泳图。两者都能够扩增出预期的IlOObp左右的特异性目的条带。对比图5和图6，图5中的草鱼启动子ADARl条带，其条带清晰、明亮，杂带少，说明对于后续PCR检测没有明显干扰，可用于基于PCR的分子生物学技术研究。图6中的草鱼启动子ADARl条带，其条带虽然较明亮，但因其模板含有的杂质较多，会导致后续PCR结果不理想，因此没有使用价值。由此可知，本发明的鱼类总基因组DNA的提取方法以鱼鳞为原料时，提取到的基因组DNA更加完整，可用于后续研究。
[0064]图7是采用实施例4的鱼类总基因组DNA的提取方法分别提取到三组草鱼肌肉组织中基因组DNA样品后，以这三组基因组DNA为模板，通过PCR检测得到的草鱼启动子ADARl的电泳图。图8是采用现有的酚氯仿法分别提取到三组草鱼肌肉组织中基因组DNA样品后，以这三组基因组DNA为模板，通过PCR检测得到的草鱼启动子ADARl的电泳图。两者都能够扩增出预期的IlOObp左右的特异性目的条带。对比图5、图7和图8，图7中的草鱼启动子ADARl条带明亮度和清晰度比图5更高，原因可能是因为鱼的肌肉组织比鱼鳞片含有更多细胞，DNA含量更多，从而使得在PCR过程中的模板浓度更高，效果更好。图8中的草鱼启动子ADARl条带十分明亮，但杂质较多，PCR结果可能不理想。由此可知，本发明的鱼类总基因组DNA的提取方法以肌肉组织为原料时，提取到的基因组DNA更加完整，用于后续研究效果更好。
[0065]显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
【主权项】
1.一种鱼类总基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括以下具体步骤: A.取适量含有DNA的鱼类组织，清净粉碎后放入离心管中； B.向离心管中加入适量的Chelex-1OO溶液，沸水浴15?20min;再加入适量的蛋白酶K溶液，50?60°C水浴3h以上； C.吸取离心管中的液体置于另一个离心管中进行离心分离； D.取上清液置于另一个离心管中，加入适量的RNase溶液，37°C水浴45min以上； E.向离心管中加入适量的Tris饱和酚溶液，混匀后进行离心分离，并取上清液置于另一个离心管中；此步骤进行I?3次； F.向离心管中加入适量的氯仿和异戊醇混合液，混匀后进行离心分离，并取上层溶液置于另一个离心管中；此步骤进行I?3次；氯仿和异戊醇混合液是氯仿与异戊醇按体积比为24:1混合而成; G.向离心管中加入适量的乙醇溶液，4°C放置Ih以上，使得DNA沉淀； H.对离心管进行离心分离，弃上清液； 1.向离心管中加入适量的乙醇溶液，进行离心分离，弃上清液；此步骤进行I?3次； J.去除乙醇后，加入适量的无菌水将DNA溶解，-20°C保存备用。2.根据权利要求1所述的鱼类总基因组DNA的提取方法，其特征在于:所述Chelex-1OO溶液的浓度为5%，所述蛋白酶K溶液的浓度为20mg/mL，所述RNase溶液的浓度为 5mg/mL。3.根据权利要求2所述的鱼类总基因组DNA的提取方法，其特征在于:所述每0.2g鱼鳞使用Chelex-1OO溶液的体积为300?700 μ L，蛋白酶K溶液的体积为20?40 μ L，RNase溶液的体积为5?8 μ L ;每次加入离心管中Tris饱和酚溶液的体积与该离心管中液体体积相同，每次加入离心管中氯仿和异戊醇混合液的体积与该离心管中液体体积相同。4.根据权利要求3所述的鱼类总基因组DNA的提取方法，其特征在于:所述步骤G向离心管中加入的乙醇溶液是预冷的浓度为95%以上的乙醇溶液，加入量是该离心管中液体体积的2?3倍。5.根据权利要求1所述的鱼类总基因组DNA的提取方法，其特征在于:所述将离心管中的液体混勾是将离心管颠倒混勾5?lOmin。6.根据权利要求1所述的鱼类总基因组DNA的提取方法，其特征在于:所述步骤J中去除乙醇是将离心管进行离心分离后，抽出底部的乙醇，放在滤纸上置于无菌工作台上吹风，直至将乙醇除尽。7.根据权利要求1所述的鱼类总基因组DNA的提取方法，其特征在于:所述J中加入的无菌水温度为65°C ;所述步骤I中加入的乙醇溶液是浓度为70%的乙醇溶液。8.根据权利要求1?7中任一项所述的鱼类总基因组DNA的提取方法，其特征在于:所述含有DNA的鱼类组织是鱼鳞；所述鱼鳞是取自活鱼的新鲜鱼鳞，或者是浸泡于浓度为70%以上的乙醇中的鱼鳞。9.根据权利要求1?7中任一项所述的鱼类总基因组DNA的提取方法，其特征在于:所述含有DNA的鱼类组织是肌肉组织、血液或鱼鳍。10.根据权利要求1?7中任一项所述的鱼类总基因组DNA的提取方法，其特征在于:所述离心分离时的温度为4°C，离心转速为12000rpm，离心时间为5?15min。
【专利摘要】本发明涉及一种鱼类总基因组DNA的提取方法，包括以下具体步骤：A.取含有DNA的鱼类组织，清净粉碎放入离心管中；B.加入Chelex-100溶液，沸水浴15～20min；加入蛋白酶K溶液，50～60℃水浴3h以上；C.吸取离心管中的液体置于另一个离心管中进行离心分离；D.取上清液，加入RNase溶液，37℃水浴45min以上；E.加入Tris饱和酚溶液，混匀后进行离心分离，取上清液；F.加入适量的氯仿和异戊醇混合液，混匀后进行离心分离，取上层溶液；G.加入乙醇，放置1h以上；H.离心分离，弃上清液；I.加入乙醇，进行离心分离，弃上清液；J.去除乙醇后，加入无菌水，保存备用。本发明的提取方法试剂方便易取，提取DNA效果好，DNA完整度高，尤其可以以鱼鳞为原材料进行提取，不受样品量限制。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN105039308
【申请号】CN201510406907
【发明人】毛慧玲, 胡成钰, 方春林, 万正义, 龚瑞玥, 王芳
【申请人】南昌大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月13日