一种亚麻悬浮细胞诱变育种的方法
【技术领域】
[0001]一种亚麻悬浮细胞诱变育种的方法，是细胞工程在植物育种领域中的应用技术，涉及植物细胞工程育种技术领域。
【背景技术】
[0002]植物育种技术被应用于农作物品种改良、中草药材有效成分提高、林果品种改良、观赏花草育种、经济植物如芳香植物及抗菌植物等方面的育种生产中。目前应用最广的是杂交育种技术，该技术十分成熟，历史悠久。随着生命科学与技术的发展与进步，基因育种、细胞工程育种、太空育种等技术也从实验室研究逐步走向实际应用，并取得了传统育种技术难以实现的育种效果，具有良好的发展前景。
【发明内容】
[0003]一种亚麻悬浮细胞诱变育种的方法，是采用悬浮的亚麻胚性单细胞和小细胞团作为诱变对象，用EMS、紫外线、离子束类物理、化学等诱变剂作用于它们，诱导其发生突变，然后在特殊设定胁迫环境下筛选发生特性突变的细胞或细胞团，再经细胞培养技术，获得突变的胚性细胞系，经再分化成苗，试管苗经扩繁培育成具有特殊性状的亚麻种质。
[0004]该技术鉴于悬浮细胞多为单细胞起源，受胁迫的选择压力均一，易获得较高的定向突变细胞系，且能大大减少嵌合体的形成，是直接获得同质突变体的理想技术方法；
具体技术方案如下。
[0005]1、亚麻种子萌发
选择饱满、完整、大小均匀的亚麻种子，用10% (过氧化氢)H2O2振摇浸泡种子lOmin，用无菌长勺将种子捞出，不经冲洗直接接入无激素的MS基本固体培养基上，在培养温度为21±3°C、光照周期为14h光/d、光照强度为1500_2500Lux的条件(下述的培养条件相同)下培养7-8天，种子萌发成2-4cm高的无菌苗。
[0006]2、建立纤维亚麻胚性细胞悬浮系
以亚麻无菌苗的下胚轴段(I一 1.5cm长)为材，在I号固体培养基[MB (NH4NO3减半而KNO3加倍的 MS) +0.5mg/LBA+0.5mg/LNAA+3% 蔗糖 +0.7% 琼脂]上培养 30— 45 天，得到愈伤细胞团。转入2号固体培养基[MB+0.5mg/L BA+0.5mg/L KT+3%蔗糖+0.7%琼脂]上培养30天，得到浅黄色结构较松散的愈伤细胞团。
[0007]将细胞团转入3号液体培养基[MB+0.2mg/L BA+5%蔗糖]中，900rpm摇床上暗培养，每隔6天换培养基一次，4次换液后，在净化工作台上挑弃肉眼可见的细胞团，采用滴片镜检，保留细胞形状较均匀，多球形，分裂旺盛，内含物丰富的培养物。再换4次液后，调整细胞密度为1.2—1.5g鲜重/25ml，再培养12天后得到胚性细胞系。
[0008]3、诱变
在净化台上将胚性细胞移入无菌的离心管，加盖，lOOOrpm，离心I min，吸弃上清，用含
0.1% (甲基磺酸乙酯)EMS的3号培养基悬浮，倒入广口培养瓶，在900rpm摇床上处理6h，然后转入无菌离心管，100rpm离心I min，吸弃上清，同法洗3次，收集细胞。
[0009]4、特定环境下胁迫
4.1例如用含150mmol/L (氯化钠)NaCl的3号培养基悬浮细胞，倒入广口培养瓶，封口后在900rpm摇床上暗培养12h，无菌条件下将细胞悬液倒入离心管，封口，100rpm离心Imin，吸弃上清，用正常3号培养基悬浮细胞，移入广口培养瓶，封口，在900rpm摇床上培养6天，在净化台上静置，吸弃培养液。
[0010]4.2例如用含10mmol/L (碳酸氢钠)NaHCOj^ 3号培养基悬浮细胞，倒入广口培养瓶，封口后在900rpm摇床上暗培养12h，无菌条件下将细胞悬液倒入离心管，封口，100rpm离心Imin，吸弃上清，用正常3号培养基悬浮细胞，移入广口培养瓶，封口，在900rpm摇床上培养6天，在净化台上静置，吸弃培养液。
[0011]4.3例如用含24.5mmol/L (聚乙二醇)PEG (渗透压相当于添加100mmol/L NaCl)的3号培养基悬浮细胞，倒入广口培养瓶，封口后在900rpm摇床上暗培养12h，无菌条件下将细胞悬液倒入离心管，封口，100rpm离心lmin，吸弃上清，用正常3号培养基悬浮细胞，移入广口培养瓶，封口，在900rpm摇床上培养6天，在净化台上静置，吸弃培养液。
[0012]5、筛选
无菌条件下用无菌长勺将细胞移至盛有4号培养基[MB+0.02mg/L 2.4-D+0.2mg/LBA+5%蔗糖+0.7%琼脂]的培养瓶中，在其表面均匀地铺一薄层，封口，在1200— 1500LUX光强度，1h光/14h暗的光周期，220C±20C的条件下培养I个月。
[0013]6、培养
挑出新生长的小细胞团，转入新鲜4号培养基上，单克隆培养，30天转瓶一次，培养90天。
[0014]7、复筛
用无菌长勺将细胞团移至特定环境(含同上浓度盐或碱或聚乙二醇)的4号固体培养基上培养15天，进一步筛选突变细胞系。
[0015]8、再培养
用无菌长勺将细胞团移至正常的4号固体培养基上平铺培养90天(每30天更换培养基一次)。
[0016]9、再分化成苗
用无菌镊子将细胞团转入5号培养基[MB+0.02mg/L KT+0.005mg/L NAA+0.5ug/LTDZ+4% 蔗糖 +3.3% 植物凝集胶]或 6 号培养基[MB+0.02mg/L KT+0.02mg/L IAA+0.2ug/LTDZ+4%蔗糖+3.3%植物凝集胶]中培养20天，转入除去TDZ的5号或6号培养基上继续培养60天(30天转瓶一次)，可见到少量不定芽。保留少量不定芽基部的愈伤组织，从愈伤团块上切下，将芽转入7号培养基[MB+0.05mg/L BA+3%蔗糖+3.5%植物凝胶]上，使其继续长高并生根，形成试管苗(约60天)。
[0017]10、获得再生植株
试管苗经敞口炼苗5-7天后，轻轻用流水洗去根部的培养基，移栽入灭过菌的花盆湿土(蛭石:珍珠岩:泥土 =1:1:2)中，以塑料袋罩住，一周后，剪开塑料袋顶部，一月后去掉塑料袋，植株成活后移栽至花盆中养殖，经炼苗后，移栽到大田中繁殖。具体实施例
[0018]具体实施例1.耐盐的双亚5号亚麻种质的选育:
1.1种子萌发:选择饱满、完整、大小均匀的亚麻种子，用10% (过氧化氢姐202振摇浸泡种子lOmin，用无菌长勺将种子捞出，不经冲洗直接接入无激素的MS基本固体培养基上，在培养温度为21±3°C、光照周期为14h光/d、光照强度为1500-2500Lux的条件(下述的培养条件相同)下培养7-8天，种子萌发成2-4cm高的无菌苗。
[0019]1.2建立胚性细胞悬浮系:以亚麻无菌苗的下胚轴段(I一 1.5cm长)为材，在I号固体培养基[MB (NH4NO3减半而 KNO 3加倍的 MS)+0.5mg/LBA+0.5mg/LNAA+3% 蔗糖 +0.7% 琼脂]上培养30— 45天，得到愈伤细胞团。转入2号固体培养基[MB+0.5mg/L BA+0.5mg/LKT+3%蔗糖+0.7%琼脂]上培养30天，得到浅黄色结构较松散的愈伤细胞团。
[0020]将细胞团转入3号液体培养基[MB+0.2mg/L BA+5%蔗糖]中，900rpm摇床上暗培养，每隔6天换培养基一次，4次换液后，在净化工作台上挑弃肉眼可见的细胞团，采用滴片镜检，保留细胞形状较均匀，多球形，分裂旺盛，内含物丰富的培养物。再换4次液后，调整细胞密度为1.2—1.5g鲜重/25ml，再培养12天后得到胚性细胞系。
[0021]1.3 EMS诱变:在净化台上将胚性细胞移入无菌的离心管，加盖，lOOOrpm，离心I min，吸弃上清，用含0.1% (甲基磺酸乙酯)EMS的3号培养基悬浮，倒入广口培养瓶，在900rpm摇床上处理6h，然后转入无菌离心管，100rpm离心I min，吸弃上清，同法洗3次，收集细胞。
[0022]1.4盐胁迫:用含150mmol/L (氯化钠)NaCl的3号培养基悬浮细胞，倒入广口培养瓶，封口后在900rpm摇床上暗培养12h，无菌条件下将细胞悬液倒入离心管，封口，100rpm离心lmin，吸弃上清，用正常3号培养基悬浮细胞，移入广口培养瓶，封口，在900rpm摇床上培养6天，在净化台上静置，吸弃培养液。
[0023]1.5筛选:无菌条件下用无菌长勺将细胞移至盛有4号培养基[MB+0.02mg/L2.4-D+0.2mg/L BA+5%蔗糖+0.7%琼脂]的培养瓶中，在其表面均匀地铺一薄层，封口，在1200— 1500Lux光强度，1h光/14h暗的光周期，220C±20C的条件下培养I个月。
[0024]1.6培养:挑出新生长的小细胞团，转入新鲜4号培养基上，单克隆培养，30天转瓶一次，培养90天。
[0025]1.7复筛:用无菌长勺将细胞团移至含150mmol/L (氯化钠)NaCl的4号固体培养基上培养15天，进一步筛选突变细胞系。
[0026]1.8再培养:用无菌长勺将细胞团移至正常的4号固体培养基上平铺培养90天(每30天更换培养基一次)。
[0027]1.9再分化成苗、获得再生植株:用无菌镊子将细胞团转入5号培养基[MB+0.02mg/L KT+0.005mg/L NAA+0.5ug/L TDZ+4% 蔗糖+3.3% 植物凝集胶]或 6 号培养基[MB+0.02mg/L KT+0.02mg/L IAA+0.2ug/L TDZ+4% 蔗糖+3.3% 植物凝集胶]中培养 20 天，转入除去TDZ的5号或6号培养基上继续培养60天(30天转瓶一次)，可见到少量不定芽。保留少量不定芽基部的愈伤组织，从愈伤团块上切下，将芽转入7号培养基[MB+0.05mg/LBA+3%蔗糖+3.5%植物凝胶]上，使其继续长高并生根，形成试管苗(约60天)。试管苗经敞口炼苗5-7天后，轻轻用流水洗去根部的培养基，移栽入灭过菌的花盆湿土(蛭石:珍珠岩:泥土 =1:1:2)中，以塑料袋罩住，一周后，剪开塑料袋顶部，一月后去掉塑料袋，植株成活后移栽至花盆中养殖，经炼苗后，移栽到大田中繁殖。
[0028]
具体实施例2.耐碱的范妮亚麻种质的选育:
2.1种子萌发:选择饱满、完整、大小均匀的亚麻种子，用10% (过氧化氢)H2O2振摇浸泡种子lOmin，用无菌长勺将种子捞出，不经冲洗直接接入无激素的MS基本固体培养基上，在培养温度为21±3°C、光照周期为14h光/d、光照强度为1500-2500LUX的条件(下述的培养条件相同)下培养7-8天，种子萌发成2-4cm高的无菌苗。
[0029]2.2建立胚性细胞悬浮系